负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用

摘要

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，具体涉及负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用。本发明将废弃新鲜羊膜制备成微粒，采用无血清干细胞冻存液冻存在液氮中，在保留羊膜完整基质成份的同时，长期保留羊膜上皮细胞活性，而且可有效避免疾病传播。通过其收集制备的条件培养基能明显促进人表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的趋化、迁移，动物移植发现活性羊膜微粒可通过调节炎症反应、促进血管化、加快上皮化等多条途径来改善创面愈合，而且羊膜基质可直接作为真皮替代物诱导真皮再生，显著改善创面愈合质量。本发明制备的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基可为创面修复提供一种简单有效的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，尤其涉及一种负载羊膜 固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用。

背景技术

羊膜来源于分娩生产过程中的胎盘废弃组织，其结构与正常皮肤结构类 似，包括上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，不含血管、神 经、淋巴组织。羊膜作为外用覆盖物用于烧伤及角膜损伤保护已有100多年历 史，目前国内外均有商品化的去细胞羊膜问世(国内瑞济生物羊膜江西瑞济 生物工程技术有限公司，国外dHACM，MiMedx Group,Inc.)，并广 泛用于各种急、慢性创面的保护。

羊膜在创面修复中的应用主要集中在两方面：一是研究发现羊膜上皮细 胞具有干细胞特性，可以分泌多种细胞/生长因子，不仅能够诱导角质细胞迁 移促进创面上皮化，而且含有许多促血管生成因子，能够增强慢性创面或溃 疡的肉芽组织增生，加速创面愈合(Franz MG,Payne WG,Xing L,et al.The use  of amnion-derived cellular cytokine solution to improve healing in acute and  chronic wound models.Eplasty.2008；8:e21.)，因此目前有研究者采用羊膜上皮 细胞或羊膜来源细胞因子溶液改善创面愈合；另一方面羊膜天然的基底膜结 构和细胞外基质成分可以作为真皮替代物重建真皮支架，此外研究还发现羊 膜基质中含有多种促创面愈合的生物活性因子，能够为表皮细胞、成纤维细 胞的粘附、增殖提供丰富的营养因子，基于此，本发明人在前期研究中制备 了含表皮细胞、成纤维细胞的片状活性皮肤替代物(Huang G,Ji S,Luo P,Liu H, Zhu S,Wang G,Zhou P,Xiao S,Xia Z.Accelerated expansion of epidermal  keratinocyte and improved dermal reconstruction achieved by engineered amniotic  membrane.Cell Transplant.2013；22(10):1831-44.)，并在此基础上进一步制备了 可模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物(Ji SZ,Xiao  SC,Luo PF,Huang GF,Wang GY,Zhu SH,et al.An epidermal stem cells niche  microenvironment created by engineered human amniotic membrane.Biomaterials 2011；32(31):7801-11)，此研究成果也获得了中国专利CN201110148123.6，发 明名称为“模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物”， 授权公告号为CN102367434B。

然而上述单独采用羊膜上皮细胞或脱细胞羊膜基质用于改善创面愈合的 方式均难以同时有效发挥羊膜分泌活性因子和羊膜天然基质的双重优势。

到目前为止，也未曾有将羊膜制备成同时含羊膜上皮细胞及羊膜基质的 活性羊膜微粒构建活性真皮替代物的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时有效发挥羊膜分泌活性因子和羊膜天 然基质的双重优势的羊膜微粒；本发明的另一目的在于提供含有该羊膜微粒 的条件培养基，以及该羊膜微粒在制备真皮替代物中的应用

本发明的主要技术方案如下：

本发明通过获取活性羊膜后剥离去除纤维母细胞层和海绵层保留完整的 羊膜上皮细胞和羊膜基质(基底膜和致密层)，在此基础上，制备微载体大小 的活性羊膜微粒，并采用无血清干细胞冻存液冻存在液氮中，以长期保存羊 膜微粒活性，同时在半年后对羊膜进行重新检测，选择肝炎病毒抗体、梅毒 抗体及HIV均为阴性的羊膜进行临床应用，可在有效保留羊膜上皮细胞活性 及天然基质成分的同时，避免疾病传播。

