治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。使用CTL抗原复合表位肽激发CTL应答能力，提供有效的特异性CTL效应细胞。本发明还提供了包含所述治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞或细胞制剂的组合物或试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎病毒（HBV）是非细胞毒性病毒，侵入机体后可引发特异性免疫反应。CD8⁺特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocytes,CTL）是清除肝细胞内HBV感染的主导力量，既能通过释放γ干扰素(interferonγ)和肿瘤坏死因子（tumornecrosis-α,TNF-α）等细胞因子抑制或清除肝细胞内的HBV，又能通过特异性细胞毒作用直接杀伤靶细胞，以清除细胞内的HBV。CD4⁺T细胞可调节CD8⁺T细胞的活性，也能通过释放IFN-γ和TNF-α等细胞因子从而有助于肝细胞内HBV的清除。而HBV特异性T细胞表位，是激发特异性细胞免疫应答的原动力，处于免疫识别和免疫激活的核心位置。

研究发现，引起特异性CTL免疫应答反应的并非完整的病毒抗原分子，而是抗原来源的特异性CTL表位肽，其中，与MHC-I类分子特异性结合的短肽即CTL表位在CTL活化过程中其关键作用。抗原提呈细胞（APCs）摄取HBV抗原蛋白，加工处理形成系列免疫原性的表位（epitope）多肽，其中MHC-I分子与相应表位肽结合可以形成表位肽-MHC-I复合物，并在APCs表面活化CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞，后者在CD4⁺T淋巴细胞的辅助下通过颗粒酶、穿孔素的杀伤途径，或通过FasL诱导肝细胞凋亡途径及通过分泌IFN-γ、TNF-α的非细胞裂解途径等。

由于抗原来源的特异性CTL表位肽具有MHC-I类分子限制性。将抗原加工处理成的CTL表位肽与主要组织相容性复合体MHC-I类分子结合形成多肽-MHC复合物呈递到细胞表面供CD8⁺T淋巴细胞表面的T细胞抗原受体（TCR）识别而被活化，才能引发CTL特异性免疫应答反应。既往的研究发现，HBV相关抗原的免疫显性CTL表位大多是HLA-A0201限制性表位。然而，在我国携带HLA-A1101等位基因的人群占到总人群的近三分之一，是仅次于HLA-A0201高频等位基因的人数比例。但目前关于HBV来源的HLA-A1101限制性CTL表位的研究较少，且由于单一的MHC等位基因背景，在临床上作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗应用时具有明显的限制性，有鉴于此，本研究提供一种组合HBsAg免疫显性HLA-A1101限制性CTL表位和HBcAg的免疫显性HLA-A0201限制性CTL表位肽，同时提供一种表位诱导的特异性CTL效应细胞及其制备方法。

乙肝核心抗原（HBcAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）是HBV病毒的主要结构蛋白，其中核心抗原（HepatitisBcoreantigen,HBcAg）是机体HBV免疫重要的靶抗原，具有极强的免疫原性，能引起强烈的多克隆、特异性CTL应答，从而清除HBV感染。已有研究证实，比较那些慢性感染患者体内微弱、单一的T细胞反应，能成功清除HBV的急性感染患者中，靶向这两种抗原表位的多种特异性CD8⁺T淋巴细胞更容易被检测到，因而，靶向HBcAg和HBsAg特异性T淋巴细胞反应在控制HBV感染过程中起着非常重要的作用。

随着近年来对HBV基因型的研究发现，乙型肝炎基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗和预后密切相关。而我国主流HBV基因型与欧美地区存在巨大的差异，我国主要以HBV基因B/C型为主，而欧美地区以基因A/D型为主。基于基因型的差异与HBV感染结局以及临床抗病毒疗效存在着很大差异。

