拟南芥抗性基因CIMT1、其编码蛋白及应用

摘要

本发明公开了拟南芥抗性基因CIMT1、其编码蛋白及应用。所述拟南芥CIMT1蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.6所示，或者是SEQ？ID？NO.6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具有镉抗性的序列。本发明在拟南芥中克隆了镉抗性基因CIMT1，其编码蛋白CIMT1可以被Cd所诱导，表达过量的CIMT1足以使拟南芥产生抗Cd的表型，这说明CIMT1在Cd的抗性调控中起到重要的作用。因此，CIMT1基因具有极大的潜力应用于培育具有抗镉特性的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及拟南芥抗性基因CIMT1、其编码蛋白及应用。

背景技术

目前，世界上的许多耕地都有轻度的重金属污染，这些重金属污染物主要有镉、铜、锌、镍、钴、铅、砷等。这些重金属污染主要是由于长期使用磷酸肥料、污水处理不利、工业废料的污染、农业灌溉的不科学造成的。植物体在面对这些重金属胁迫时一方面会产生活性氧(ROS)。在植物中，大多数金属产生活性氧(ROS)是重金属毒性的间接作用结果。这种间接的作用包括它们与抗氧化系统的反应，扰乱电子传递链，或者扰乱新陈代谢的必需元素的合成。植物体中，重金属胁迫所造成的另一个较严重的结果就是脂质的过氧化，这种脂质的过氧化可以导致生物膜的损伤。丙二醛(MDA)是生物膜中多不饱和脂肪酸的一种重要的分解产物，可以用来作为生物膜氧化胁迫的指示剂。重金属会导致植物体出现很多的病症。以镉为例，镉(Cd)是一种高毒性的重金属。镉处理会抑制植物的很多生理过程，比如光合作用、细胞延长、固氮和矿物营养吸收等。耕地中镉的正常含量不能超过100mg/kg。植物体处于镉胁迫时，就会出现光合效率降低、水分吸收降低以及营养吸收降低等性状。植物在含有过多的隔的土壤中，会出现萎黄病、生长抑制并最终导致植物体死亡。

玉米(学名：Zeamays)是重要的粮食作物和饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物，目前也是我国种植面积最大的农作物。现代科技条件下，玉米深加工被广泛应用于食品工业，医药工业和化学工业，具有广阔的应用前景。但是，随着耕地污染的加重，各种主要的农作物的产量，包括玉米在内都受到严重的影响。所以，研究玉米中的抗性基因及其功能，对于提高玉米以及其他粮食作物的增产具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供拟南芥抗性基因CIMT1、其编码蛋白及应用。

本发明所采取的技术方案是：

拟南芥CIMT1蛋白或其编码基因或含有该编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、转基因植物株系在培育抗逆植物中的应用，其中，所述拟南芥CIMT1蛋白如SEQIDNO.6所示，或者是SEQIDNO.6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或修饰后且具有提高植物抗逆功能的序列。

拟南芥CIMT1蛋白或其编码基因在抗逆植物辅助育种中的应用，其中，所述拟南芥CIMT1蛋白如EQIDNO.6所示，或者是SEQIDNO.6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或修饰后且具有提高植物抗逆功能的序列。

所述抗逆包括抗重金属污染、抗氧化胁迫、抗高温胁迫、抗低温胁迫、抗盐碱、抗旱、抗病虫害中的至少一种。

所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、砷、铬中的至少一种。

一种抗逆植物的培育方法，包括将拟南芥CIMT1基因转入受体植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与受体植物相比，其对逆境的抗性提高；所述拟南芥CIMT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，或者为SEQIDNO.5的同义密码子突变序列。

所述逆境包括：重金属污染、氧化胁迫、高温、低温、高盐碱、干旱、病虫害中的至少一种。

所述重金属包括镉、汞、金、银、铜、铁、铅、砷、铬中的至少一种。

拟南芥BOXS2顺式作用元件或其激活剂在培育抗逆植物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明在拟南芥中克隆了镉抗性基因CIMT1，它可以被Cd所大量诱导，表达过量的CIMT1足以使拟南芥产生抗Cd的表型，这说明CIMT1在重金属的抗性调控中起到重要的作用。因此，CIMT1基因具有极大的潜力应用于培育具有抗镉特性的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。

附图说明

图1为ZmOXS2b与ZmO2L1基因PCR产物的1％的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为玉米中ZmOXS2b与ZmO2L1的基因结构示意图(蓝色长方型：ANKYRIN重复序列；红色长方形：锌指结构域；绿色方框：多聚谷氨酰胺序列；倒三角：预测出核序列；黑色长条：AT3片段；所有蛋白编码区中并不存在内含子。数字表示从转录起始位点开始的DNA基因组位置)。

图3为qRT-PCR检测的ZmOXS2b与ZmO2L1的相对表达量(生长15天的玉米植株使其处于0或者200μMCdCl₂处理下，误差线表示三次独立实验的标准偏差)。

图4为滴板检测ZmOXS2b，ZmO2L1、AT3片段在粟酒裂殖酵母中的组成型表达(用转化空载体的酵母作为负对照，三角形表示，浓度依次十倍稀释)。

图5为拟南芥种子种植在水平放置的1/2MS与含有75μMCdCl₂浓度的1/2MS培养基上11天(每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测)。

图6为生长在1/2MS与含有75μMCdCl₂的1/2MS培养基上11天的拟南芥幼苗(5棵)的鲜重(每个株系不少于20棵幼苗被用来测量，误差线表示三次独立重复实验的标准偏差)。

图7为拟南芥种子种植在竖直放置的1/2MS与含有75μMCdCl₂浓度的1/2MS培养基上11天(每种转基因植株的三个独立的转基因株系被用来检测)。

图8为差异表达基因的韦恩图(括号上的蓝色数字表示上调的差异基因，括号下的黑色数字表示下调差异基因，括号中的数字是某一部分差异基因的总量，括号旁边的紫色的数字表示一个基因在C1部分中下调，但是在C2部分中上调)。

图9为C1、C2中差异基因交集聚类分析的热图(表达的差异用log2的值表示。红色表示与对照样品相比上调的基因，绿色表示与对照样品相比下调的基因)。

图10为8个差异基因的表达情况(柱状图表示转基因植株与野生型转录水平的差异倍数，误差线代表三次独立实验的标准偏差；Student’sttest的P值：胁迫处理的样品与非胁迫处理的样品的比较；a：0.01<P≤0.1；b：0.001<P≤0.01；c：0.0001<P≤0.001)。