本发明制备的含羊膜上皮细胞的活性羊膜微粒不仅保留了羊膜干细胞的 分泌特性，同时能够发挥羊膜天然基质作为真皮替代物的作用，可显著促进 创面愈合，改善创面修复质量。

本发明的第一方面，提供了一种负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微 粒，所述的羊膜微粒的构建方法包括以下步骤：

A、羊膜的获取

经医院伦理委员会批准，产妇知情同意，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体 及HIV均为阴性的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，在无菌条件下钝性分离绒毛膜， 剥离去除纤维母细胞层和海绵层，经含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、 0.25μg/ml两性霉素的phosphate buffered saline(PBS)浸泡冲洗3×15min，将羊 膜切割成4-10cm×2-8cm(较优为8×6cm)大小的片状羊膜。

B、活性羊膜微粒的制备、冻存、复苏

将上述制备的片状羊膜经微粒皮切割机制备成300-600μm大小的羊膜微 粒，1000rpm离心十分钟，去除上清，以微粒1ml:5ml无血清干细胞冻存液 (CTS^TMSynth-a-Medium,life technology)为比例加入相应干细胞冻 存液，将含有冻存液的羊膜微粒分别放入不同规格大小(如3.8ml、1.8ml等) 的冷冻管中，将冷冻管放置于液氮中长期保存备用。

根据创面应用需要取出上述冷冻管复苏，置37℃水浴充分解冻1分钟， PBS反复冲洗离心3次。

本发明的第二方面，提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜 微粒在制备条件培养基中的应用。

所述的条件培养基，是指经细胞培养一段时间后获取的含细胞分泌的各 种因子的培养基。

进一步地，本发明提供了一种负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒 的条件培养基，其制备方法如下：

液氮中取出冻存管后迅速置于37℃水浴充分解冻1分钟，PBS反复冲洗 离心3次后去除上清，以微粒1ml：6ml DMEM培养基为比例加入六孔板中， 在37℃、5％CO₂培养箱继续孵育48h，收集上清，1000rpm离心十分钟，取 上清经0.2μm过滤器过滤后-80℃冰箱冻存备用。

由此获得本发明的活性羊膜微粒条件培养基(conditioned medium，简称 CM)。

本发明制备的负载固有干细胞的活性羊膜微粒及其条件培养基优点如 下：

1)羊膜微粒保留了活性羊膜上皮细胞及完整的羊膜基质结构，不仅能够 分泌多种促创面愈合的活性因子，同时其天然的细胞外基质可作为真皮替代 物诱导真皮重建，而且羊膜微粒大小为300-600μm，移植创面后，创面血浆能 较好渗透至羊膜微粒间，保证羊膜上皮细胞存活。此外最近研究发现羊膜上 皮细胞具有干细胞的多项分化潜能，而且无免疫源性和致瘤特性，因此被用 于各种组织的再生和修复(Toda A,Okabe M,Yoshida T,et al.The Potential of  Amniotic Membrane/Amnion-Derived Cells for Regeneration of Various Tissues.J  PharmacolSci 2007；105(3):215–228.)，包括皮肤附属器毛囊、皮脂腺等的重建 (Knezevic V.Differentiation potential of rat amnion.JAnat 1996；189(1):1-7. Fliniaux I,Viallet JP,Dhouailly D,et al.Transformation of amnion epithelium into  skin and hair follicles.Differentiation 2004；72(9-10):558-65.)，本发明制备的活 性羊膜微粒有望在皮肤附属器重建修复中发挥作用。

2)采用无血清干细胞冻存液冻存羊膜微粒，可在保留羊膜完整基质成份 的同时，长期保留羊膜上皮细胞活性并可制备富含多种活性因子的条件培养 基，而且避免了含血清冻存液保存可能导致的疾病传播，此外在半年后可对 羊膜组织重新检测，进一步排除可能存在的传染性病毒(肝炎病毒、梅毒、 HIV病毒)，可有效防止疾病传播。

