一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液及其试剂盒

摘要

本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液及其试剂盒，所述PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween20、甲酰胺。所述血液直接荧光PCR试剂盒，包括用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。该用于血液直接荧光PCR扩增的反应液可将未经提取、纯化处理的血液样本直接用于PCR扩增，从而避免了提取过程中的核酸损失和有毒试剂的使用，使得血液荧光PCR省时、简单方便、成本低廉且扩增效率高。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于血液直接荧光PCR扩增 的反应液及其试剂盒。

背景技术

近年来，随着生物、医学、法医学等各相关领域的发展，荧光PCR技术得 到了越来越广泛的应用。特别是对于血液遗传病，感染性病毒及疾病和遗传背 景分析，荧光PCR技术已经成为不可或缺的基本技术。而血液作为一种重要的 生物分析样本,其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂 肪等。因此，基于现有技术，无法实现荧光PCR方法直接对血液中的核酸进行 扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从血液中对核酸 物质进行纯化处理。目前血液基因组提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、柱提取 法和磁珠法。尽管具体的提取方式不一样，但是都包括以下三个过程：一是破 裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三 是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过 程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉 污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增失败的可能。此外，由于提取过程 耗时长，成本高，且需借助苯酚等有害试剂，增加了操作者感染的风险，且难 以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够 作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩增效率高、成本低的用于血液直接荧光PCR 扩增的反应液，旨在解决现有技术对血液进行PCR扩增时，需要预先对血液进 行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且增加了交叉污染以及有毒试 剂使用的问题。

本发明的另一目的在于提供一种血液直接荧光PCR试剂盒。

本发明是这样实现的，一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述 PCR反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween20、甲酰胺。

以及，一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括上述用于血液直接荧光PCR 扩增的反应液。

本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，通过对PCR 反应液中进行合理配制，添加了特异的协同组分，使血液中的血红素、蛋白质 和脂肪等DNA聚合酶抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用；同 时，促进DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增能直接以血液为模版、在抗血 液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。 所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液的使用，省去了对血液样本进行荧光 PCR扩增时进行核酸提取纯化的步骤，避免了核酸的损失，显著提高了荧光PCR 扩增的效率和成功率；同时，避免了核酸提取纯化中交叉污染的可能和有毒试 剂的使用，复合环保理念。

附图说明

图1是本发明提供的1份人血液样本在不同寡肽浓度的PCR反应液的扩增 荧光扩增曲线图；

图2是本发明提供的1份人血液样本在不同dNTP浓度的PCR反应液的扩 增荧光扩增曲线图；

图3是本发明提供的1份人血液样本在不同Brij-58浓度的PCR反应液的 扩增荧光扩增曲线图；

图4是本发明提供的1份人血液样本在不同Tween20浓度的PCR反应液 的扩增荧光扩增曲线图；

图5是本发明提供的1份人血液样本在不同甲酰胺浓度的PCR反应液的扩 增荧光扩增曲线图；

图6是本发明实施例1提供的10份不同来源的人血液样本的进行平行PCR 的扩增荧光扩增曲线图；

图7是本发明实施例1提供的第1份人血液样本进行三次平行实验的荧光 扩增曲线图；

图8是本发明实施例1提供的第2份人血液样本进行三次平行实验的荧光 扩增曲线图；

图9是本发明实施例1提供的第3份人血液样本进行三次平行实验的荧光 扩增曲线图；

图10是本发明实施例2和对比例1分别提供的PCR反应液对10份不同来 源的血液样本进行平行PCR扩增的荧光扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以 下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述 的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了攻克血液荧光PCR扩增时需对血液样本进行核酸提取、以及血液内含 物严重抑制DNA聚合酶活性的血液抑制物问题，发明人意在开发一种避开核 酸提取步骤、直接用血液样本进行荧光PCR扩增的方法-即以全血作为模板直 接扩增目的基因的血液直接荧光PCR扩增法。该方法主要依赖于选择合适的 PCR反应液来实现，具体的，如何研发一种针对血液抑制物及增强DNA聚合 酶酶活性的PCR反应液成为了本课题亟待解决的问题。本发明实施例发明人立 足于使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等物质变性，同时又能促进DNA聚合 酶活性、且对PCR扩增效率无影响、对操作者安全，通过反复的分析研究、经 过多次试验，研究出了本发明实施例用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。