图11为ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白激活含有BOXS2的启动子，蛋白质与启动子的互作检测图(侵染两天之后检测荧光强度LUC与rLUC的比值；黑色方框：预测的BOXS2序列；数字：相对于转录起始位点的DNA序列位置；BOXS2上方的数字：每个BOXS2的起始核苷酸位置；误差线：三次独立重复实验的标准偏差)。

图12为转基因植物WT(DEGs)与野生型的相对表达量的对比(含有8个不同的DEGs的35S::DEG重组载体分别转入野生型中，每种转基因植物中的3个独立的株系在1/2MS培养基中生长11天，纵坐标表明了这些差异基因在转基因植物中的相对表达量相比与在野生型中表达量的倍数，误差线表示两次技术重复的标准偏差)。

图13为拟南芥种子种植在水平放置的1/2MS与含有75μMCdCl₂浓度的1/2MS培养基上12天。三个独立的转基因株系被用来检测。本实验重复三次以上，代表性的结果被用来展示。

图14为生长在1/2MS与含有75μMCdCl₂的1/2MS培养基上12天的拟南芥幼苗(5棵)的鲜重(个株系不少于20棵幼苗被用来测量，误差线表示三次独立重复实验的标准偏差)。

图15为ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白结合CIMT1启动子中BOXS2附近的区域。用染色体免疫共沉淀(ChIP)的技术来检测ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白。根据CIMT1的启动子设计的引物组与ACT2的启动子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR检测。黑色小方框表示预测的BOXS2序列CTTCTTGTC；大括号表示qPCR检测的片段。数据显示的是三个独立生物学实验的平均值。误差线表示三次独立重复实验的标准偏差。

图16为ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白结合DEGs启动子中BOXS2附近的区域。用染色体免疫共沉淀(ChIP)的技术来检测ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白。根据8个选择的差异表达基因的启动子设计的引物组与ACT2的启动子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR检测。将每个样品(DNA与蛋白复合物)与α-Flag抗体或者没有抗体的对照(NoAb)共沉淀后所得的CP值标准化到其样品的inputDNA的CP值。黑色空心方框中的名称表示含有预测的BOXS2序列CTCTCGCTC(DEG11F1)，CTTCCTTTC(DEG21F1)，CTTCTTGTC(CIMT1F5)。数据显示的是三个独立生物学实验的平均值。误差线表示三次独立重复实验的标准偏差。

图17BOXS2顺式作用元件的序列信息，BOXS2的位置频率矩阵【共9个碱基】：A000200003；CX28793429；G011403601；T0C62695D2；备注：X＝15，C＝12，D＝13。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

在前期工作中，发明人在甜玉米中克隆了OXS2的两个同源基因ZmOXS2b与ZmO2L1。这两个基因都可以被重金属胁迫诱导。当它们在拟南芥中大量表达时，它们可以增强拟南芥抗镉(Cd)的能力。结合转录组测序结果及抗性分析，我们发现ZmOXS2b与ZmO2L1通过结合拟南芥中一个S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的甲基转移酶超级家族中的一个基因(AT5G37990)CIMT1启动子中的一段含有BOXS2的序列，直接激活这个基因，从而产生对重金属镉的抗性。下面我们将本次实验过程进行披露。

一、材料与方法

1、生物材料与处理：

本实验采用的玉米品种为中国岭南广泛种植的甜玉米。野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)采用Columbia(Col-0)生态型。

本实验基因的克隆与玉米的Cd处理均采用华南地区广泛种植的品种：丰甜1号。在玉米种子发芽9天(5天浸泡于水中，4天置于空气中)后，将种子转移至MS水状态培养基上生长。生长条件：22℃，16/8光周期。生长过程中，1天补充2次氧气，每次半小时。当玉米在水培养基上生长五天后，将所有的小植物分为两部分，一部分放置于含有200μMCd的MS水状态培养基中，一部分更换培养基正常生长，同时，开始以置换培养基的时间为零点，以此后的0小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时开始收集植株的叶片。每3个植株的叶片为一个样品，液氮速冻，-80℃储存。此材料用于玉米基因表达。

2、酵母的抗性检测

在长有酵母的EMM固体筛选培养基上挑选菌落，加入到含有3-5mlEMM液体筛选培养基的50ml离心管中，充分分散、混匀。250rpm，30℃，摇床上摇2-18小时(OD>0.3)。稀释母液至OD＝0.1，250rpm，30℃，摇床上摇4-8小时，使OD值略大于0.3，稀释调节OD值至0.3。以0.3OD的酵母液为母液，分别稀释到1/10，1/100，1/1000倍不同浓度梯度，各取3μL溶液，依次滴至含有不同浓度diamide，H₂O₂，Cd的EMM固体筛选培养基上。30℃倒置培养5-7天。

3、转基因拟南芥的获得

拟南芥种子用1比13的次氯酸钠消毒两次共8分钟，再用无菌水洗6次共六分钟，种于MS培养基。含有种子的MS培养基放入4℃冰箱春化3d，然后置于光照培养箱中以20℃16h、20℃8h为一光周期培养。培养10d后将幼苗移至营养土：蛭石：珍珠岩＝1：1：1的塑料盒中定期浇水培养。

运用电转法将带有ZmOXS2与ZmO2L基因的表达载体pCambia3300导入根癌农杆菌GV3101中。筛选抗利福平和卡那霉素的农杆菌进行菌落PCR。挑选阳性的菌落摇菌，扩配，用浸花法浸染拟南芥。在含100μg/mL除草剂(ppt)的1/2MS培养基上筛选T₀的种子(T₁代幼苗)，取T₁代和Col野生型植株,oxs2-1突变体与o2l1-1突变体的叶片提取DNA，以野生型与突变体为阴性对照进行PCR鉴定，选取阳性株。每种转基因拟南芥得到大约十株T1代植株，随机选取其中的3株作为后续研究的材料。提取转基因植株、野生型植株与突变体植株的RNA，以野生型和突变体为阴性对照进行RT-PCR鉴定，将RT-PCR鉴定的阳性植株的T₂代种子做为试验材料。

4、RNA转录组文库的构建和测序

WT(ZmOXS2b)与WT(ZmO2L1)转基因植物与野生型Col按照抗性检测相同的生长条件培养。在含有75μMCdCl₂的1/2MS培养基生长11天后，收集样品，液氮速冻，送至华大科技公司(BGI-Tech)测序。RNA的提取，cNDA文库的构建、测序以及信息的分析均有华大科技公司完成。

