用EMS诱导‘Hort 16A’后代优株变异及AFLP检测方法

摘要

用EMS诱导‘Hort？16A’后代优株变异及AFLP检测方法，涉及猕猴桃育种及鉴定方法。本发明将EMS直接加入培养基的方法对猕猴桃进行诱导，其中0.08mg/L浓度对胚性愈伤组织的诱导效果较为显著。在AFLP中研究了PCR扩增所需酶用量、酶切时间和酶活性对酶切的影响；分析了酶活性和能量对连接引物的影响；在选择性扩增体系中筛选出适当的引物组合作为DNA预扩增后选择性扩增的引物，方便选择扩增多态性DNA和提高反映其片断长度多态性的可靠性，可达到一次检测诱导产生的突变体DNA水平的微小差异的目的。

说明书

技术领域

本发明属于植物育种及鉴定方法，特别是猕猴桃育种及鉴定方法。

背景技术

猕猴桃(kiwifruit)，属猕猴科猕猴桃属(Actinidiacea，Actinidiaspp.)，为多年生落叶藤本植物，雌雄异株。猕猴桃是人工驯化栽培野生果树的树种，通过人为诱导猕猴桃变异突变可以产生自然界原来没有的或常规方法难以获得的新风味或新性状的品种。但对于EMS处理猕猴桃变异育种的研究的报道较少。文献1（龙自立，猕猴桃离体再生与变异诱导的研究[D].:浙江大学，2008.）是用EMS处理猕猴桃愈伤组织诱导其不定梢变异；文献2（周立名、王飞、王佳，EMS诱变处理定向筛选猕猴桃耐盐突变体研究[J].西北农业学报,2009,18(5):330-335.）是用EMS对海沃德和红阳猕猴桃叶片进行处理，筛选其耐盐突变体。但两者都是单独用EMS对愈伤组织浸泡较长时间后，再移入培养基对猕猴桃进行诱导，所需时间较长。

绝大部分情况下，变异是不定向的，对变异的植株进行检测，有助于了解变异性状。AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)即扩增片段的长度多志性标记是一种基于DNA多态性的分子标记技术，具有DNA用样量少，多态性检测灵敏度高，稳定性好、谱带丰富等特点。但由于PCR扩增所需酶用量、酶切时间与酶的活性相关，有必要研究这些因素对酶切结果的影响；又由于连接引物需要酶的活性和能量，因此，分析其因素对连接效果的影响也是必要的。而且，AFLP引物包括5′端的与人工接头序列互补的核心序列CORE、限制性内切酶特定序列ENZ和3′端的带有选择性碱基的粘性末段EXT三部分，选择性扩增引物是指3′端的带有特定选择性碱基的粘性末段的引物。选择性扩增体系是AFLP预扩增体系之后的重要步骤，在该体系中，筛选适当的引物组合，可以方便随机扩增多态性DNA和提高反映其片断长度多态性的可靠性，达到一次鉴定检测出诱导产生的突变体DNA水平上的微小差异的目的。

发明内容

本发明旨在以中华猕猴桃‘hort16A’后代优株为材料，对猕猴桃进行EMS诱变处理，并通过改善AFLP体系对诱变处理后的猕猴桃DNA性状进行研究和分析，提供适合猕猴桃DNA多态性的分子标记的检测方法。

一、用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异的方法

包括以下步骤：

（1）诱变剂培养基的配制

猕猴桃诱变剂培养基为：MS+（0.01～0.09mg/L）EMS+0.3mg/LZT+0.05g/LNAA+30g/LSucrose+5g/LAgar，以上EMS过滤灭菌加入，调pH至5.8，以该愈伤组织培养基作为诱变剂培养基；

（2）诱变处理

取无菌猕猴桃叶片，沿脉切成块状接种于诱变剂培养基上，24～26℃、避光培养1个月，待不定芽分化后，接种于不定芽增殖培养基：MS+1.5mg/LZT+0.08mg/LEMS+30g/LSucrose+5g/LAgar，24～26℃，光照强度3000～5000lx，光周期16h/d条件培养；

