一种参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的定量检测方法

摘要

本发明建立了一种定量分析参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的定量检测方法，包括以下步骤：制备依地酸二钠和焦亚硫酸钠对照品溶液；制备参芪扶正注射液供试品溶液；采用离子色谱法定量分析上述对照品溶液和供试品溶液；根据对照品和样品离子色谱图中EDTA

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对参芪扶正注射液安全性控制的方法及应用，具体是一种通过建立离 子色谱法对参芪扶正注射液中添加的附加剂依地酸二钠和焦亚硫酸钠进行检测及应用的方 法，属于药物分析技术及安全性控制领域。

背景技术

参芪扶正注射液为国家中药保护品种，保护品种号：ZYB2072004073，是由黄芪和党参经 提取制成的中药大输液，用于气虚症肺癌、胃癌的辅助治疗，可提高机体的免疫功能，并可 治疗心、脑血管疾病，具有扶正固本、益气补虚、活血化瘀的功效。

参芪扶正注射液成分复杂，根据ZL201210436493.4中公开资料，其指纹图谱中仅特征 峰就有18个之多；根据ZL201310008395.5，参芪扶正注射液鉴别出来的成分有毛蕊异黄酮 -7-O-β-D-葡萄糖苷，异微凸剑叶莎醇-7，2′-二-O-葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷、9，10- 二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷、黄芪甲苷、5-羟甲基糠醛等，诸多已知和未知的成分给 参芪扶正注射液的质量控制带来了极大的困难。为了保持注射液质量的可控性和稳定性，红 外光谱、核磁共振、高效液相色谱等高精度分析的方法都相继被应用于监测参芪扶正注射液 中S峰(毛蕊异黄酮苷)和极性较大的水溶性成分、黄芪甲苷含量、其负相关成分、皂苷类 成分等。即使众多先进的分析检测方法用于参芪扶正注射液质量控制，但是为了防微杜渐， 增加临床用药安全性，对于参芪扶正注射液质量控制的研究从未间断。

杂的成分给参芪扶正注射液的质量控制带来很大难度的同时，也给生产造成了一定的困 扰。制备静脉给药输液时，一般使用不锈钢容器和管道，在加热情况下，注射液与金属容器、 管道、滤器等较长时间接触后，注射液的组分会与金属离子等物质结合，生成有色的金属复 合物，导致溶液颜色变深，为了防止主药与金属离子发生反应，减少溶液变色，本品中添加 了适量的金属络合剂依地酸二钠和抗氧化剂焦亚硫酸钠，添加量大约为0.2g/L和0.5g/L。

现在有研究表明，依地酸二钠可与钙离子结合成可溶的络合物引起钙的减少，静脉制剂 中使用依地酸二钠会导致血钙下降，若添加过量会造成血钙过低，恶心、头痛、尿急、血液 凝固性降低等不良反应；有文献报道：如果人体大量摄入依地酸二钠，依地酸二钠会与血液 及骨骼中的钙形成水溶性螯合物，被排出体外，引起低血钙或骨钙流失，导致抽搐甚至死亡。 另外，焦亚硫酸钠在溶液中以SO₃^2-和SO₄^2-的形式存在，储存久了，还会释放出SO₂。SO₂对皮 肤、黏膜有明显的刺激作用，可引起结膜、支气管炎症状；其次亚硫酸盐还会引发过敏。参 芪扶正注射液的适用人群是气虚症肺癌、胃癌患者，身体机能弱，免疫力下降，更容易产生 过敏、头痛等不良反应，因此需要更加严格的控制依地酸二钠和焦亚硫酸钠使用量。虽然参 芪扶正注射液中添加了金属络合剂依地酸二钠和抗氧化剂焦亚硫酸钠，但是针对于附加剂尚 未建立公开的质量控制方法。在生产过程中人员情绪不稳定等不确定因素，可能会导致投料 量的偏差，带来质量和安全隐患。为了保证临床用药的安全，需要对依地酸二钠和焦亚硫酸 钠的建立质量控制方法。

发明内容

本发明提供一种离子色谱法定量分析控制参芪扶正注射液中附加剂依地酸二钠和焦亚硫 酸钠含量的方法，具体的涉及一种参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的定量检测方 法。

