生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱检测方法

摘要

本发明涉及生物检材中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱检测方法，包括如下步骤：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。本发明的检测方法简单高效、快速灵敏、准确度高，具有广泛的实用性，能够应用于生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。

说明书

技术领域

本发明属于生物样品检验领域，具体涉及一种生物检材中钩吻素甲和钩吻素 子的液相色谱-串联质谱检测方法。

背景技术

钩吻,又名大茶药、断肠草等,是马钱科胡蔓藤属的全草，产于浙江、福建、 广东、广西、贵州、云南等地。钩吻全株有毒，根、茎、叶均含有生物碱，以 根部含量最高，根皮最高，该类植物因其是毒性极强，多用于外用，应用不当 或误服可致中毒，有时还可致命。国内钩吻主要毒性成分是钩吻碱，有从钩吻中 可以分离出钩吻素子(Koumine)、钩吻素甲(Geliemine)、钩吻素寅 (Kouminicine)、钩吻素卯(Kouminidine)、钩吻素辰(Kounidine)、钩吻 素丙(Sempervirine)、钩吻素丁(Koumicine)和钩吻素戊(Koumidine)等 生物碱。因产地不同所含的生物碱的种类和含量也略有差异,广东产的钩吻根中 曾分离得到钩吻素子、卯、丁和戊；而福建产的分离到了钩吻素甲、丁、子、卯、 戊、己等生物碱。其中钩吻素子含量最高。国外钩吻所含化学成分与国内的钩 吻存在差异。如北美产钩吻除与国内钩吻某些相同的化学成分外含量相差很大， 以钩吻素甲为主要成分含量最高。钩吻中毒主要抑制延髓呼吸中枢，并抑制脑和 脊髓的运动中枢。临床表现以呼吸系统、神经系统症状为主，可出现呼吸衰竭和 呼吸肌麻痹，是钩吻中毒最常见的死因。

钩吻素子(左)和钩吻素甲(右)结构式如下：

发明内容

本发明提供一种生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)检验方法，适用于生物样品(血、尿、肝、肾等)中钩吻素甲和钩 吻素子的定性定量检验，也适用于体外样品和可疑物证的检验。

本发明的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物 样品进行提取、净化及浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行检测，以保留时间 (Rt)、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标 准品响应值比较，根据峰面积之比，用外标法进行定量分析。

具体的，本发明一方面的目的在于提供一种生物检材中钩吻素甲和钩吻素子 的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)样品前处理：取生物液体样品1.0mL～2.0mL或生物组织样品1.0g～2.0g剪 碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入5.0mL～ 10.0mL乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min；分离有机相后，加有机溶剂进 行第二次提取，合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干；残渣用500μL～1000μL 初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；

b)样品分析：

色谱柱：kinetex C18；进样量：1μL～10μL；流动相：A为含0.1％甲酸的10mM 甲酸铵【本发明0.1％甲酸的10mM甲酸铵是指：浓度为10mmol/L的甲酸铵水溶 液中甲酸的体积分数为0.1％，以下不再赘述】，B为甲醇；梯度洗脱【本发明中 的A、B均为体积分数，以下不再赘述】：0.2min，A为95％，B为5％；3.0min，A 为5％，B为95％；5.0min，A为5％，B为95％；5.1min，A为95％，B为5％；7.0min， A为95％，B为5％；流速为0.5mL/min；

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(ESI+)；检测方式：多反应监测 (MRM)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；雾化气压力：55psi；气帘气 压力：50psi；辅助气压力：50psi。

在本发明的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前 处理还能够替换为：取生物液体样品1.0mL～2.0mL或生物组织样品1.0g～2.0g 剪碎于具塞试管中；加入pH 5.8磷酸盐缓冲液3mL～5mL，充分混旋，超声15min， 8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB固相小柱依次以 3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0.5mL/min～ 1.0mL/min；再以3mL去离子水和3ml0.5％甲醇水溶液【本发明中0.5％甲醇水溶 液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0.5％，以下不再赘述】先后淋洗小柱； 用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用500μL～1000μL 初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