鉴于我国慢性HBV感染人群的HLA-A遗传背景以HLA-A1101和HLA-A0201为主，而且我国主流HBV基因型主要以B/C型为主，因此本发明采用不同于欧美地区基因型表位肽的序列。鉴于靶向HBcAg和HBsAg抗原表位特异性细胞毒性T淋巴细胞在病毒的清除和肝脏损害中起到至关重要的作用。本发明通过检测抗原特异性CTL增殖、细胞因子分泌以及特异性CTL频率检测（Tetramer染色）等方法，从有效激发特异性CTL应答角度出人意料地发现并充分证实了HBsAg（SMFPSCCCTK）联合HBcAg（FLPSDFFPSI）对于携带HLA-A1101或HLA-A0201基因个体的外周血有很强的激发CTL应答的能力，极大地拓宽了疫苗的使用人群，有望为覆盖我国一半以上的乙肝患者，提供有效的特异性CTL效应细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法。具体而言，本发明提供了一种治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞及细胞制剂、其制备方法、以及其应用组合物或试剂盒。

为了实现本发明的目的，一方面，本发明提供了一种CTL抗原复合表位肽，其氨基酸序列如SEQIDNo：3所示。CTL抗原复合表位肽SEQIDNo：3能对于携带HLA-A1101或HLA-A0201基因个体的外周血激发很强的CTL应答的能力，极大地拓宽了疫苗的使用人群，有望为覆盖我国一半以上的乙肝患者提供有效的特异性CTL效应细胞。可以通过本领域公知的技术制备SEQIDNo：3，包括但不限于固相合成、液相合成、基因工程表达、肽合成仪等。

所述HBsAg免疫显性HLA-A1101限制性CTL表位，由以下氨基酸序列组成：SMFPSCCCTK（SEQIDNo：1），即SK-10。所述HBcAg的免疫显性HLA-A0201限制性CTL表位肽，由以下氨基酸序列组成：FLPSDFFPSI（SEQIDNo：2），即FI-10。本发明所述组合的CTL抗原复合表位肽可以是SEQIDNo：1和SEQIDNo：2的组合，表位组合的方式优选两个序列的串联，两个序列片段之间可以有接头，并且根据需要，复合表位肽两端可以分别进行修饰。氨基酸的串联方法为现有技术，包括接头连接法、粘性末端互补法、同尾酶法、串联法等。在本发明中，具体所述的组合的CTL抗原表位肽的连接方式优选为直接串联。最优选的本发明所述CTL复合抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示：N-SMFPSCCCTK-FLPSDFFPSI-C，所述CTL抗原复合表位肽的氨基酸序列如SEQIDNo：3所示。

第二方面，本发明提供了上述CTL抗原复合表位肽在体外制备特异性CTL效应细胞中的用途。特征在于向成熟DC加入SEQIDNo：3多肽，将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入IL-2和IL-7共同孵育，获得特异性CTL效应细胞生物制剂。通过本领域公知的细胞分离技术可以从上述生物制剂分离得到所述特异性CTL效应细胞，所述细胞分离技术包括但不限于细胞流式分离。

第三方面，本发明提供了一种特异性治疗或预防乙肝的CTL效应细胞及制剂的制备方法。该方法包括从HLA-A1101或HLA-A0201慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到的PBMC（外周血单个核细胞），吸取外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL），加入DC细胞培养基，收获未成熟DC（树突状细胞），加入IL-1β、PGE-2、TNF-α诱导DC成熟。收获成熟DC后，加入SEQIDNo：3多肽。将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入IL-2和IL-7共同孵育，根据需要进行分离，获得特异性CTL效应细胞。通过本领域公知的细胞分离技术分离得到纯的特异性CTL效应细胞，所述细胞分离技术包括但不限于细胞流式分离技术。本发明的保护范围即包括通过上述方法制备得到的包含特异性CTL效应细胞的生物制剂，也包括分离纯化的特异性CTL效应细胞。

所述DC细胞培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中包含有1%－3%血浆，优选自体血浆，500U/ml－3000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、500U/ml－3000U/ml的白细胞介素-4（IL-4）。

优选地，用于诱导DC成熟的IL-1β、PGE-2、TNF-α使用量的范围分别是1-50ng/ml、1-10ug/ml、1-50ng/ml。收获成熟DC后，加入SEQIDNo：3多肽负载成熟DC的浓度范围是5-100ug/ml。将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏的负载肽的DC与PBL的比例范围是1:5-1:20。培养液中加入IL-2和IL-7的使用量范围是100-1000IU/ml、10-150ng/ml。