3)本发明中活性羊膜微粒及其条件培养基制备方法简单，临床应用便捷， 而且羊膜上皮细胞活性容易长期保存，避免了羊膜上皮细胞分离培养或脱细 胞羊膜基质的制备处理过程，可有效防止细胞分离培养或羊膜基质制备中导 致的细胞、基质损伤，提高了活性羊膜的应用效率，促进了实验室到临床转 化。

本发明的第三方面，提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜 微粒在制备创面修复移植材料或软组织缺损填充物中的应用。

本发明提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒在制备真 皮替代物中的应用。

本发明还提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒条件培 养基在细胞培养中的应用。

所述的细胞培养，具体是指用于创面修复细胞培养中的应用，如人表皮 细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。

体外实验表明，活性羊膜微粒冻存6个月、2年后进行复苏，复苏后活性 羊膜微粒中羊膜上皮细胞活性分别为73.4±3.4％，66.35±3.83％，明显高于片 状羊膜(55.63±2.37％，43.93±2.89％，P＜0.01)。同时活性羊膜微粒条件培养 基能明显促进人表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的增殖、迁移，明显高于 DMEM培养基组(P<0.01)。此外糖尿病小鼠创面(db/db糖尿病小鼠)移植 实验发现，本发明制备的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒可以通过 调节炎症反应、促进血管化、加快上皮化等多条途径来改善创面愈合，而且 羊膜基质可以作为真皮替代物重塑真皮支架，创面愈合后不仅外观平整、柔 软，收缩程度轻，而且新生表皮出现明显乳突状结构，羊膜微粒逐步降解诱 导真皮重建，新生真皮层胶原纤维排列规则、有序，可明显改善创面愈合质 量。

附图说明

图1为本发明中活性羊膜微粒和片状羊膜冻存6个月、2年后复苏，Hoechst/PI 染色后荧光镜下观察羊膜上皮细胞活性。(上排是片状羊膜，下排是活性微粒 羊膜)

图2为采用活性羊膜微粒条件培养基体外培养人表皮细胞(图2A)、成纤维 细胞(图2B)、内皮细胞(图2C)，与10％FBS组(10％胎牛血清组)和DMEM 组比较对三种细胞迁移能力的影响。

图3为db/db糖尿病小鼠全层皮肤缺损移植LMAM组(活性羊膜微粒组)、 DMAM(去细胞羊膜微粒组)及空白对照组的创面愈合过程大体观。

图4为db/db糖尿病小鼠全层皮肤缺损移植术后28天及60天病理切片HE染 色图，其中A为活性羊膜微粒移植组(LMAM)，B为去细胞羊膜微粒移植组 (DMAM)，C为空白对照组，D为移植两个月后活性羊膜微粒逐渐降解重塑 真皮。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅 限于此。

实施例1.制备本发明活性羊膜微粒(LMAM)

1、羊膜的获取

经医院伦理委员会批准，产妇知情同意，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体 及HIV均为阴性的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，在无菌条件下钝性分离绒毛膜， 剥离去除纤维母细胞层和海绵层，经含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、 0.25μg/ml两性霉素的phosphate buffered saline(PBS)浸泡冲洗3×15min，将羊 膜切割成8×6cm大小的片状羊膜。

2、活性羊膜微粒的制备、冻存、复苏及活性测定

将8×6cm大小的片状羊膜经微粒皮切割机制备成300-600μm大小的羊膜 微粒，以每片8×6cm大小的片状羊膜制备的微粒为一单位加入3.2ml无血清 干细胞冻存液(CTS^TMSynth-a-Medium,life technology)放入冷冻管 (规格3.8ml)中，或者均分为两单位分别加入1.5ml无血清干细胞冻存液 (CTS^TMSynth-a-Medium,life technology)放入冷冻管(规格1.8ml) 中，将冷冻管放置于液氮中长期保存备用。根据创面应用需要取出上述冷冻 管复苏，置37℃水浴充分解冻1分钟，PBS反复冲洗离心3次。

取复苏后活性羊膜微粒经以Hochest 33342(10mg/ml)和PI(10mg/ml)双 染后荧光显微镜下观察计算羊膜细胞活性。

结果见图1，分别为片状羊膜、活性羊膜微粒冻存前及冻存6个月、2年 进行复苏后的活性比较，结果显示复苏后活性羊膜微粒中羊膜上皮细胞活性 分别为73.4±3.4％，66.35±3.83％，明显高于片状羊膜(55.63±2.37％， 43.93±2.89％，P＜0.01)。