待芽逐渐长大形成苗，将苗接种于生根培养基：1/2MS+0.7mg/LIBA+0.5g/LAC+30g/LSucrose+5g/LAgar，24～26℃，光照强度3000～5000lx，光周期16h/d条件培养。

所述的用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异的方法中，步骤（1）诱变剂培养基的EMS浓度为0.08mg/L。

二、用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异的AFLP检测方法

包括以下步骤：

（1）猕猴桃总DNA的提取及电泳检测：

提取猕猴桃DNA，取DNA溶液5μL用1.0%琼脂糖凝胶电泳后检测DNA的纯度及浓度；

（2）猕猴桃AFLP酶切反应中，采用20μl体系：

300ngDNA，

1UEcoRI/MseI，

4μlBuffer，

其余为ddH₂O；

反应程序为37℃酶切4h；65℃，20min；4℃，保存；

（3）在猕猴桃AFLP连接反应中，采用20ul反应体系：

5μlDNA酶切产物，

2μlT4buffer，

2UT4DNA连接酶，

1μl接头引物，引物浓度为100nM，

2μlATP，引物浓度为10mM，

其余为ddH₂O；

连接程序为：22℃，过夜；65℃，10min；4℃保存；

（4）在猕猴桃AFLP预扩增体系中，采用25μl反应体系：

2μl连接产物，

0.125μlTaq酶，

0.5μldNTPs，

2.5μlbuffer，

1μl预扩增引物，包括EcoRIPre:5'GACTGCGTACCAATTCA3'和MseIPre:5'GATGAGTCCTGAGTAAC3'，浓度为50ng/μl，

其余为ddH₂O；

将配好的预扩增体系放入PCR仪中，反应参数为：94℃、90s，94℃、30s，56℃、1min，72℃、1min，各30循环；72℃，10min，-20℃保存备用；

（5）在猕猴桃选择性扩增体系中，采用25μl反应体系：

2μl稀释后的预扩增产物，

1μlEcoRI选择性扩增引物，

1μlMseI选择性扩增引物，

0.5μldNTPs，

2.5μlbuffer，

0.25μlTaq酶，

1:10稀释的2μl预扩增产物，

其余为ddH2O；

所述选择性扩增引物由E-ACG+M-CTG、E-ACG+M-CAG、E-AAG+M-CAA、E-AAG+M-CTG、E-ACT+M-CAG、E-ACG+M-CAA、E-AGG+M-CAG和E-AGG+M-CAT共8对引物所组合；

反应程序为：94℃、2min，94℃、30s，65℃、30s，72℃、80s，各14循环，退火温度每循环递减0.7℃；94℃、30s，55℃、30s，72℃、80s，各23循环；72℃，5min；

（6）分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术分离和显示AFLP的扩增产物。

本发明具有的显著进步和实质性特征是：

本发明将EMS直接加入培养基的方法对猕猴桃进行诱导，保证猕猴桃叶片胚性愈伤组织能够充分受到EMS影响，其中，0.08mg/L浓度时对胚性愈伤组织的诱导性状变异效果较为显著，对于提高猕猴桃性状的变异率提供了保证。

本发明在AFLP中研究了PCR扩增所需酶用量、酶切时间与酶的活性这些因素对酶切结果的影响；分析了酶的活性和能量对连接引物效果的影响。而且，把选择性扩增体系作为重要步骤，在选择性扩增体系中，经过反复多次对64对引物进行筛选，筛选出适当的引物组合：E-ACG+M-CTG、E-ACG+M-CAG、E-AAG+M-CAA、E-AAG+M-CTG、E-ACT+M-CAG、E-ACG+M-CAA、E-AGG+M-CAG和E-AGG+M-CAT，作为选择性扩增DNA预扩增之后其片断的3′端的带有特定选择性碱基的粘性末段的引物，因而方便随机扩增多态性DNA和提高反映其片断长度多态性的可靠性，具有扩增位点较多、带型质量好、分辨率较高、条带疏密合适、分布均匀等特点可以达到一次鉴定检测出诱导产生的突变体DNA水平上的微小差异的目的。AFLP图谱中，变异猕猴桃基因组DNA的差异性条带多，而正常猕猴桃基因组DNA的条带清晰且相同引物各条带较为统一。