本发明实施例提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述PCR 反应液中含有下列组分：寡肽、Brij-58、Tween20、甲酰胺。其中，所述寡肽 能结合DNA聚合酶，在PCR反应中起保护作用，使所述DNA聚合酶的酶活 性不下降；所述Brij-58和所述Tween20都是非离子去污剂，两者共同使用能 够增加血液细胞的通透性，通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连 接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中；所述甲酰胺也能分离蛋白质 -DNA复合物并使蛋白变性和释放，同时提高PCR反应的特异性。

本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液中，所述寡肽组 分能保护DNA聚合酶的酶活性，所述Brij-58和Tween20组分能增加细胞的通 透性，破坏膜结构和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和 脂肪等抑制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用，所述甲酰胺组分除 了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放外，还能提高PCR反应的特 异性，此外还能够促进DNA聚合酶活性的活性，使得荧光PCR扩增能避开核 酸提取纯化过程，直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合 酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。因此，不仅简化了荧光PCR扩 增的步骤，节省了操作时间，同时降低成本、避免样本间的交叉污染和减小了 操作者感染的风险，实现高效率、高成功率扩增检测的目的。

作为优选实施例，所述寡肽为六肽，所述六肽的组成形式为 AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆，本发明实施例提供的所述六肽，由于具有相对确 定的肽长和结构，对保护DNA聚合酶的酶活性明显优于其他寡肽，其血液扩 增效果好。作为进一步优选实施例，通过发明人反复研究发现，所述的PCR反 应液中的寡肽为Ser-Phe-Lys-Arg-Gly-Thr时，其特定的空间结构、基团等，对 保护DNA聚合酶的酶活性具有最佳效果。

作为一个优选实施例，所述寡肽的浓度为3-20mg/ml，所述寡肽浓度过高， 会影响DNA聚合酶的酶活性，从而抑制PCR反应，如图1所示，从左至右寡 肽的浓度分别为18mg/ml、12mg/ml、6mg/ml和24mg/ml的4条扩增曲线； 所述寡肽浓度过高，则起不到保护DNA聚合酶的作用。以所述PCR反应液的 总重为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.05-5％、 Tween20：0.5-0.8％、甲酰胺：2-10％，在该浓度下，3组分能破坏血液细胞膜， 使血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，浓度过低，变性不彻底，浓度过高， Brij-58、Tween20和甲酰胺都会对PCR反应起抑制作用，如图2为从左至右 Brij-58浓度分别为0.3％、0.1％和0.6％的3条扩增曲线；如图3为从左至右Tween 20浓度分别为0.7％、0.5％和0.9％的3条扩增曲线；如图4为从左至右甲酰胺 浓度分别为2％、6％和10％的3条扩增曲线。

进一步地，所述寡肽的浓度为14-16mg/ml。以所述PCR反应液的总重为 100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.2-0.4％、Tween20： 0.7-0.8％、甲酰胺：2-4％。

作为最优实施例，所述寡肽的浓度为15mg/ml，以所述PCR反应液的总重 为100％计，所述PCR反应液中下列各组分的组成为：Brij-58：0.25％、Tween20： 0.8％、甲酰胺：3％。

作为本发明另一个实施例，所述PCR反应液中还包括下述组分：Tris-HCl、 硫酸铵、氯化镁、dNTPs。其中，所述Tris-HCl能提供一个稳定的反应环境； 所述硫酸铵中的NH₄⁺在高温条件下可以生成NH₃和H⁺，所述NH₃有生成氢键 的条件，可以破坏非特异退火的引物和模板间的不稳定氢键，提高了退火的特 异性；所述氯化镁的Mg²⁺为DNA聚合酶的辅助因子，增加Taq酶活性，提高 扩增效率；所述dNTPs为PCR反应DNA链的合成提高原材料。优选的，下列 各组分的浓度分别为：Tris-HCl：10-50mmol/L，pH9.1；硫酸铵：10-50mmol/L； 氯化镁：2-5mmol/L；dNTPs：100-600μmol/L。

本发明实施例中，所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为： dATP:dCTP:dGTP:dTTP＝1:1:1:1:1，所述dNTPs的浓度优选为300-600μmol/L， 四种所述dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合 酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。在PCR反体系中所述dNTP终 浓度过高会抑制Taq酶的活性，并且易产生错误掺入，使用低浓度所述dNTP 可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，而浓度太低，则会降低反 应物的产量，如图2所示，3条扩增曲线从左至右dNTPs浓度分别为350μmol/L、 450μmol/L和550μmol/L，实验结果显示dNTP浓度为350μmol/L最优。进一步 的，所述dNTPs的浓度优选为350μmol/L。