5、差异基因(DEGs)的筛选以及其聚类分析(热图)

基因表达的水平用RPKM(ReadsPerKbPerMillionReads)表示(Mortazavietal.,2008)。然后为我们用DEGs在转基因拟南芥(ZmOXS2b或者ZmO2L1)中的表达水平与在其野生型中的表达水平的比较来表示差异倍数。NOISeq方法被用来评估差异基因表达的显著性(Tarazonaetal.,2011)。聚类软件被用来进行基因表达模式的聚类分析(deHoonetal.,2004)。RNA-seq质量的评估、DEGs的搜寻以及DEGs表达模式的分析，由华大科技公司完成。

6、其它RNA-seq数据的分析

GO分析由华大科技公司完成。拟南芥基因组中BOXS2序列的分析由GENEDENOVO公司使用转录因子结合位点软件(transcriptionfactorbindingsite,TFBS)(http://tfbs.genereg.net)完成。

7、荧光素酶检测系统

所需材料：26℃，14/10光周期，生长5-6周的本氏烟草；侵染液：10mMMgSO₄,200μMacetosyringone,10mMMESKOH，调pH至5.6；双元荧光报告系统检测试剂盒(E1910，Promega)。

(1)含有不同载体的单克隆农杆菌GV3101菌株在含有利福平(10μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中28℃震荡培养24小时，使菌液达到一个较高的浓度。

(2)200μL的种子液接种至6ml含有利福平(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、MES(10mM)和acetosyringone(20μM)的新鲜LB培养基中，28℃培养小时(可根据样品的多少适当增加或者减少扩培液的体积)。

(3)4000rpm，10分钟离心收集菌液，侵染液重悬，室温放置3小时。

(4)简单重悬后，将不同的样品按照比例RLuc(内参):启动子::FLUC:需要检测的转录因子＝5μL:100μL:1mL混合。

(5)选择较嫩的烟草叶，手指顶住叶面表皮，从背面注射烟草。

(6)将注射完毕的烟草，黑暗，高湿度培养一晚。

(7)正常烟草生长条件，培养烟草至少30小时，收集烟草注射部位的叶片部位，测定荧光。

8、染色质免疫共沉淀(ChIP)

二、实验结果

1、玉米OXS2基因的克隆

以中国南方地区广泛种植的甜玉米丰甜1号为材料，提取其基因组，并以其基因组DNA为模板，设计引物克隆玉米中的ZmOXS2b与ZmO2L1基因，引物序列如表1所述。利用高保真DNA聚合酶(High-FidelityDNAPolymerase)PCR反应体系。取50μLPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所述。取目标条带进行测序，所得ZmOXS2b基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其所编码的蛋白序列如SEQIDNO.2所示；ZmO2L1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其所编码的蛋白序列如SEQIDNO.4所示。

表1PCR引物

2、玉米OXS2基因家族信息

如图2所示，ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白都含有两个锚蛋白重复序列和两个锌指结构域。

3、玉米OXS2家族基因响应重金属Cd诱导

为了检验ZmOXS2家族基因在玉米中的表达情况，我们用水培的方法将刚发芽9天的玉米植株种植在营养液中，一半的样品用含有200μMCdCl₂的MS营养液处理，一半在无CdCl₂的MS营养液中生长。在Cd处理后的0，3，6，12，24，48小时收集三棵植株的叶片。qRT-PCR的实验技术用来检测这两个基因的表达情况。如图3所示，在没有胁迫处理的条件下，ZmOXS2家族基因在不同的时间点表达的水平较一致，其中，ZmO2L1的表达水平较高。然而，在转移至含有CdCl₂的MS培养基的3小时后，ZmOXS2b与ZmO2L1的表达量与未处理的样品相比升高了大约两倍。随着处理时间的延长，ZmOXS2b的表达量逐步下降，然而ZmO2L1的表达量在Cd处理的第24小时达到最高值，48小时又有回落。综合来看ZmOXS2b与ZmO2L1可以被Cd瞬时激活。这表明，ZmOXS2家族基因有潜在的功能可能参与植物中重金属胁迫抗性的调控。

4、玉米OXS2家族基因在酵母中的抗性检测

我们克隆了ZmOXS2b和ZmO2L1基因全长，并克隆到酵母表达载体pART1中，转化酵母。如图4所示，在酵母中过量表达ZmOXS2b与ZmO2L1可以增强酵母对二酰胺的抗性。因为化学物质二酰胺能够直接引起氧化反应，所以ZmOXS2b与ZmO2L1有可能在氧化胁迫响应机制上起作用。

我们进一步在ZmOXS2b与ZmO2L1中筛选出一段AT3序列，并将这些小片段的DNA序列加上启动子ATG转入酵母表达载体pART1中，在酵母中验证其抗性。如图4所示，抗性检测结果表明，ZmOXS2b的AT3片段的转基因酵母具有抗二酰胺氧化胁迫的能力。因此，我们推测玉米OXS2家族基因的AT3片段与玉米的抗性相关，具有极大的潜力应用于培育具有抗逆性状的转基因作物中。

5、玉米OXS2家族基因在拟南芥中的抗性检测

为了进一步在植物中验证ZmOXS2家族基因在植物中的功能，我们将其转化拟南芥以进行抗性检测。通过花序侵染法，得到大约各10株以Col为背景的ZmOXS2b与ZmO2L1过表达转基因拟南芥的独立株系。同时还得到了各10株以oxs2-1为背景的ZmOXS2b过表达以及10株以o2l1-1为背景过表达ZmO2L1的转基因拟南芥的独立株系。通过分离比，筛选这四种转基因拟南芥的纯合体种子保存，并从中对每个转化随机挑选3个株系作为后续研究的材料。我们对作为研究材料12株独立株系进行RT-PCR验证，发现转基因均有一定量的表达。

随后，我们对这些转基因拟南芥WT(ZmOXS2b)和WT(ZmO2L1)以及它们的野生型对照进行了各种胁迫的处理，包括二酰胺(1,2mM)，Cd(75μM)，NaCl(100,150mM)，甘露醇(100,200mM)，ABA(1.5,3.0μM)，热激(37℃，3小时)和冷激(4℃，3小时)。如图5所示，在正常的生长条件下，野生型转基因株系生长状况一致。当用的75μMCdCl₂处理时，以野生型为背景过量表达ZmOXS2b与ZmO2L1的转基因拟南芥的叶子的伸长状态明显好于野生型。同时转基因植株的鲜重也明显高于野生型(图6)。当培养基在同种条件下垂直放置时，以Col为背景过量表达ZmOXS2b与ZmO2L1的转基因拟南芥的根的生长状态也明显的好于野生型(图7)。但是，对于其它上述的胁迫，WT(ZmOXS2b)和WT(ZmO2L1)并没有表现出比野生型更好的生长状态。

