一种高产碱性蛋白酶的克劳氏芽孢杆菌

摘要

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种高产碱性蛋白酶的克劳氏芽孢杆菌。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变方法获得的突变株，保藏编号为CCTCC？NO：M2015430。所述突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，发酵过程中生物量显著增加，500mL摇瓶发酵酶活高达1050？U/ml,较出发菌提高了约5.8倍，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产碱性蛋白酶的克劳氏芽孢杆菌及其应用。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种最适pH为9～11的蛋白酶类，其活性中心为ser，属 于丝氨酸蛋白酶，它不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能，分子 量约为27kDa。我国的碱性蛋白酶研究较国外晚，国内工业生产蛋白酶的菌株多是经枯草芽 孢杆菌2709选育而来。碱性蛋白酶是工业酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销量 的60％左右(Mala B.R.等，1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews)，其能够广 泛应用于洗涤、食品、医疗、酿造、丝绸和制革等行业，尤其是作为市场上畅销的洗涤和皮 革脱毛添加剂，有着良好的市场价值。

碱性蛋白酶作为洗涤添加剂，能有效提高洗涤剂的去污效果，对血渍、汗渍、奶渍、油 渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果；应用于皮革脱毛能够将浸碱以后的脱毛、脱碱两道工 序合并为一道工序,有利于进一步简化生产。但目前市场上的碱性蛋白酶产品普遍被诺维信和 杰能科两大酶制剂国际公司垄断，其具有酶活水平高、溶解速度快以及与洗涤剂配伍时耐受 性强的优点。国内酶制剂企业要扩大在洗涤酶领域的市场份额，除了加速开发出酶学性能优 良的新型碱性蛋白酶外，也需要提高碱性蛋白酶的产量，从而降低生产成本，提高国内碱性 蛋白酶产品的竞争优势。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产碱性蛋白酶的克劳氏芽孢杆菌(Bacillus  clausii)菌株。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变的方法筛选出的突变株，能大大提高碱 性蛋白酶的产量，为低成本、规模化生产碱性蛋白酶奠定了基础。

本发明一方面涉及一种克劳氏芽孢杆菌TDB1-4(Bacillus clausii TDB1-4)，已于2015年 7月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO： M2015430。

本发明一方面涉及包含上述克劳氏芽孢杆菌的微生物制剂。

本发明还涉及上述克劳氏芽孢杆菌在碱性蛋白酶生产中的应用。

本发明通过紫外诱变的方法获得了一株高产碱性蛋白酶的克劳氏芽孢杆菌突变株。所述 突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，发酵过程中生物量显著增加，500mL摇瓶发酵酶活高 达1050U/ml,较出发菌提高了约5.8倍，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没 有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌 握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T 25327-2009)。

2、酶活单位的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min 水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份 市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH 值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min， 加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先 加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液， 加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm 比色皿测定吸光度。

实施例1 克劳氏芽孢杆菌TDB1的紫外诱变与筛选

1.1菌悬液制备

将生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌TDB1(保藏编号CCTCC NO:M2015429)在含1μg/mL 红霉素的牛肉膏蛋白胨斜面(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，pH 7.2)上 划线接种，37℃培养48h；加入5mL 0.9％生理盐水，将斜面上的菌全部冲洗下来，转入无 菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15mL 离心管，6000rpm离心3min收集菌体；去上清，用10mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两 次，最后调整细胞浓度至OD₆₀₀＝0.2。

1.2紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为 OD₆₀₀＝0.2的菌悬液10mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在 垂直距离为15cm处，分别搅拌照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，盖上皿盖，关闭紫 外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.9％生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1～10^-5；取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布LB(Na₂CO₃调pH9.0)固体平板，每个稀释度涂布三 个平板，均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释涂平板作对 照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。

统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平板上长 出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌 落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

经计算，不同紫外诱变剂量下克劳氏芽孢杆菌TDB1的致死率如表1所示。

表1：紫外线诱变致死率

从表1的数据可以看出，菌悬液经紫外照射5s后致死率就达到95％以上，但因时间太短 不便于控制，因此最终确定诱变时间为10s。

1.3透明圈初筛

紫外照射处理10s后，菌悬液中活细胞浓度约10⁶/mL；梯度稀释2*10³倍，在每个含酪 素的固体培养基平板(含红霉素1μg/mL)上均匀涂布100μL上述菌悬液；用黑布或报纸包 好，37℃培养24h，选出透明圈明显比周围其他菌落大的菌落；重新点种含酪素的固体培养 基平板(含红霉素1μg/mL)并点种出发菌株克劳氏芽孢杆菌TDB1作对照，37℃培养过夜， 再比较透明圈大小，并去掉透明圈与对照相差不大的。最终，申请人获得6株传5代后透明 圈的直径仍明显比出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB1大的突变菌株，分别命名为劳氏芽孢杆菌 TDB1-1，TDB 1-2，TDB 1-3，TDB 1-4，TDB 1-5，TDB 1-6。

1.4摇瓶复筛

挑取上述6株突变菌株的单菌落分别接种于100mL LB液体培养基中(pH9.0)，37℃培 养72h，，同时以出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB1作为对照。分别取各菌株的发酵上清液进行蛋 白酶酶活测定，结果显示，突变株克劳氏芽孢杆菌TDB1-4的发酵酶活最高，达1050U/ml， 是出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB1发酵酶活的5.8倍，取得了意料不到的技术效果。

实施例2 克劳氏芽孢杆菌TDB1-4产碱性蛋白酶的酶学性质分析

2.1最适pH分析

分别用pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的缓冲液稀释突变株克劳氏芽孢 杆菌TDB1-4和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB1的发酵上清液，在40℃条件下测定发酵上清液 的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得 的突变株克劳氏芽孢杆菌TDB1-4产碱性蛋白酶的最适作用pH值为11.5，与出发菌株相同。

2.2最适温度分析

分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，pH 10.5的条件下测定突变株克 劳氏芽孢杆菌TDB1-4和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB1发酵上清液的酶活，以最高酶活为 100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变株克劳氏芽孢 杆菌TDB1-4产碱性蛋白酶的最适作用温度为60℃，与出发菌株相同。

综上，与出发菌相比，本发明通过紫外诱变获得突变菌株克劳氏芽孢杆菌TDB1-4，能大 大提高碱性蛋白酶的产量，其摇瓶发酵酶活是出发菌的5.8倍，同时，其产碱性蛋白酶的酶 学性并未发生改变。

申请人已于2015年7月5日将克劳氏芽孢杆菌TDB1-4(Bacillus clausii TDB1-4)保藏 于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015430。