如图7所示，本发明选取性状变异的猕猴桃基因组DNA与未变异猕猴桃叶片基因组DNA作相同引物对比：变异猕猴桃基因组DNA的AFLP图谱中条带变异较多，达到了组培的猕猴桃变异诱导效果；而未变异猕猴桃基因组DNA的AFLP图谱条带清晰且相同引物各条带上的比较统一。

本发明属于国家林业局948项目（项目编号：2012-6-42）和云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室资助项目。

附图说明

图1为培养基不加EMS的‘Hort16A’优良后代株系未变异组培苗。

图2为本发明‘Hort16A’优良后代株系性状变异苗。图中，裂叶明显。

图3为本发明猕猴桃DNA双酶切效果。

图4为本发明猕猴桃DNA双酶切效果的综合得分图。

图5为本发明猕猴桃DNA酶切后的片段与接头的连接效果。

图6为本发明猕猴桃DNA酶切后的片段与接头的连接的综合得分图。

图7为本发明猕猴桃AFLP预扩增效果图。

图8为本发明猕猴桃AFLP选择性扩增效果图。

图9为本发明猕猴桃AFLP图谱。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。显然，具体实施方式包括但并不限于所指出的内容。

具体实施方式

材料为无菌中华猕猴桃‘Hort16A’优良后代组培苗植株。

实验所用主要试剂及药品见下表1。

表1主要试剂及药品

各种溶液的配制：

5×TBE：27gTris-base+13.75g硼酸+10ml0.5MEDTA定容至500ml备用；

变性PAGE胶：称取218g尿素于大烧杯中溶解，加入75ml(38%︰2%)的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺，再加入100ml5×TBE定容至500ml；

固定液：取冰醋酸200ml加入1.8L蒸馏水水中混匀置于4℃预冷备用；

银染液：4g硝酸银充分溶解于2L蒸馏水中，加入37%甲醛3ml，用前5分钟配好；

显影液：120g无水碳酸钠配制成2L溶液，加入37%甲醛3ml，400μL硫代硫酸钠（10mg/ml）。

（1）诱变剂的配制：

猕猴桃愈伤组织培养基：MS+0.3mg/LZT+0.05g/LNAA+30g/LSucrose+5g/LAgar高压灭菌后置于超净工作台上，将过滤灭菌后的EMS迅速加入愈伤组织培养基。EMS终浓度分别为0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08mg/L、0.09mg/L、0.10mg/L，调节pH5.8，待培养基凝固后用于接种。

（2）诱变处理：

取无菌猕猴桃叶片，接种于芽诱导培养基，在24～26℃、光照强度3000-5000lx、光周期16h/d条件下培养1个月，将芽转入增殖培养基MS+0.08mg/LEMS+1.5mg/LZT+30g/LSucrose+5g/LAgar培养。待芽逐渐长大形成苗，再将苗接种于生根培养基：1/2MS+0.7mg/LIBA+0.5g/LAC+30g/LSucrose+5g/LAgar培养。

不同浓度EMS处理对猕猴桃叶片胚性愈伤组织的影响在于：在EMS浓度为0.01～0.08mg/L区间内，猕猴桃叶片随着EMS浓度增加，胚性愈伤组织分化的比率上升；超过0.08mg/L数值，胚性愈伤组织分化的比率下降。其中，当EMS浓度为0.08mg/L时诱导效果最佳，当EMS浓度达到0.10mg/L时，猕猴桃的存活率和分化率都接近于0。