本发明的另一目的是提供上述定量检测方法的应用。

在一些文献中，药品注射液中微量离子用离子色谱法检测时，将注射液直接注入离子色 谱柱内进行分析。参芪扶正注射液的成分复杂，如背景技术所述，其中含有氨基酸、糖类(主 要是单糖和寡糖)、有机酸、氯化钠等诸多成分，各种不同的化学物质多达18种以上，而依 地酸二钠和焦亚硫酸钠2种附加剂的含量低，经过试验，发现将注射液直接注入离子色谱柱 内，结果色谱图上显示的氯离子峰面积过高，占全部成分峰面积的95％以上；同时色谱柱柱 效下降很快，保留时间波动大，导致得到的谱图无法解读，根本无法检测到依地酸二钠和焦 亚硫酸钠。

为了解决以上问题，发明人经过多方面的摸索，发现将样品进行稀释后，可以大幅度降 低氯离子的峰面积，但是稀释后的参芪扶正注射液在检测中色谱柱柱效仍然存在下降快，保 留时间波动大的问题。

在已经公开的文献资料中，ZL201310756866.0用核磁共振方法对参芪扶正注射液进行 质量控制时，参芪扶正注射液经过了冻干处理；ZL201310008395.5，参芪扶正注射液经0.45 μm微孔滤膜滤进行处理；ZL201210436493.4采用0.22um微孔滤膜滤过进行处理；ZL 200710136382.0中，经过大孔树脂过滤，萃取等处理步骤。发明人将公开文献中的处理手段 应用到本发明中，都无法解决柱效下降快的技术问题。

经过艰苦的试验，我们惊喜的发现使用C18柱处理稀释过的参芪扶正注射液，其氯离子 峰面积干扰被消除，且色谱柱柱效没有明显下降，保留时间的波动可控，可以精确定量检测 到依地酸二钠和焦亚硫酸钠。

本发明一种参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)用离子色谱法检测参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的EDTA^2-、SO₃^2-、SO₄^2-的离子浓度；

(2)依地酸二钠和焦亚硫酸钠的计算：

依地酸二钠的计算：根据步骤(1)中所述EDTA^2-的浓度，按照依地酸二钠和EDTA^2-1∶1 的摩尔比，折算出溶液中依地酸二钠的浓度；

焦亚硫酸钠的计算：①通过峰面积归一化法，利用绘制Na₂S₂O₅对照品标准曲线时不同 浓度的工作对照溶液中SO₃^2-和SO₄^2-的峰面积，算出Na₂S₂O₅溶液中SO₃^2-和SO₄^2-的比例；②根 据Na₂S₂O₅对照品溶液中，SO₃^2-和SO₄^2-的比例以及S元素守恒，按照Na₂S₂O₅分别与SO₃^2-和SO₄^2- 的摩尔比，通过三者的分子量折算，分别绘制SO₃^2-和SO₄^2-的标准曲线；③根据样品溶液中SO₃^2-和SO₄^2-的峰面积，分别代入SO₃^2-和SO₄^2-的标准曲线，算出SO₃^2-和SO₄^2-浓度，再根据分子量折 算出SO₃^2-和SO₄^2-的摩尔浓度；④依据溶液中S元素守恒，根据SO₃^2-和SO₄^2-的摩尔浓度，算出 Na₂S₂O₅的摩尔浓度，进而根据分子量算出样品中Na₂S₂O₅的浓度。

步骤(1)中所述参芪扶正注射液先通过C18小柱纯化，然后洗脱液稀释50-400倍后， 再通过离子色谱柱。

步骤(1)中所述参芪扶正注射液先通过C18小柱纯化，然后洗脱液稀释100-200倍后， 再通过离子色谱柱。

步骤(1)中所述参芪扶正注射液先通过C18小柱纯化，然后洗脱液稀释200倍后，再通 过离子色谱柱。

所述步骤(1)中还包括对照品溶液的制备，分别取依地酸二钠、焦亚硫酸钠对照品适 量，精密称定，加水制成每1mL分别含依地酸二钠、焦亚硫酸钠1μg的溶液。

所述步骤(1)中离子色谱法的色谱条件为：色谱柱为IonPacAS11-HC(4×250mm)， 淋洗液浓度为0～30min15mmol/L的氢氧化钾溶液，电导检测器，流速为1mL/min，进样 量为25μL。

本发明提供的依地酸二钠和焦亚硫酸钠的控制方法能够应用于参芪扶正注射液中附加剂 的测定，能有效地对参芪扶正注射液的安全性进行评价。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