作为进一步优选实施例，所述PCR反应液中下述组分的浓度为：Tris-HCl： 15-25mmol/L，pH9.1、硫酸铵：20-30mmol/L、氯化镁：3.5-4.0mmol/L和dNTPs： 320-370μmol/L。

作为本发明一个优选实施例，所述血液直接荧光PCR反应液包括Tris-HCl： 20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、dNTPs：350μmol/L、 寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％。

作为本发明另一个优选实施例，所述血液直接荧光PCR反应液包括 Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.5mmol/L、dNTPs： 330μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20：0.8％。

本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，通过添加特定 的添加剂，可促使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等DNA聚合酶抑制物变性， 同时提高DNA聚合酶活性，使得荧光PCR扩增能直接以血液为模版、在抗血 液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。 从而省去了血液样本中核酸提取纯化的步骤，不需进行除蛋白、乙醇沉淀、白 血细胞分离步骤，避免了苯酚等有害试剂的使用，即可快速、高效地释放基因 组DNA，降低了血液荧光PCR扩增成本。

相应地，本发明实施例还提供了一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括任一 所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。

使用本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液制成的血 液直接荧光PCR试剂盒，进行荧光PCR扩增时，省时、简单方便、成本低廉 且扩增效率高。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，包括如下浓度或含量的下列组 分：Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、 dNTPs：350μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20： 0.8％、上下游引物：200nM、探针：200nM，及DNA聚合酶。

将所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液对外周血样本中管家基因 GAPDH进行荧光PCR扩增，方法如下：在八联管的每个反应孔中加入上述荧 光PCR反应液，然后在每个反应管中加入1μl的血液，在型号为ABI7500的 荧光PCR仪中进行扩增检测。所述荧光PCR扩增程序如下：

第一步骤：95℃，10min，循环1次；

第二步骤：95℃，15s；60℃，45s；循环5次，不收集荧光；

第三步骤：95℃，15s；60℃，45s；循环40次，收集荧光。

使用本发明实施例1提供的血液直接荧光PCR扩增的反应液对10份不同 来源的人血液样本中的管家基因GAPDH进行荧光PCR扩增检测，结果如图6 所示，所有反应孔的背景信号好、CT值都在20-23之间、各荧光PCR扩增曲 线拐点和基线期、指数扩增期、线性扩增期和平台期明显即扩增曲线呈典型的 S型，说明本发明实施例提供的血液直接荧光PCR扩增反应液使血液抑制物变 性、从而使得PCR过程中未经处理的血液样本干扰作用小，所述PCR扩增反 应液适用范围广。

分别将三份不同来源的人血液样本进行荧光PCR扩增检测，每份样本平行 三次，结果分别如图7、图8、图9所示，由图可见，每个样本的平行实验，其 曲CT值都很接近。表明本发明实施例提供的血液直接荧光PCR扩增反应液具 有可靠的重复性。

实施例2

一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，包括如下浓度或含量的下列组 分：Tris-HCl：20mmol/L，pH9.1、硫酸铵：25mmol/L、氯化镁：3.7mmol/L、 dNTPs：300μmol/L、寡肽：15mg/ml、Brij-58：0.25％、甲酰胺：3％、Tween20： 0.8％、上下游引物：200nM、探针：200nM，及DNA聚合酶。将所述用于血液 直接荧光PCR扩增的反应液对10份不同来源的血液样本进行荧光PCR扩增检 测，方法如下：在八联管的每个反应孔中加入上述荧光PCR反应液，然后在每 个反应管中加入1μl的血液，在型号为ABI7500的荧光PCR仪中进行扩增检 测。

对比例1

使用市场中相似产品VitaNavi公司的DirectBloodPCRKit对10份不同来 源的血液样本进行荧光PCR扩增检测，具体操作过程如下：往八联管的每个孔 中加入23μl的PCRMix反应液，然后再取1μlDNA聚合酶加入到PCR反应液 中，最后在这PCR反应系统中加入1μl全血。于ABI7500的荧光PCR仪中进 行扩增检测。

实施例2和对比例1提供的PCR反应液对10份不同来源的血液样本进行 平行PCR扩增的荧光扩增曲线图如图10所示，其中，靠近前面的10条曲线是 本发明实施例2的实验结果，后10条曲线是对比例1的实验结果。实验结果显 示本发明实施例2荧光扩增曲线图的扩增曲线拐点和基线期、指数扩增期、线 性扩增期和平台期明显，且CT值明显比对照产品小。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。