在本发明的优选实施方案中，采用密度梯度离心法从HLA-A1101或HLA-A0201慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到的PBMC，用RPMI-1640培养基重悬后，调整细胞密度至（2－8）X10⁶/ml，接种于培养板，置37℃、5%CO₂培养箱孵育，吸取未贴壁细胞即是外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL），于孔中加入DC细胞培养基，置37℃、5%CO₂培养箱诱导，收获未成熟DC，加入IL-1β、PGE-2、TNF-α诱导DC成熟。收获成熟DC后，调整细胞密度，铺板，加入SEQIDNo：3多肽。按照数量比将负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入IL-2和IL-7,共同孵育，期间适当补液并进行扩增，获得肽特异性CTL效应细胞。

第四方面，本发明提供了上述方法获得的治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞或细胞生物制剂。本发明还提供了包含所述治疗或预防乙肝的特异性CTL效应细胞或细胞制剂的组合物或试剂盒。

采用胞内因子染色试剂盒，分别检测各组负载肽的DC刺激的CTL中多肽特异性CD8⁺IFN-γ⁺T细胞频率，按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪进行检测，测定特异性CTL中分泌IFN-γ的T细胞所占的百分率。

本发明实现了意想不到的效果。本发明SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显提高，表现诱导分泌IFN-γ的能力加强。本发明SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL增殖明显增多。并且诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导后无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL频率均显著提高。

附图简要说明：

图1-2是本发明SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力比较图。无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图1D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图2D）诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于对照组，表现诱导分泌IFN-γ的能力最强。

图3-4是本发明SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL增殖比较图。无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图3D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图4D）诱导的特异性CTL增殖均较HBcAg对照肽组（见图3B\4B）、HBsAg对照肽组（见图3C\4C）以及Blank组（见图3A\4A）明显增多。

图5-6是本发明SEQIDNo：3多肽诱导的特异性CTL频率比较图。诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导后无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图5D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图6D）诱导的特异性CTL频率均显著高于对照组肽诱导的特异性CTL频率。

具体实施方式：

实施例1SEQIDNo：3肽的合成

通过本领域公知的方法，例如多肽固相合成法，或者通过多肽合成仪，或者参照现有技术公开的方法，可以制备SEQIDNO：3多肽片段。SEQIDNO：3所示的多肽，委托上海吉尔生化多肽有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，所述多肽的纯度高于95%，分子量与理论值相符。

SEQIDNO：3固相多肽合成的主要操作步骤如下：

1、树脂溶胀：将Wang-Resin树脂放入反应管中加入DMF（15ml/g），30min.2、

脱保护：弃掉DMF后加20%哌啶DMF溶液（15ml/g）,5min，弃掉后再加入20%哌啶DMF溶液（15ml/g），15min。3、检测：抽去哌啶溶液后，取十几粒树脂，用乙醇洗三次后加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴，置于105℃～110℃加热5min。4、洗涤：采用DMF（10ml/g）两次，甲醇（10ml/g）两次，DMF（10ml/g）进行顺序洗涤。5、缩合：加入大于三倍剂量的保护氨基酸、活化剂HBTU，二者均用尽量少DMF溶解，加入反应管后立即加入大于十倍剂量的NMM，反应30min。6、洗涤：采用DMF（10ml/g）一次，甲醇（10ml/g）两次，DMF（10ml/g）两次进行顺序洗涤。7、重复步骤2-6操作，依次连接氨基酸（从C端至N端顺序），最后洗涤一次：DMF（10ml/g）两次，甲醇（10ml/g）两次，DMF（10ml/g）两次，DCM（10ml/g）两次。8、裂解：配制含94.5%TFA、2.5%H₂O₂、2.5%EDT、1%TIS裂解液，裂解120min。9、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗涤6次后，常温风干。10、HPLC纯化：以水和乙腈做流动相，在流动相中加入0.1%的TFA，梯度从5%-85%，使用C18反相柱。