6、RNA-seq分析揭示差异表达基因

为揭示两个玉米基因ZmOXS2b和ZmO2L1在拟南芥中调控Cd胁迫的分子机制，我们对75μMCdCl₂的胁迫处理了11天的转基因和非转基因Col做了RNA-seq，分析转基因植株与野生型植物相比有哪些差异基因，它们起什么功能，并且它们富集在什么信号途径中。如图8所示，在胁迫条件下，转基因植株WT(ZmOXS2b)与野生型相比，总共有86个差异表达基因。其中61个差异基因上调，25个差异基因下调；转基因植株WT(ZmO2L1)与野生型相比，总共有69个差异表达基因。其中52个差异基因上调，17个差异基因下调。如图8所示，在不同的两组对比中，共同的差异表达基因为30个。在这30个共同差异表达的基因中有24个共同基因上调，5个共同下调，还有一个基因在一组中上调，另一组中下调。这30个共同差异表达的基因将是我们研究ZmOXS2家族基因的重点。

如图9所示，在两种对比中，共同的差异表达基因有30个，我们按照热图从上到下的顺序命名为DEG1至DEG30。其中有24个基因共同上调，5个共同下调。一个基因(AT5G39110)在WTVSWT(ZmOXS2b)中下调，在WTVSWT(ZmO2L1)中上调。30个差异表达基因中的14个基因注释与抗Cd胁迫的功能相关。总之，近半数差异表达基因涉及到植物体内的抗胁迫机制，这说明ZmOXS2家族基因可以通过调节诸多胁迫相关的基因来增强拟南芥的响应胁迫的能力。

7、差异显著基因的核实与筛选

考虑到ZmOXS2b与ZmO2L1过表达株系在Cd处理条件下表型较为相似，这表明被这两个基因调控的下游基因有可能为相同的基因，所以，我们以C1和C2的交集中所包含的30个差异表达基因为主要的研究目标。我们用qRT-PCR的方法来检测，与RNA-seq同一批材料中这30个DEGs的表达对比情况。表4所示，我们发现交集中的30个DEGs的表达对比趋势与RNA-seq所得的数值趋势较为一致，当然，具体数值也有不同。这可能是因为RNA-seq与qRT-PCR的技术原理存在较大的差异。我们根据qPCR的数值，从大到小重新排列差异表达基因。有趣的是，如表2所示，我们发现在两组对比中，表达差异较高的各10个基因中，有8个差异基因是相同的。它们是DEG7(AT5G26260)，DEG11(AT1G14960)，DEG19(AT5G48850)，DEG20(AT2G43535)，DEG21(AT4G13420)，DEG23(AT5G37990)，DEG24(AT5G48000)，DEG30(AT5G39110)。我们以这8个差异基因为后续的研究目标。

为了再次验证这8个差异基因，我们按RNA-seq的样品的生长、处理条件重新种植了三批植物材料。对于Cd处理的和未处理的植株，我们都进行RNA的提取，反转录，分析它们的表达。如图10所示，除了DEG30在ZmOXS2b过表达株系中的表达量低于野生型之外，其余的7个基因无论是否被Cd处理，其表达量在转基因株系中均高于野生型。大部分差异基因在Cd处理下的表达差异高于正常生长状态下。如表3所示，在Cd胁迫下，野生型Col中，这8个差异基因都被不同程度的激活(26-1680)。但是，转ZmOXS2b或ZmO2L1转基因过表达株系中，这8个基因的激活更强。总的来说，ZmOXS2家族基因很有可能直接的或者间接的激活一系列的基因，从而增强拟南芥的Cd抗性。

表2差异基因表达谱交集部分中30个差异基因的RNA-seq值和qPCR值

注：RNA-seq与qPCR的数值是差异表达基因在C1与C2对比组中的比值。基因号后面有对号的表示，其启动子中含有预测的BOXS2序列。带下划线的的DEG数字是我们选择来做抗性检测的基因。数字后带有星号的表示此基因的表达模式在RNA-seq中与qPCR中有所不同。

表38个差异基因的相对表达量及比值

注：野生型、WT(ZmOXS2b)、WT(ZmO2L1)转基因株系中，8个选择的差异基因的相对表达量以及它们的比值。数据为DEGs在野生型、WT(ZmOXS2b)、WT(ZmO2L1)转基因株系中相对于内参ACT1(AT2G37620)的表达量。变化倍数为生长在含有75μMCd的1/2MS与生长在不含有Cd的1/2MS的同种植物之间的对比。

8、ZmOXS2b与ZmO21L蛋白激活含有BOXS2的启动子

信息生物学分析表明，在筛选的8个差异基因中，DEG11，DEG21，DEG23的启动子(起始密码子之前的2000bp，包含5’UTR区域)含有预测的BOXS2顺式作用元件DEG23(CTTCTTGTC)(SEQIDNO.7)，DEG11(CTCTCGCTC)(SEQIDNO.8)，DEG21(CTTCCTTTC)(SEQIDNO.9)，其它的5个基因没有。BOXS2顺式作用元件的序列信息如图17所示。双元荧光素酶检测系统(Cat#E1910,Promega)被用来检测这8个启动子是否可以被ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白激活。我们将这8个差异基因的启动子(均为起始密码子之前的2000bp)克隆到含有萤火虫荧光蛋白(LUC)的穿梭载体中(pDEG::LUC)，萤火虫荧光蛋白位于启动子之后。含有双35S启动子控制的荧光蛋白(rLUC)载体(double35S::rLUC)被用作内部参照。同时，先前被用于转拟南芥的35S启动子调控的ZmOXS2b和ZmO2L1的载体(35S::ZmOXS2bor35S::ZmO2L1)在这个实验中被用来瞬时表达待检测的转录因子。所有的穿梭载体均采用pCambia3300，空载体则被用来作为对照。所有的载体均转入农杆菌后，按照35S::ZmOXS2b,pDEG::LUC,double35S::rLUC；35S::ZmO2L1，pDEG::LUC，double35S::rLUC；EV，pDEG::LUC，double35S::rLUC的分组方式分组。按照材料与方法的步骤，注射烟草，测定荧光信号强弱。如图11所示：只有含有BOXS2序列的启动子被激活。但是，这个实验尚并不能证明DEG11，DEG21，DEG23被ZmOXS2b与ZmO2L1直接激活。在拟南芥中，ZmOXS2b与ZmO2L1蛋白是否直接与含有BOXS2的启动子直接结合还需要进一步研究。