二、用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异的AFLP检测方法

（1）猕猴桃总DNA的提取及电泳检测

采用CTAB法提取猕猴桃DNA，然后将提取的DNA溶液5μL，1.0%琼脂糖凝胶电泳20分钟，用荧光定量检测仪检测DNA的纯度及浓度。

（2）AFLP分析

模板DNA制备

将猕猴桃基因组DNA用限制性内切酶ECoRI和MseI进行酶切，再用T4DNA连接酶，将DNA酶切和人工接头连接一步完成，体系为20μL。

由于酶用量和酶切时间与酶的活性相关，因此，通过L₁₆(4⁵)正交实验设计和综合评分法研究酶切结果。该结果表明：由300ngDNA+1UEcoRI/MseI+2μl缓冲液+ddH-₂O=20μl组成的20μl反应体系，37℃水浴4h后60℃保育20min，4℃保存效果最佳。这是因为，按图3、4给出的因素水平变化趋势，酶切效果随DNA用量的递增而先升高后下降，在300ng处达到最高值；酶切效果在内切酶用量为1U处最高，在4U处最低，整体呈下降趋势；酶切效果随酶切时间的递增而先下降后上升，酶切4h效果最好。

同时，DNA用量、内切酶用量和酶切时间的极差分别为5、1.5和1.25，表明DNA用量是影响酶切效果的关键因素。

由于连接需要能量，且酶的活性是影响连接效果的重要因素，因此，我们采用L₉(3⁴)正交实验设计和综合评分法研究了连接实验。结果表明：采用20μl反应体系，即2UT4DNA连接酶+2μlT4缓冲液+1.0μl接头引物(100nM)+2μlATP(10mM)+5μl酶切产物+ddH₂O=20μl，22℃过夜处理后65℃保育10min，4℃保存连接效果最佳。这是因为，按图5、6给出的因素水平变化结果：连接效果随着T4DNA连接酶用量的递增而先升高后下降，在2U处取得最高值，在1U处取得最低值；连接效果随着接头引物用量的递增而先升高后下降，在1.0μl处取得最高值，在0.5μl处取得最低值；连接效果随着ATP用量的递增而增加，使用2μlATP连接效果最好。

预扩增反应

AFLP预扩增反应总体系为25μL,各成分组合见表2。

表2AFLP预扩增PCR反应体系

组分体积 (μL)模板DNA(来自酶切连接的)2Pre-ampmix1dNTPs0.510×PCR buffer2.5TaqDNA polymease(2 U/μL)0.5Primer(50ng/μl)1AFLP-Water17.5

Primer为EcoRIPre:5'GACTGCGTACCAATTCA3'和MseIPre:5'GATGAGTCCTGAGTAAC3'。

将配好的预扩增体系放入PCR仪中，反应参数为：94℃，90s；94℃，30s，56℃，1min，72℃，1min，30循环；72℃，10min。PCR完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳的检测，-20℃保存备用。

见图7。在预扩增实验中，随着引物用量的递增，条带愈亮，扩增效果愈好。当前导及后导链引物的用量达到1μl（浓度为50ng/μl）后，扩增条带不再增亮；随着Taq酶用量的递增，条带越来越亮，当TaqDNApolymease（2U/μL）用量达到1μL后，条带亮度不再增加。

选择性扩增反应

将预扩增产物用TEbuffer按照1∶10稀释，用于限制性扩增的模板DNA，选择性扩增PCR反应液每份25μL,体系组成如表3所示。

表3AFLP选择性扩增PCR反应体系

组分体积 (μL)预扩增稀释样品210×PCR buffer2.5TaqDNA polymease(2 U/μL)1dNTPs0.5EcoRⅠ引物1MseⅠ引物1AFLP-Water17

