一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法

摘要

一种用于荧光法测定叶绿素的藻液的制备方法，选取蛋白核小球藻藻种，配制BG-11培养基，然后将培养基灭菌、冷却，于无菌条件下进行藻种接种，接种完成，置于恒温光照培养箱中培养，在培养基灭菌之前，向所述的BG-11培养基中添加琼脂粉来培养蛋白核小球藻。本发明根据琼脂粉的凝胶性、稳定性提出了一种藻液的制备方法、向BG-11培养基中添加琼脂粉(0.08-0.10g/100ml)作为助悬剂培养蛋白核小球藻，培养的蛋白核小球藻作为制备藻液，提高了藻液的悬浮性、稳定性，进而确保了利用荧光法测定叶绿素含量的结果的准确性。

说明书

技术领域

本发明属于水质环境监测的技术领域，具体涉及一种用于荧光法测定 叶绿素含量的藻液的制备方法。

背景技术

叶绿素a含量在一定程度上反应水体中藻类数量和水质状况，是水体 水质环境监测中的常规监测项目、是水体富营养化指标之一。

实验室分光光度法^[1-2]、荧光分光光度法^[3]是实验室测定叶绿素a实现 对浮游植物的定量测定的最为常用的方法。采用荧光光度法测定水体中的 叶绿素a，灵敏度比分光光度法高10倍，不需要对样品进行预处理，操作 简单，可连续监测，随着荧光法叶绿素在线分析仪的开发与研究，实现水 体中叶绿素的实时原位分析。

实验过程中发现现有技术荧光检测法直接测定藻液时，藻细胞沉降明 显、测量值随时间变化较大得到的数据不准确，无法正确判断出水质环境。 准确、完整的监测数据是环境管理工作的基础和依托，一个错误的数据可 能导致错误的决策与行动，因此正确测量水质环境至关重要。

发明内容

本发明为解决现有技术中荧光法测定藻液时，容易沉降，无法获得准 确的藻液浓度数据，提供了一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备 方法。本发明为实现其目的采用的技术方案是：

一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制备方法，选取蛋白核小球 藻藻种，配制BG-11培养基，然后将培养基灭菌、冷却，于无菌条件下进 行藻种接种，接种完成，置于恒温光照培养箱中培养，在培养基灭菌之前， 向所述的BG-11培养基中添加琼脂粉来培养蛋白核小球藻。

所述的BG-11培养基放入灭菌锅于121℃下灭菌30min，取出后放入超 净台冷却。

所述的BG-11培养基在接种之前，置于紫外灯下照射30min以上。

所述恒温光照培养箱中的培养条件是：光照度为2000lx，温度为25℃， 湿度为75％RH，光暗周期为12h：12h，静置培养，每日摇瓶2-3次，同时 更换锥形瓶的位置，以免引起光照不足。

BG-11培养基中琼脂粉的添加量为0.08-0.10g/100mL。

本发明的有益效果是：本发明根据琼脂粉的凝胶性、稳定性提出了一 种藻液的制备方法、向BG-11培养基中添加琼脂粉(0.08-0.10g/100ml)作 为助悬剂培养蛋白核小球藻，培养的蛋白核小球藻作为制备藻液，提高了 藻液的悬浮性、稳定性，减少藻体沉降对测定结果的影响，进而确保了利 用荧光法测定叶绿素含量的结果的准确性。

附图说明

图1是蛋白核小球藻叶绿素a的激发光谱和发射光图谱。横坐标为扫 描波长，纵坐标为荧光强度，左边为激发图谱，右边为发射图谱。

图2是测量间隔时间与1号原藻液荧光值间的关系曲线。横坐标为测 量间隔时间，纵坐标为荧光值的变化率，图中△F/F₀＝-9.96％表示当T＝1min 时，△F/F₀＝-9.96％。

图3是测量间隔时间与1-6号荧光值相对变化率间的关系曲线。横坐 标为测量间隔时间，纵坐标为荧光值的变化率。

图4是测量间隔时间与光密度值相对变化率间的关系曲线。横坐标为 测量间隔时间，纵坐标为光密度值的变化率。

具体实施方式

本发明为解决现有技术中荧光法测定藻液时，藻容易沉降，无法获得 准确的藻液浓度数据，提供了一种用于荧光法测定叶绿素含量的藻液的制 备方法。下面结合具体实施例为本发明作进一步说明。

1、实验仪器与试剂

仪器：光照培养箱(E-30B0美国Percival)；可见分光光度计(722 型上海光谱仪器有限公司)；紫外分光光度计(UV-2600上海天美科学仪 器有限公司)；荧光分光光度计(RF-5301日本岛津公司)；离心机(Z323 德国HERMLE－Z323)；循环水式多用真空泵(SHB－Ⅲ郑州长城科工贸有 限公司)。

试剂：盐酸(分析纯石家庄市华迪化工工贸有限公司)；氢氧化钠(分 析纯天津市大陆化学试剂厂)；叶绿素a标准品(日本wako公司，10mg 装)；蛋白核小球藻(藻种购自中国科学院野生生物质库——淡水藻种库， 培养基为灭菌BG-11培养液)；琼脂粉(JapanMW：3000-9000)。