9、过表达CIMT1可以增强拟南芥抗Cd的能力

为了更好的研究我们选择的8个差异表达基因，我们将它们在拟南芥中使用35S作为启动子过量表达。每种转基因拟南芥，我们都获得了大约10个株系。每种3个独立的株系被选择用来做后续的Cd抗性检测。如图12所示，荧光定量PCR确定了在正常的生长状态下，与Col野生型相比，所有的基因在各自的植株中都有4至33倍的过表达。当这些转基因拟南芥在含有75μMCd的1/2MS上生长时，只有过表达DEG23(AT5G37990)的转基因拟南芥的生长状态好于非转基因野生型(图13)；鲜重也大于野生型(图14)，且这些转DEG23的植株具有同转ZmOXS2b或者ZmO2L1的转基因植株相当程度的生长优势。其它的七种转基因植株并未发现有明显的抗性。

仅仅表达过量DEG23就足以使拟南芥产生抗Cd的表型，这说明DEG23在Cd的抗性调控中起到重要的作用。DEG23编码一个S-腺苷-L-甲硫氨酸所依赖的甲基转移酶蛋白超家族中的成员，我们将其命名为CIMT1(CadmiumInducibleMethyltransferase1)。CIMT1基因的序列如SEQIDNO.5所示，其所编码的蛋白序列如SEQIDNO.6所示。我们推测很有可能过表达此基因在Cd的胁迫下，起到保护植物根的作用。在含有Cd的培养基中，转基因植物根的生长状态要明显好于野生型。这有可能是因为较强壮的根能够提供较好的营养吸收和重金属的解毒能力。

10、ZmOXS2b与ZmO2L1结合CIMT1启动子中BOXS2序列附近的区域

为了研究ZmOXS2b与ZmO2L1怎样激活CIMT1的启动子，我们使用pCambia1305为载体骨架构建了35S::ZmOXS2b:FLAGand35S::ZmO2L1:FLAG的重组载体，将它们转化Col野生型拟南芥，并得到每种9个独立的转基因株系。在进行染色体免疫共沉淀之前，我们对每种4株独立的株系进行Westernblot蛋白表达检测，选取蛋白质表达较高的株系进行后续的染色体免疫共沉淀实验以及荧光定量PCR实验(ChIP-qPCR)。我们选择的拟南芥的表型与不带标签过表达的转基因株系是一致的，都能明显增强拟南芥的Cd抗性。其他Westernblot蛋白表达检测为阳性的株系也都能明显增强拟南芥的Cd抗性。

我们在CIMT1的启动子上设计了6对引物用来扩增片段(F1-F6，图15)。其中，片段5(F5)、片段6(F6)含有BOXS2序列，F6还包含启动子序列。ACT2启动子中的片段引物作为负对照。如图15所示，qPCR的结果显示ZmOXS2b与ZmO2L1可以特异结合结合CIMT1启动子中BOXS2附近的区域。这表明，ZmOXS2b与ZmO2L1是通过直接结合CIMT1的启动子来调节CIMT1基因的表达。

为了进一步了解其它差异基因的调控原理与CIMT1是否一致，我们设计引物，检测了其他差异表达基因的启动子片段与ZmOXS2b和ZmO2L1蛋白的共沉淀的情况。我们在8个DEGs的启动子上的不同位置设计了16对引物(每个启动子2对)。其中，如图16所示，DEG11F1,DEG21F1与CIMT1F5这三个引物扩增的片段含有预测的BOXS2序列。ACT2被用作阴性对照。qPCR的结果表明ZmOXS2b与ZmO2L1都能结合DEG11，DEG21，CIMT1的启动子中含有BOXS2的序列。这说明，ZmOXS2b与ZmO2L1这两个锌指蛋白是通过结合这三个差异表达基因的启动子，从而激活这三个基因的表达，它们之间的相互作用是直接的。

以上实验表明，在拟南芥中过表达CIMT1基因可以使拟南芥产生抗Cd的表型，可以将其应用于培育具有抗镉特性的转基因作物中，从而提高粮食作物的产量。同时，在其他作物中寻求CIMT1相似的同源基因，会为我们将来创造抗胁迫的转基因农作物提供更多帮助。