混匀、离心、PCR扩增，反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循环，每循环降0.7℃；94℃30s，56℃1min，72℃1min，25循环；72℃5min,-20℃保存。如图8猕猴桃AFLP选择性扩增效果图的右边部分所示，随着Taq酶用量的递增，条带越来越亮，扩增效果越好。

本发明经过反复多次对64对AFLP引物进行筛选，选出具有扩增位点较多、带型质量好、分辨率较高、条带疏密合适、分布均匀等特点且适合猕猴桃AFLP反应的8对引物组合，如下：E-ACG+M-CTG、E-ACG+M-CAG、E-AAG+M-CAA、E-AAG+M-CTG、E-ACT+M-CAG、E-ACG+M-CAA、E-AGG+M-CAG和E-AGG+M-CAT。序列如下：

E-ACG+M-CTG:5'GACTGCGTACCAATTCACG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACTG3’

E-ACG+M-CAG:5'GACTGCGTACCAATTCACG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAG3’

E-AAG+M-CAA:5'GACTGCGTACCAATTCAAG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAA3’

E-AAG+M-CTG:5'GACTGCGTACCAATTCAAG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACTG3’

E-ACT+M-CAG:5'GACTGCGTACCAACTCAAG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAG3’

E-ACG+M-CAA:5'GACTGCGTACCAATTCACG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAA3’

E-AGG+M-CAG:5'GACTGCGTACCAATTCAGG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAG3’

E-AAG+M-CAT:5'GACTGCGTACCAATTCAAG3’+5’GATGAGTCCTGAGTAACAT3’

聚丙烯酰胺凝胶电泳

将玻璃板和耳朵板充分洗净后用蒸馏水冲洗后斜靠晾干，分别用无水乙醇横竖拭擦使用面3次，最后一次扫净。将配制好的亲和硅烷（亲和硅烷30μL、冰醋酸30μL、无水乙醇4.5ml）涂擦在玻璃板上，待晾干后用无水乙醇轻轻拭擦一次。更换手套，用剥离硅烷拭擦耳朵板后，再用无水乙醇轻轻拭擦一次。然后，玻璃板在下，两侧边缘放压条，耳朵板在上，底部对齐，将板组装起来，两侧用夹子夹住。最后将新配制的6%PAGE胶（50mlPAGE胶+60μLTEMED+160μL10%APS）灌入缝隙中，注意不能有气泡，放置4小时以上，待凝固后用于电泳。

在选择性扩增产物中加入10μLLoadingBuffer，离心、混匀，95℃变性5min后立即置于冰浴中。采用1×TBE作为电泳缓冲液，恒定电压50V/cm预电泳30min后,取5μL变性液加到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，待蓝色条带到达胶板底部时停止电泳。

银染

小心将玻璃板分开后放入装有预先准备的固定液中，置于摇床（50r/min）上摇匀20min，待指示剂脱色，固定液保留。用蒸馏水洗两次，各3min，于摇床上进行，将玻璃板放入已配制好的银染液中，置于摇床上摇动30min。用蒸馏水冲洗5s后，立即放入预冷的显影液中，置于摇床（50r/min）上摇至条带出现，将玻璃板放入上述10%冰醋酸中，摇床上固定约5min，将胶板置于室温下自然晾干。

3、猕猴桃变异结果分析

对EMS处理后的猕猴桃现状进行对比观察，发现部分性状比较特殊，出现了各种变异现象（部分变异性状如图2）。

本发明用EMS诱导后性状变异的猕猴桃基因组DNA与未经诱导的正常猕猴桃基因组DNA作相同引物对聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。经染色后，对比观察发现，变异猕猴桃基因组DNA的AFLP图谱中条带变异较多，而未变异猕猴桃基因组DNA的AFLP图谱条带清晰且相同引物各条带比较统一。这说明了EMS对组培的猕猴桃变异诱导效果很好（如图9）。进一步研究表明AFLP还可揭示表型未发生变化的植株DNA水平的变异，且该技术可用于猕猴桃组培苗工厂化生产中的遗传变异动态监测。