2、添加不同浓度琼脂粉配置BG-11培养基

选取6个规格为250ml的锥形瓶，每个锥形瓶中配置100mlBG-11培 养基，并向每个锥形瓶中添加不同量的琼脂粉。

BG-11培养基的配方为：

注：用盐酸及氢氧化钠将培养基的PH调节至7.1；

微量金属A₅溶液配方：

其中，

1号培养基：添加琼脂粉0g/100mL。

2号培养基：添加琼脂粉0.02g/100mL。

3号培养基：添加琼脂粉0.04g/100mL。

4号培养基：添加琼脂粉0.06g/100mL。

5号培养基：添加琼脂粉0.08g/100mL。

6号培养基：添加琼脂粉0.1g/100mL。

3、制备蛋白核小球藻藻液

选取的蛋白核小球藻购买自中国科学院野生生物质库——淡水藻种 库，选择一瓶处于对数增长期且生长状态良好的蛋白核小球藻120ml，摇 匀，平均分成6份，每份20ml，将六份蛋白核小球藻分别接种于1-6号培 养基中作为出发藻，然后将接种有出发藻的锥形瓶置于E-30B0光照培养箱 中培养，培养条件为：培养温度25℃，光照条件2000lx，时间设置为12h 昼/12h夜，湿度条件75％RH。藻种静置培养，每日摇动锥形瓶2次同时更 改锥形瓶位置，七日后同时取出即得用于荧光法测定叶绿素含量的藻液。

4、对制备的用于荧光法测定叶绿素的藻液悬浮稳定性的检测试验

4.1确定叶绿素a的最佳激发波长和发射波长

提取1号培养基中培养的蛋白核小球藻中的叶绿素a，使用岛津RF5301 荧光分光光度计分别对叶绿素a进行光谱扫描。扫描条件：设定激发波长 扫描范围为400nm～500nm，发射波长扫描范围为600nm～750nm，狭缝宽 度：EX:5.0nm，EM:5.0nm；灵敏度：High；响应时间：Auto。扫描结果 见图1。

由图1可以看出，蛋白核小球藻叶绿素a的激发波长为436nm，发射 波长为672nm，激发波长和发射波长的狭缝宽度均为5.0nm。

4.2确定添加琼脂粉之后BG-11培养基的特征吸收

使用UV—2600型紫外可见分光光度计于室温下扫描添加0.10g/100ml 的BG-11培养基在220～900nm波长范围内的吸光度值，确定了添加琼脂粉 的BG-11培养基无特征吸收，因此琼脂的添加对藻液光密度的测定结果无 影响。

4.3将得到的1-6号用于荧光法测定叶绿素含量的藻液静置10h后观察 1-6号藻液的状态

同时从1-6号锥形瓶中培养的用于荧光法测定叶绿素含量的藻液中个 取出10ml，分别置于对应的1-6号比色管中，即1号锥形瓶取出的藻液置 于1号比色管中，2号锥形瓶取出的藻液置于2号比色管中，以此类推；然 后静置10h后观察琼脂在藻体培养过程中对藻体的悬浮效果藻液状况，结 果如下：

琼脂粉在藻液的培养中作为助悬剂，琼脂粉的添加量决定藻液的悬浮 状况，添加量过少会使藻液悬浮不均匀，添加量过大导致培养基凝固。添 加了琼脂粉的BG-11培养基培养的对数生长期的蛋白核小球藻静置10h后， 琼脂粉添加量在0.08-0.10g/100ml的BG-11培养基培养的藻液悬浮均匀、 不下沉、不分层，且溶液稳定；没有添加琼脂粉的1号比色管的藻液中藻 细胞都沉淀了，所以从颜色上比2-6号比色管浅，2号和3号比色管的藻液 中出现明显的藻体下沉现象，4号比色管出现明显的分层，而5号和6号比 色管的藻液悬浮均匀、溶液稳定。

4.4测定测量间隔时间对荧光值测量结果的影响实验

(1)测量间隔时间对不添加琼脂粉培养基制备的藻体荧光值测量的影 响实验

取1号锥形瓶中的供试藻，用灭菌的蒸馏水稀释四倍，灭菌的蒸馏水 作为空白参比，使用岛津RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下 每隔1min测定一次样品的荧光强度。建立测量间隔时间(T)与荧光值(F) 间的关系曲线，如图2所示。

由图2可知，荧光值随测量间隔时间变化较大，测量值存在较大误差， 不容忽略。这是因为藻细胞在静置1min内沉降严重荧光值下降较大，5min 后基本荧光值趋于稳定，因此要求测定样品前必须摇匀、测量时要求快速， 以减小因藻细胞因沉降造成的误差。

(2)测量间隔时间对添加琼脂粉培养基制备的藻体荧光值相对变化率 的影响实验

取2-6号锥形瓶中的供试藻，灭菌的蒸馏水作为空白参比，使用岛津 RF5301荧光分光光度计在确定的荧光测定参数下每隔1min测定一次样品 的荧光强度。绘制测量间隔时间(T)与荧光值相对变化率(△F/F₀)变化 曲线，如图3所示。

由图3可知，5、6号供试藻荧光值相对变化率受测量间隔时间影响较 小在±5％内，效果明显，溶液稳定。

4.5测定静置时间对光密度测量结果的影响

取1、5、6号锥形瓶中的供试藻，用灭菌的蒸馏水进行稀释四倍，灭 菌的蒸馏水作为空白参比，使用722型可见分光光度于663nm波长处每隔 1min测定一次蛋白核小球藻的光密度值D(663nm)。绘制光密度值相对变化 率(△D(663nm)/D₀)对测量间隔时间(T)变化曲线。如图5所示。

由图4可知，5、6号供试藻光密度值相对变化率受测量间隔时间影响 较小在±5％内，且添加琼脂粉0.08-0.10g/100ml藻体悬浮基本均匀、不下 沉、不分层，光密度值略有上升。

结论，综上研究，本发明通过向BG-11培养基中加入0.08-0.1g/100ml 的琼脂粉，使得藻液悬浮稳定、不分层、不下沉，在用荧光法直接测定藻 液时，测量结果稳定、准确，在水质环境中可行性突出。