<110>中国科学院华南植物园

<120>拟南芥抗性基因CIMT1、其编码蛋白及应用

<130>

<160>13

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1785

<212>DNA

<213>sweetcorn（ZmOXS2b）

<400>1

atgggggaagcctccgacgcggcggtagccgtatctgcgcggctcctggagctggcggcc60

gaagacgactctgcagcgctcggggacctccttgcggcacacccgtcgcttgctgacgag120

cccgcgccgtggtactccccggcgcgcggcgcggagcctatgaccccgctcatggtcgcg180

gcggcgtacgggtccgtggcctgcatcgatgtcctactctctccgccccaccaggccgac240

cccaaccgcgcctcaccgtcgtccctctccaccgcgcttcatcttgcagccggcggcggc300

gcctccgctgcgccggctgcggtatcccgtctcctagcttctggcgccgaccccacgttg360

gtcgaccacctccatcgccgaccgtccgacgtcgtcaccctcccacccaactcgctcccg420

ctcaagaaccaccttctctctctcctcggagggcgcaaggagtggccgccggatccctcc480

ctccccgacatcaagaatggtgcctacgcctccgacgacttccgcatgtactccttcaag540

gtgcgcgcgtgctcgcgcgcctactcccacgactggaccgagtgccccttcgtccacccc600

ggcgagaacgcgcggcggcgggacccgcgcatgtaccactacagctgcgtgccgtgccct660

gagttcaagaaaggggcggggtgccggaggggcgacatgtgcgagtacgcgcacggggtg720

ttcgagagctggcttcacccggcgcagtatcggacgcgtctgtgcaaggacggcatcggc780

tgcgcgaggcgcgtctgcttcttcgcgcacacgcctgaggagctccggccactctacgtg840

tcgtcggcagggtcgcgcagcgcgatggagatggcagcggcgatgggcatgggactgtct900

tcgccgggtgcgtcgttcacgccgccgctgtcaccttgcgccggcggaagcggcgtgacc960

ggcgcgtggccgcagcccaacgtgcccgcgctgtgcctccccgggagcgcggggaacctt1020

cacctgagccggttgcgtacttcgctgagcgcgcgcagcatggcagtggacgagctgctc1080

gcctcagcggattacgacgggctcgtcggatcgccagcctctgtgcggtcggcgagggga1140

aagacgctcgcgccatccaatcttgatgatctgttctccgcggagatggcgggcgccgcg1200

gcatctcactcgcctcggtacgcagaccagggcggctctgctttctcgccgacgcgtaag1260

gccgccatgctgaaccagttccagcagcagcagagcttgctgtctcctcgggccacggct1320

atccctgagccagcgtctccgatgagctccaggctgctcgcggcccttgcgcagcgagag1380

aagatgcagcagcagacgctgagaagcatgagctcccgtgaccttgcctctggcgcctcc1440

gtcctggttgggtcaccggttacctctagctggtccaaatggggaatccccccgagcaca1500

ccagattggggtgctgacgacgaggaactcggccgcctcaagcgatcctcgtcctttgag1560

ctccggagcggtgccaacggagatgagccggacctctcatgggtcaatacccttgtgaag1620

gagccgacgccggagaagccatccatcaacgggacaactgcaaaggagaccattgcttct1680

ttgagtgaggccgcgagtcatgaggacatcggcggcgaggacgacacagccggggtcatc1740

ggtggctggcttgaacagctccagctggatgagatggtagtctag1785

<210>2

<211>594

<212>PRT

<213>sweetcorn（ZmOXS2b）

<400>2

MetGlyGluAlaSerAspAlaAlaValAlaValSerAlaArgLeuLeu

151015

GluLeuAlaAlaGluAspAspSerAlaAlaLeuGlyAspLeuLeuAla

202530

AlaHisProSerLeuAlaAspGluProAlaProTrpTyrSerProAla

354045

ArgGlyAlaGluProMetThrProLeuMetValAlaAlaAlaTyrGly

505560

SerValAlaCysIleAspValLeuLeuSerProProHisGlnAlaAsp

65707580

ProAsnArgAlaSerProSerSerLeuSerThrAlaLeuHisLeuAla

859095

AlaGlyGlyGlyAlaSerAlaAlaProAlaAlaValSerArgLeuLeu

100105110

AlaSerGlyAlaAspProThrLeuValAspHisLeuHisArgArgPro

115120125

SerAspValValThrLeuProProAsnSerLeuProLeuLysAsnHis

130135140

LeuLeuSerLeuLeuGlyGlyArgLysGluTrpProProAspProSer

145150155160

LeuProAspIleLysAsnGlyAlaTyrAlaSerAspAspPheArgMet

165170175

TyrSerPheLysValArgAlaCysSerArgAlaTyrSerHisAspTrp

180185190

ThrGluCysProPheValHisProGlyGluAsnAlaArgArgArgAsp

195200205

ProArgMetTyrHisTyrSerCysValProCysProGluPheLysLys

210215220

GlyAlaGlyCysArgArgGlyAspMetCysGluTyrAlaHisGlyVal

225230235240

PheGluSerTrpLeuHisProAlaGlnTyrArgThrArgLeuCysLys

245250255

AspGlyIleGlyCysAlaArgArgValCysPhePheAlaHisThrPro

260265270

GluGluLeuArgProLeuTyrValSerSerAlaGlySerArgSerAla

275280285

MetGluMetAlaAlaAlaMetGlyMetGlyLeuSerSerProGlyAla

290295300

SerPheThrProProLeuSerProCysAlaGlyGlySerGlyValThr

305310315320

GlyAlaTrpProGlnProAsnValProAlaLeuCysLeuProGlySer

325330335

AlaGlyAsnLeuHisLeuSerArgLeuArgThrSerLeuSerAlaArg

340345350

SerMetAlaValAspGluLeuLeuAlaSerAlaAspTyrAspGlyLeu

355360365

ValGlySerProAlaSerValArgSerAlaArgGlyLysThrLeuAla

370375380

ProSerAsnLeuAspAspLeuPheSerAlaGluMetAlaGlyAlaAla

385390395400

AlaSerHisSerProArgTyrAlaAspGlnGlyGlySerAlaPheSer

405410415

ProThrArgLysAlaAlaMetLeuAsnGlnPheGlnGlnGlnGlnSer

420425430

LeuLeuSerProArgAlaThrAlaIleProGluProAlaSerProMet

435440445

SerSerArgLeuLeuAlaAlaLeuAlaGlnArgGluLysMetGlnGln

450455460

GlnThrLeuArgSerMetSerSerArgAspLeuAlaSerGlyAlaSer

465470475480

ValLeuValGlySerProValThrSerSerTrpSerLysTrpGlyIle

485490495

ProProSerThrProAspTrpGlyAlaAspAspGluGluLeuGlyArg

500505510

LeuLysArgSerSerSerPheGluLeuArgSerGlyAlaAsnGlyAsp

515520525

GluProAspLeuSerTrpValAsnThrLeuValLysGluProThrPro

530535540

GluLysProSerIleAsnGlyThrThrAlaLysGluThrIleAlaSer

545550555560

LeuSerGluAlaAlaSerHisGluAspIleGlyGlyGluAspAspThr

565570575

AlaGlyValIleGlyGlyTrpLeuGluGlnLeuGlnLeuAspGluMet

580585590

ValVal

<210>3