参芪扶正注射液质量标准及其相关的研究资料中，尚未对其附加剂依地酸二钠和焦亚硫 酸钠进行控制，而过量的依地酸二钠和焦亚硫酸钠对人体有损伤，特别该品种为静脉注射剂， 风险较大，焏需对附加剂的安全性进行评价和控制。故本发明方法建立离子色谱法检测参芪 扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠的技术标准，通过定量分析EDTA^2-和SO₃^2-、5O₄^2-，能快 速有效地监控药品附加剂的用量，除了在投料源头严格管理人员的操作规范外，还提供了一 种投料后监控药品附加剂用量的途径，双重控制，保证药品质量安全。同时本发明还可以实 时定量测定EDTA^2-、SO₃^2-和SO₄^2-的量，用于精确计算参芪扶正注射液产品储藏过程中依地酸二 钠和焦亚硫酸钠的剩余量，从而准确评估焦依地酸二钠和亚硫酸钠的投料量是否合理，最终 精密调整依地酸二钠和焦亚硫酸钠的投料量，最大限度的达到用最科学投料量、最有效质量 控制的结果，优化药品附加剂的使用，保证用药安全。另外，本发明中通过同时测定SO₃^2-和 SO₄^2-计算样品中焦亚硫酸钠含量的方法具有一定先进性、其稳定性和重现性均较好，可推广 应用于其他制剂的检测。

附图说明

图1是依地酸二钠对照品离子色谱图；

图2是焦亚硫酸钠对照品离子色谱图；

图3是参芪扶正注射液样品的离子色谱图；

图4是纯水的离子色谱图；

图5是依地酸二钠标准曲线图；

图6是亚硫酸根标准曲线图；

图7是硫酸根标准曲线图；

图8是参芪扶正注射液不同稀释倍数的离子色谱图；

图9是离子色谱柱为Biobasic的离子色谱图；

图10为离子色谱柱为AS11-HC的离子色谱图；

图11为离子色谱柱淋洗液浓度为15mMol/L的离子色谱图；

图12为离子色谱柱淋洗液浓度为13mMol/L的离子色谱图；

图13为离子色谱柱淋洗液浓度为11.5mMol/L的离子色谱图；

图14为离子色谱柱淋洗液浓度为10mMol/L的离子色谱图；

图15为样品前处理及进样时间差异的离子色谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器：离子色谱仪：DIONEXICS-2000(戴安公司)；色谱柱：IonPacAS11-HC (4×250mm)(戴安公司)；保护柱：IonPacAH11-HC(4×50mm)(戴安公司)；检测器：电 导检测器(戴安公司)；淋洗液罐：EGCIIKOH(090581489019)。Millipore纯水仪。

1.2试药：依地酸二钠对照品(批号：20100311，杭州利人药业有限公司)；焦亚硫酸 钠对照品(批号：20100301，湖南尔康制药有限公司)。Sep-PakCartridgesVacC183cc 小柱(Waters)。参芪扶正注射液，由丽珠集团利民制药厂提供。实验中所用试剂乙腈、甲酸 均为色谱纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备：精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离 子水洗脱，定容10mL量瓶，再精密量取2.5mL于50mL量瓶中，定容，即得。

2.2对照品溶液的制备：分别精密称定依地酸二钠、焦亚硫酸钠对照品0.01140g、 0.01168g于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，分别作为依地酸二钠、焦亚硫酸钠对 照品储备液。

2.3色谱条件：色谱柱为IonPacAS11-HC(4×250mm)，淋洗液浓度为0～30min15 mmol/L的氢氧化钾溶液，电导检测器，流速为1mL/min，进样量为25μL。

2.4线性关系

2.4.1依地酸二钠的线性关系

分别对依地酸二钠对照品储备液进行稀释，配制标准曲线的一系列溶液：4.56、3.42、 2.28、1.14、0.57μg/mL，在上述色谱条件下进样分析，记录对照品峰面积。以对照品峰面 积为纵坐标，浓度为横坐标绘制对照品标准曲线：y＝0.039x-0.0087，r＝0.9990，结果表明依 地酸二钠在0.57～4.56μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

2.4.2焦亚硫酸钠的线性关系

由于Na₂S₂O₅在水中以SO₃^2-和SO₄^2-的形式存在，采用分别测定SO₃^2-和SO₄^2-的方法，折算出 Na₂S₂O₅的含量(S守恒)。

Na₂S₂O₅+H₂O＝2NaHSO₃(焦亚硫酸钠吸水)

2NaHSO₃+O₂＝2NaHSO₄(亚硫酸氢钠氧化)