实施例2胞内因子染色检测复合抗原肽诱导的特异性CTL效应细胞分泌IFN-γ的能力

采用密度梯度离心法从HLA-A1101或HLA-A0201慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到的PBMC，用RPMI-1640培养基（购自美国Gibco公司，货号：31800-105）重悬后，调整细胞密度至3X10⁶/ml，接种于6孔培养板，置37℃、5%CO₂培养箱孵育120min，吸取未贴壁细胞即是外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte，PBL），于孔中加入DC细胞培养基，置37℃、5%CO₂培养箱诱导，第3天进行1/3换液，第5天收获未成熟DC（树突状细胞），加入终浓度为20ng/mlIL-1β、5ug/mlPGE-2、20ng/mlTNF-α诱导DC成熟。收获成熟DC后，调整细胞密度至1X10⁶/ml，按1X10⁶/孔铺板，分别加入终浓度为50ug/ml的SEQIDNo：3多肽或HBsAg抗原对照肽或HBcAg抗原对照肽。实验分组为负载SEQIDNo：3多肽的实验组、负载HBsAg抗原对照组、负载HBcAg抗原对照组以及不加任何肽的Blank组。于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/mlIL-2和50ng/mlIL-7,共同孵育1周，第2周进行同样处理，期间适当补液并进行扩增，于2个周期后获得肽特异性CTL效应细胞。

所述DC细胞培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基（购自美国Gibco公司，货号：31800-105），其中包含有3%自体血浆，1000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、1000U/ml的白细胞介素-4（IL-4）。

采用胞内因子染色试剂盒（美国BD公司，货号：555028），分别检测各组负载肽的DC刺激的CTL中多肽特异性CD8⁺IFN-γ⁺T细胞频率，按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪进行检测，测定特异性CTL中分泌IFN-γ的T细胞所占的百分率。

结果如图1-2所示，无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图1D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图2D）诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于其他3组，表现诱导分泌IFN-γ的能力最强。

实施例3CFSE标记检测HLA-A1101或HLA-A0201阳性健康个体经复合多肽诱导刺激前后的特异性CTL效应细胞增殖

采用密度梯度离心法从HLA-A1101或HLA-A0201健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，加入终浓度为5uM的CFSE溶液（将浓度为10mmol/L的CFSE储备液用1mL含0.1%HAS的PBS溶液稀释制得）重悬细胞，37℃孵育30min，用培养基洗涤1次后，再用含10%人AB血清的1640培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为1X10⁶/ml,平衡过夜后，接种于24孔板中，每孔1ml，分别加入终浓度为50ug/ml的SEQIDNo：3多肽（实验组）、HBsAg（HBsAg对照肽组）、HBcAg（HBcAg对照肽组），Blank组不加任何肽，于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/mlIL-2和50ng/mlIL-7,共同孵育1周后收集细胞进行流式细胞仪检测。

结果如图3-4所示，无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图3D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图4D）诱导的特异性CTL效应细胞增殖均较HBcAg对照肽组（见图3B\4B）、HBsAg对照肽组（见图3C\4C）以及Blank组（见图3A\4A）明显增多。

实施例4Tetramer染色法检测HLA-A1101或HLA-A0201阳性健康个体经复合多肽诱导刺激前后的特异性CTL效应细胞频率。

采用密度梯度离心法从HLA-A1101或HLA-A0201健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，按照前述方法培养细胞后经肽[SEQIDNo：3多肽（实验组）、HBsAg（HBsAg对照肽组）、HBcAg（HBcAg对照肽组），Blank组不加任何肽]刺激1周后，于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC与PBL共同孵育致敏，并于培养液中加入500IU/mlIL-2和50ng/mlIL-7,共同孵育1周后收集细胞获得肽特异性CTL，通过PE标记HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽、HLA-A0201/HBsAg、HLA-A0201/HBcAgTetramer染色（或HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽、HLA-A1101/HBsAg、HLA-A1101/HBcAgTetramer染色）后，利用流式细胞仪检测肽特异性CD8⁺CTL频率。

结果如图5-6所示，诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导后无论是HLA-A0201/SEQIDNo：3多肽（见图5D）还是HLA-A1101/SEQIDNo：3多肽（见图6D）诱导的特异性CTL频率均显著高于对照组肽诱导的特异性CTL频率。

SEQUENCELISTING

<110>申请人全称

<120>治疗或预防乙肝的细胞毒性T淋巴细胞及其制备方法

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>SK-10

<400>1

SMFPSCCCTK10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>FI-10

<400>2

FLPSDFFPSI10

<210>3

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<212>PRT

<213>CTL抗原复合表位肽

<400>3

N-SMFPSCCCTK-FLPSDFFPSI-C

1020