实施例2.活性羊膜微粒条件培养基制备

1、活性羊膜微粒条件培养基(conditioned medium，简称CM)制备

液氮中取出冻存管后迅速置于37℃水浴充分解冻1分钟，PBS反复冲洗 离心3次后去除上清，以微粒1ml：6ml DMEM培养基为比例加入六孔板中， 在37℃、5％CO₂培养箱继续孵育48h，收集上清，1000rpm离心十分钟，取 上清经0.2μm过滤器过滤后-80℃冰箱冻存备用。

2、Transwell检测CM对表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的趋化、迁移 影响

应用8μm孔径大小的Transwell迁移小室(Corning,USA)检测CM对人表 皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的趋化、迁移能力。分别将人表皮细胞、成 纤维细胞、内皮细胞以5×10⁵个细胞/ml的浓度接种于Transwell上室，相应下 室中加入500μL活性羊膜微粒条件培养基CM，同时以10％FBS(10％胎牛血 清)、DMEM培养基作为对照组，常规细胞培养箱中培养24h后，进行细胞 固定、结晶紫染色。在100倍显微镜下每孔随机取5个视野，照相、计数分 析迁移跨膜的细胞数量。

如图2所示，可见活性羊膜微粒条件培养基可显著趋化表皮细胞、成纤 维细胞、内皮细胞的迁移，效果与10％FBS组无明显差异，均明显高于DMEM 培养基组(p<0.01)。

实施例3.动物实验

取db/db糖尿病小鼠15只(由上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供)， 雌雄不限，常规1％戊巴比妥钠腹腔麻醉，酒精消毒。于每只db/db糖尿病小 鼠背部两侧分别制作直径为1.2cm的圆形全层皮肤缺损创面，将db/db糖尿病 小鼠创面(30个)随机分为LMAM组(实施例1制备得到的活性羊膜微粒组)、 DMAM组(去细胞羊膜微粒组，详细制备方法见文献Ji SZ,Xiao SC,Luo PF, Huang GF,Wang GY,Zhu SH,et al.An epidermal stem cells niche  microenvironment created by engineered human amniotic membrane.Biomaterials 2011；32(31):7801-11)及空白对照组，每组10个创面。

LMAM、DMAM经常规解冻复苏后，PBS反复冲洗离心3次后去除上清， 将微粒均匀滴涂在创面上形成一层，空白对照组创面不做任何处理。三组创 面应用凡士林纱布覆盖保护创面，用4-0号线将凡士林纱布间断缝合固定于创 周皮肤。术后每隔7天进行观察拍照，通过图像分析软件Image J比较各组创 面愈合率(创面愈合率＝(初始创面面积-残余创面面积)/初始创面面积)，并定 期取材行组织学观察。

研究结果发现，移植后7天LMAM组创面愈合速度即高于DMAM组 (55.67±4.99％vs.50.98±5.56％,p<0.05)和空白对照组(55.67±4.99％ vs.35.93±5.76％,p<0.001)。移植后3周，LMAM组创面基本愈合，而DMAM 组和空白对照组还残留创面(结果见图3)。

移植后28天取材切片行HE染色，可见LMAM组和DMAM组羊膜微粒 充填真皮基质，表面新生表皮覆盖，LMAM组新生表皮出现乳突状结构，而 在DMAM组和空白对照组未观察到此结构(图4A、B、C)。移植后两个月 羊膜微粒开始逐步降解重建自体真皮(图4D)。

实验结果表明，本发明制备的活性羊膜微粒冻存复苏后保持了较高的细 胞活性，通过其收集制备的条件培养基能明显促进人表皮细胞、成纤维细胞、 内皮细胞的增殖、迁移，同时活性羊膜微粒能够显著促进糖尿病小鼠创面的 血管化，加速创面愈合，此外羊膜基质可直接作为真皮替代物诱导真皮再生， 其可为创面修复提供一种可供选择的活性皮肤替代物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行 业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明 书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本 发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围 内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。