<211>1971

<212>DNA

<213>sweetcorn（ZmO2L1）

<400>3

atgggcgaccttgctgatctcgcgggtgcgggcgaggcggcgcgttcgcatctcgccgcc60

ggcggccagcgggacaggctggcggctctgctggagctcgcggcggccgacgacgtcgcg120

ggtttccgcgaggcgctcgcggggggaggcggcgagggcgacacggcggagctggcggac180

ggagtggggatgtggtacggccgaagcaaggcgtatgagccgcgcacgccgctgatggtc240

gccgcgacttacggcagcgtggaggtggtgtcgcttctgctcgcccttggttgtgtcgac300

gtcaaccggcgccccggcgtcgacggcgccactccgcttcactgcgccgcctccggcggc360

tcgcggaacgctgtggccgtcgtcaagctgctcctgggtgccggcgccgacccggtaact420

cccgactccgccggtcgcttgcctgccgacgtcatcttgtctccacctgcttcgcccgac480

gccttgggcgatctggagatgctccttggccgccgccgagggctcgctgtcgcgacctcg540

gtgccatcgctctcgtcgtccccgccgctctcgtcctcgccggatgagagcaacaggtcg600

ccgtcctcgcggtcgtcttcgttgtctccgattaccgtcgaccgtgccaagaaggagtac660

ccggtggatccgacgctgcccgacatcaagagccgcgtgtatgcctccgacgagttccgc720

atgttcgcgttcaaggtgcggccatgctccagagcctactcgcatgactggacagagtgt780

ccgttcgtgcaccctggcgagaacgcccgccgccgggatcctcgcaagcacccatacacg840

gcggtgccctgccccaacttccgccgccctggtggctgccccagcggtgatagctgcgag900

ttctcccatggtgttttcgagagctggctccacccgtcgcagtaccgcacaaggctctgc960

aaggagggcgcagcttgtgcccgccgcatctgcttcttcgcccacgatgaagatgagctc1020

cgccatgtgcctcacaatagtggtgcaggtctgctgtctccccgtgcctcttcatccatt1080

gacatgaccgctgctgctgctgctctagggcttctacctggatctcctaccaggcacttt1140

gtgccaccacctctgtcaccatctgctgccaacaatggtggaggtgctgctgctcattgg1200

ctccaaggtagcaggctgcgctcttctttcaatgcaagagatgcacaggctgatgacctt1260

ggctcgctcctggaatgggaatctcaataccttggagcgctcagcctcccacaaagcagc1320

cgatcccagccccgtctttctactggtctgactattcgtccaacagcagttgctccatcc1380

tacctcgaagagatgtatgcttcagacatggctatgtcgccaaggttcaccaatgaccaa1440

ggtcactcagtcttctcaccagcacacaaatcagctcttctaaacaagtttcatcatcaa1500

cagaagggccttttgtcgcctgtcaataccaacaggatgtactcaccaaggggccttgat1560

ccatcaattatccattctccatttggtggcatgtctcctcggtcccctcggactatggag1620

ctaacatctcccctaagtgtccgtgttggtgttggagctgctgttactccgcgtgatatg1680

ttggatcagttttcttccctgaacaagcaccaggtgccatctgtgggatcgccacggaat1740

cttaatgcctcatggggcaacattggtaccccaaagagtaaggtcgactggggtgtggac1800

gacgacgaactagtgcgcttgaggcaccctgtgcaacatggaaatacagaagaggaacca1860

gatgtgtcttgggtgcagtcactggtaaaccatgctgagctgaatggcaagaggggtgaa1920

atggcaagcatggcttctccatcgattaacaagcctgacctgagcttttag1971

<210>4

<211>656

<212>PRT

<213>sweetcorn（ZmO2L1）

<400>4

MetGlyAspLeuAlaAspLeuAlaGlyAlaGlyGluAlaAlaArgSer

151015

HisLeuAlaAlaGlyGlyGlnArgAspArgLeuAlaAlaLeuLeuGlu

202530

LeuAlaAlaAlaAspAspValAlaGlyPheArgGluAlaLeuAlaGly

354045

GlyGlyGlyGluGlyAspThrAlaGluLeuAlaAspGlyValGlyMet

505560

TrpTyrGlyArgSerLysAlaTyrGluProArgThrProLeuMetVal

65707580

AlaAlaThrTyrGlySerValGluValValSerLeuLeuLeuAlaLeu

859095

GlyCysValAspValAsnArgArgProGlyValAspGlyAlaThrPro

100105110

LeuHisCysAlaAlaSerGlyGlySerArgAsnAlaValAlaValVal

115120125

LysLeuLeuLeuGlyAlaGlyAlaAspProValThrProAspSerAla

130135140

GlyArgLeuProAlaAspValIleLeuSerProProAlaSerProAsp

145150155160

AlaLeuGlyAspLeuGluMetLeuLeuGlyArgArgArgGlyLeuAla

165170175

ValAlaThrSerValProSerLeuSerSerSerProProLeuSerSer

180185190

SerProAspGluSerAsnArgSerProSerSerArgSerSerSerLeu

195200205

SerProIleThrValAspArgAlaLysLysGluTyrProValAspPro

210215220

ThrLeuProAspIleLysSerArgValTyrAlaSerAspGluPheArg

225230235240

MetPheAlaPheLysValArgProCysSerArgAlaTyrSerHisAsp

245250255

TrpThrGluCysProPheValHisProGlyGluAsnAlaArgArgArg

260265270

AspProArgLysHisProTyrThrAlaValProCysProAsnPheArg

275280285

ArgProGlyGlyCysProSerGlyAspSerCysGluPheSerHisGly

290295300

ValPheGluSerTrpLeuHisProSerGlnTyrArgThrArgLeuCys

305310315320

LysGluGlyAlaAlaCysAlaArgArgIleCysPhePheAlaHisAsp

325330335

GluAspGluLeuArgHisValProHisAsnSerGlyAlaGlyLeuLeu

340345350

SerProArgAlaSerSerSerIleAspMetThrAlaAlaAlaAlaAla

355360365

LeuGlyLeuLeuProGlySerProThrArgHisPheValProProPro

370375380

LeuSerProSerAlaAlaAsnAsnGlyGlyGlyAlaAlaAlaHisTrp

385390395400

LeuGlnGlySerArgLeuArgSerSerPheAsnAlaArgAspAlaGln

405410415

AlaAspAspLeuGlySerLeuLeuGluTrpGluSerGlnTyrLeuGly

420425430

AlaLeuSerLeuProGlnSerSerArgSerGlnProArgLeuSerThr

435440445

GlyLeuThrIleArgProThrAlaValAlaProSerTyrLeuGluGlu

450455460

MetTyrAlaSerAspMetAlaMetSerProArgPheThrAsnAspGln

465470475480

GlyHisSerValPheSerProAlaHisLysSerAlaLeuLeuAsnLys

485490495

PheHisHisGlnGlnLysGlyLeuLeuSerProValAsnThrAsnArg

500505510

MetTyrSerProArgGlyLeuAspProSerIleIleHisSerProPhe

515520525

GlyGlyMetSerProArgSerProArgThrMetGluLeuThrSerPro

530535540

LeuSerValArgValGlyValGlyAlaAlaValThrProArgAspMet

545550555560

LeuAspGlnPheSerSerLeuAsnLysHisGlnValProSerValGly