被氧化生成的硫酸氢钠也可以和未吸水的焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠反应：

2NaHSO₄+Na₂S₂O₅＝2Na₂SO₄+2SO₂+H₂O

NaHSO₃+NaHSO₄＝Na₂SO₄+SO₂+H₂O

分别对焦亚硫酸钠储备液进行稀释，配制标准曲线的一系列溶液：4.672、3.504、2.336、 1.168、0.584μg/mL，分别进样25μL，记录对照品峰面积。首先，通过峰面积归一化法， 算出Na₂S₂O₅溶液中，SO₃^2-和SO₄^2-的比例(见表1)：

表1SO₃^2-和SO₄^2-在Na₂S₂O₅溶液中的分配

根据Na₂S₂O₅溶液中，SO₃^2-和SO₄^2-的比例以及S元素守恒，分别绘制SO₃^2-和SO₄^2-的标准曲 线：

①SO₃^2-的标准曲线：y＝0.112x-0.0089，r＝0.9985(表2)。

表2SO₃^2-的标准曲线

工作曲线(μg/ml) 峰面积 2.805 0.313 2.334 0.246 1.497 0.153 0.775 0.078 0.381 0.038

②SO₄^2-的标准曲线：y＝0.0942x-0.0031，r＝0.9992(表3)。

表3SO₄^2-的标准曲线

工作曲线(μg/ml) 峰面积 1.355 0.126 0.740 0.065 0.564 0.048 0.250 0.021 0.132 0.011

2.5精密度试验：取参芪扶正注射液(批号：0910499)，按供试品溶液的制备方法制备， 连续进样6次，测定依地酸二钠和焦亚硫酸钠的含量，结果表明精密度良好(见表4)。

表4精密度试验

2.6重复性试验：取同一批参芪扶正注射液(批号：1001015)，共6份，分别进样，测 定依地酸二钠和焦亚硫酸钠的含量，结果表明本法重复性良好(见表5)。

表5重复性试验

2.7回收率试验：取同一批参芪扶正注射液(批号：1001015)1mL，共6份，根据重复 性和线性计算依地酸二钠和焦亚硫酸钠的理论含量，加入等量的依地酸二钠和焦亚硫酸钠对照 品，稀释一倍，根据依地酸二钠和焦亚硫酸钠的实际测得值计算回收率，结果表明依地酸二 钠和焦亚硫酸钠的回收率均在90％～110％之间，该法准确度良好(见表6，表7)。

回收用对照品溶液的配制：分别精密称取依地酸二钠和焦亚硫酸钠0.02163g、0.05145 g于100mL量瓶中，配制成依地酸二钠和焦亚硫酸钠的混合对照品溶液，再精密吸取1mL加 入供试品中。

表6依地酸二钠的回收率考察

表7焦亚硫酸钠的回收率考察

2.8稳定性

2.8.1样品稳定性考察

取参芪扶正注射液(批号：1001015)，分别于0、2、4、8、12小时进样，记录依地酸二 钠和焦亚硫酸钠的峰面积，结果表明样品在12小时内稳定性良好(见表8)。

表8稳定性考察

2.8.2焦亚硫酸钠稳定性考察

由于Na₂S₂O₅在水溶液中以SO₃^2-和SO₄^2-的形式存在，且SO₃²会进一步反应生成SO₂，有必要 对其稳定性进行考察。精密称取Na₂S₂O₅0.01189g，配制成浓度为1.189μg/mL溶液，分别 于0、2、4、6、8、10、12小时进样，记录SO₃^2-和SO₄^2-的峰面积。结果表明焦亚硫酸钠在水溶 液中的两个离子在12小时内稳定性良好(见表9)。

表9Na₂S₂O₅稳定性考察

2.9参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠测定应用实例

应用上述建立的离子色谱法对参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠进行测定，可 以快速、准确地分析附加剂的含量，对参芪扶正注射液的安全性进行控制，同时对企业内部 调整附加剂的用量有一定的指导意义。部分批次的测定结果见表10，结果显示，样品中依地 酸二钠含量在0.163～0.198mg/mL之间，与投料量(0.2g到1000ml)基本一致；焦亚硫酸 钠的含量经折算在0.445～0.537mg/mL之间，与投料量(0.5g到1000ml)基本一致。结果 表明，应用该方法检出的参芪扶正注射液中的附加剂含量与其投料量基本一致，可用于该品 种安全性的评价。