565570575

SerProArgAsnLeuAsnAlaSerTrpGlyAsnIleGlyThrProLys

580585590

SerLysValAspTrpGlyValAspAspAspGluLeuValArgLeuArg

595600605

HisProValGlnHisGlyAsnThrGluGluGluProAspValSerTrp

610615620

ValGlnSerLeuValAsnHisAlaGluLeuAsnGlyLysArgGlyGlu

625630635640

MetAlaSerMetAlaSerProSerIleAsnLysProAspLeuSerPhe

645650655

<210>5

<211>1764

<212>DNA

<213>Arabidopsisthaliana

<400>5

aaaacaataaccaattctcctaaagtttgttttctctcgcctctaagaaacaatgttgag60

tgcctttttgggtcatgcgtcagctattgctatagcttcaccagtagtcagcattgtggg120

catcaggttattttcttgatttatacttttgggattatgtgaatattgtactctccctct180

ctctctctttctttttttttcaatgtcattttcagtttattgtttagcaggcatatgcat240

attcatctttttctttacatgttaattttaattaaggcgacaaacatatggagagatgaa300

acacgtgggggtcgttgaaaaacaaagagaaatgccaacatttcctcaatcgtttcctat360

gaacggtggtgatggtccgcacagttacatccacaattcctcttatcaagtaagtaacaa420

tgatataacaaatatctctttctatatattatatgatttgaaagctaattacgatactat480

agctaagattgtttgtatcacttgtgatatagaaagtagcgatagatggcgctaaagaaa540

agacaagtgaagccatcctaaaaaacctcgatctcgaactcttgaaccgtaattctgatg600

aaaatatcttaagaattgcggattttggttgttctattggacccaacacgttcgaagtag660

tccaaaatattatcgatacggtgaagcaaaaaaacctaaaagaaaacaatgcctatattg720

gtgctcctctcgagttccaagtttgcttcaatgatcaaccaaacaatgattttaacacac780

tttttagaacccaacctatctcttccaaacaagcatatttatcggttggagttccaggat840

ctttccatggtagagtattaccaaaaaatagcctccatatcggtcacattacctatgcgc900

tccactggctttctacagttccccaacatgtttgcgacaagaaatctccggcattgaata960

aaagctacattcaatgtaataatttagtagaggaagtgactgaagcttaccgggtccagt1020

ttaaaaaggacatgggagattttcttggggcaagagctgaagagcttgtttcgggcggat1080

tgatgatcctatcaggacaatgcttgcccgatggtgtccctaaggctttgacatggcaag1140

gggttgtgatcgatatgattggagattgtcttatggatatggctaaacaggtaaggaatt1200

tatttccatgacttttttcttatattctaagttttccaaacatgcatcatattttgtgct1260

tcaatgctttatcttccgtttgcttgctttattctttgtagggaattacgaccaaggaaa1320

agatcgaactgttcagtttgcccatatatattccgcatattagtgaattcaaggcagaaa1380

tagagcgaaatgaaaactttagtatcgagacaatggagaagataagtcatcctatggatt1440

ataagccactaaccaacgacttcatcacttccatgtttcgagccattctcaatacgatta1500

ttgaagaacactttggagatggtgtggtcaatgagctattcgatcgatttgctaagaagc1560

tcaacaagtacccaattgatttcaaaaggtgtaaaaagtatgtgaattattttatcgtgc1620

ttaaaagaaaataaaaatggagataatgacaaaactagttatgtcatcctcaatgttgtt1680

tcatcataaaaataaatcatgtcaattattgtgtgtgtgtgtgtatgtttaaattcaata1740

aaaatggtcaattgtgcgtgtttc1764

<210>6

<211>405

<212>PRT

<213>Arabidopsisthaliana

<400>6

MetLeuSerAlaPheLeuGlyHisAlaSerAlaIleAlaIleAlaSer

151015

ProValValSerIleValGlyIleArgArgGlnThrTyrGlyGluMet

202530

LysHisValGlyValValGluLysGlnArgGluMetProThrPhePro

354045

GlnSerPheProMetAsnGlyGlyAspGlyProHisSerTyrIleHis

505560

AsnSerSerTyrGlnLysValAlaIleAspGlyAlaLysGluLysThr

65707580

SerGluAlaIleLeuLysAsnLeuAspLeuGluLeuLeuAsnArgAsn

859095

SerAspGluAsnIleLeuArgIleAlaAspPheGlyCysSerIleGly

100105110

ProAsnThrPheGluValValGlnAsnIleIleAspThrValLysGln

115120125

LysAsnLeuLysGluAsnAsnAlaTyrIleGlyAlaProLeuGluPhe

130135140

GlnValCysPheAsnAspGlnProAsnAsnAspPheAsnThrLeuPhe

145150155160

ArgThrGlnProIleSerSerLysGlnAlaTyrLeuSerValGlyVal

165170175

ProGlySerPheHisGlyArgValLeuProLysAsnSerLeuHisIle

180185190

GlyHisIleThrTyrAlaLeuHisTrpLeuSerThrValProGlnHis

195200205

ValCysAspLysLysSerProAlaLeuAsnLysSerTyrIleGlnCys

210215220

AsnAsnLeuValGluGluValThrGluAlaTyrArgValGlnPheLys

225230235240

LysAspMetGlyAspPheLeuGlyAlaArgAlaGluGluLeuValSer

245250255

GlyGlyLeuMetIleLeuSerGlyGlnCysLeuProAspGlyValPro

260265270

LysAlaLeuThrTrpGlnGlyValValIleAspMetIleGlyAspCys

275280285

LeuMetAspMetAlaLysGlnGlyIleThrThrLysGluLysIleGlu

290295300

LeuPheSerLeuProIleTyrIleProHisIleSerGluPheLysAla

305310315320

GluIleGluArgAsnGluAsnPheSerIleGluThrMetGluLysIle

325330335

SerHisProMetAspTyrLysProLeuThrAsnAspPheIleThrSer

340345350

MetPheArgAlaIleLeuAsnThrIleIleGluGluHisPheGlyAsp

355360365

GlyValValAsnGluLeuPheAspArgPheAlaLysLysLeuAsnLys

370375380

TyrProIleAspPheLysArgCysLysLysTyrValAsnTyrPheIle

385390395400

ValLeuLysArgLys

405

<210>7

<211>9

<212>DNA

<213>Arabidopsisthaliana

<400>7

cttcttgtc9

<210>8

<211>9

<212>DNA

<213>Arabidopsisthaliana

<400>8

ctctcgctc9

<210>9

<211>9

<212>DNA

<213>Arabidopsisthaliana

<400>9

cttcctttc9

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atgggggaagcctccgac18

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ctagactaccatctcatccagctgg25

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atgggcgaccttgctgatct20

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ctaaaagctcaggtcaggcttgtta25