表10部分样品中依地酸二钠和焦亚硫酸钠测定结果

因此，应用离子色谱法测定参芪扶正注射液中依地酸二钠和焦亚硫酸钠，可以有效地对 该产品的安全性进行控制，保证该品种临床用药的安全稳定。

实施例2参芪扶正注射液稀释倍数的筛选

供试品溶液的制备：

供试品溶液1：稀释10倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 定容，即得。

供试品溶液2：稀释20倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 再精密量取2.5mL于5mL量瓶中，定容，即得。

供试品溶液3：稀释50倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 再精密量取10mL于50mL量瓶中，定容，即得。

供试品溶液4：稀释100倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 再精密量取5mL于50mL量瓶中，定容，即得。

供试品溶液5：稀释200倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 再精密量取2.5mL于50mL量瓶中，定容，即得。

供试品溶液6：稀释400倍

精密量取参芪扶正注射液1mL，通过C18小柱纯化，用去离子水洗脱，定容10mL量瓶， 再精密量取2.5mL于100mL量瓶中，定容，即得。

其他的实验操作方案参照实施例1所述，实验结果见图8和如下表11：

表11

亚硫酸根面积 硫酸根面积 亚硫酸根/硫酸根 供试品溶液6 4.225 2.071 2.04 供试品溶液5 9.963 4.492 2.22 供试品溶液4 20.034 9.037 2.22 供试品溶液3 41.994 18.656 2.25 供试品溶液2 108.105 47.352 2.28 供试品溶液1 221.663 94.701 2.34

从图中看出，随着稀释倍数加大，氯离子的响应值明显降低，有效减少了对系统的污染； 同时，根据仪器信噪比、亚硫酸根与硫酸根比值稳定性综合考虑，亚硫酸根的峰面积在10左 右、硫酸根的峰面积在5左右、比值在2.2左右为宜。因此选择稀释200倍。

实施例3色谱柱选择

比较了AS11-HC和Biobasic两种离子色谱柱，实验条件参照实施例1所述，实验结果如 色谱图9和10。

AS11-HC图基线平稳，分离度较Biobasic图好。因此选择AS11-HC离子色谱柱。

实施例4：离子色谱柱淋洗液浓度的选择

淋洗液浓度分别考查了15mMol/L、13mMol/L、11.5mMol/L、10mMol/L的氢氧化钾溶液， 其他的实验条件按照实施例1进行。

淋洗液不同浓度色谱图见11-14。

根据色谱图所示，淋洗液为11.5mMol/L和10mMol/L的氢氧化钾溶液时与淋洗液为 15mMol/L和13mMol/L的氢氧化钾溶液相比，亚硫酸根出峰前的基线更加的平稳，11.5mMol/L 和10mMol/L的氢氧化钾溶液更适合作为淋洗液。

淋洗液为11.5mMol/L的氢氧化钾溶液时与淋洗液为10mMol/L的氢氧化钾溶液相比，出 峰时间更短，为了缩短分析时间，优选11.5mMol/L的氢氧化钾溶液作为淋洗液。

实施例5：样品前处理及进样时间

由于亚硫酸根不稳定，易氧化，样品稳定性考查情况显示，样品放置8小时后进样，结 果有较明显变化，因而处理后样品应在6小时内完成测定。同时处理样品时应意稀释容器的 洁净情况，稀释用水应使用制备2小时内的超纯水(或用前用适当方法脱氧处理)。

表12

实施例6：参芪扶正注射液预处理步骤的筛选

直接进样法：结果氯离子峰面积过高，占全部成分峰面积的95％以上；同时色谱柱柱效 下降很快，保留时间波动大。

稀释进样法(不过C18柱)：考察了稀释倍数，确定稀释倍数为200，结果氯离子的干扰 大大减小，但色谱柱柱效仍下降明显。

0.45μm微孔滤膜过滤后稀释200倍：氯离子的干扰大大减小，但色谱柱柱效仍下降明 显。

0.22um微孔滤膜过滤后后稀释200倍：氯离子的干扰大大减小，但色谱柱柱效仍下降明 显。

AB-8大孔树脂过滤处理后稀释200倍：氯离子的干扰大大减小，色谱柱柱效下降得到改 善，但是保留时间仍然波动，不能满足分析需求。

C18柱过滤后稀释200倍：氯离子的干扰大大减小，色谱柱柱效下降得到改善，保留时 间波动较小，可以满足分析需求。

综上，优选C18柱作为预处理的手段。