在本发明的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另 取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加钩吻素甲和钩吻素 子标准100ng制备成添加样品；或者还包括另取相同基质的空白样品两份，分别 添加相应目标物标准品(添加量应与样品粗测量相近)制备成添加样品，混匀。

在本发明的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组 织样品为肝脏、肾脏。

在本发明的一个具体的实施方式中，C18柱为3.0mm×50mm，2.6μm柱或 等效色谱柱。

在本发明的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.0mL；或者组织样 品1.0g-2.0g。

在本发明的一个优选的实施方式中，乙酸乙酯的加入量为5.0mL-10.0mL。

在本发明的一个优选的实施方式中，残渣用500μL-1000μL初始流动相定 容。

在本发明的一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。

本发明另一方面的目的在于提供生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的液相色谱 -串联质谱(LC-MS/MS)检验方法的应用，应用于法庭科学领域，尤其是应用于 生物样品中钩吻素甲和钩吻素子的定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物 证的检验。

优选地，所述生物样品为血、尿、肝、肾。

本发明的有益效果在于：本发明样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作 简单，样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定 量准确度高。

附图说明

图1表示钩吻素甲和钩吻素子液相色谱-质谱提取离子流图；

图2表示钩吻素甲液相色谱-质谱提取离子流图；

图3表示钩吻素子液相色谱-质谱提取离子流图。

具体实施方式

实施例1定性分析

1、试剂

本发明试验用水为一级水(见GB/T 6682-2008规定)：

a)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯；

b)甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸、乙酸乙酯均为色谱纯；

c)磷酸盐缓冲液(pH 5.8)：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,，分别置 于1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；

d)含0.1％甲酸的10mM醋酸铵：称取0.384g的醋酸铵,加入一定量的一级水溶解， 并加入0.5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL；

e)标准溶液：

1)钩吻素甲和钩吻素子标准储备液：精确称取钩吻素甲和钩吻素子标准品各 50mg，分别于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0mg/mL 钩吻素甲和钩吻素子标准储备液，冷藏保存6个月；

2)钩吻素甲和钩吻素子标准工作液：精确量取1.0mg/mL钩吻素甲和钩吻素子标 准储备液各10mL，分别于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.10mg/mL 的钩吻素甲和钩吻素子标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标 准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。

2、仪器和材料

a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)和三重四极杆质量分析器；

b)电子天平：感量0.1mg和0.01g；

c)高速离心机；

d)振荡器；

e)浓缩仪；

f)移液器：量程10μL～100μL，100μL～1000μL，1000μL～5000μL；

g)pH试纸：范围1～14；

h)固相萃取小柱：HLB固相萃取柱或等效固相小柱；

i)微孔有机滤膜：0.22μm。

3、样品萃取

3.1、液液萃取

取血液等液体样品1.0mL～2.0mL或肝等组织样品1.0g～2.0g剪碎于具塞试 管中。另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加钩吻素甲 和钩吻素子标准100ng制备成添加样品，混匀。

上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9～10，加入5.0mL～10.0mL乙酸乙 酯，振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取， 合并两次有机相，置于50℃浓缩仪上挥干。残渣用500μL～1000μL初始流动相 定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

3.2、固相萃取(适用于新鲜血液)

按3.1项制备好样品，加入pH 5.8磷酸盐缓冲液3mL～5mL，充分混旋，超 声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相 小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为 0.5mL/min～1.0mL/min；再以3mL去离子水和3ml0.5％甲醇水溶液【本发明中0.5％ 甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的体积分数为0.5％，以下不再赘述】先后 淋洗小柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速浓缩仪上吹干，残渣用 500μL～1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串 联质谱仪分析。

4、仪器检测

液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

5、记录和计算

记录各样品及标准品平行进样2～3次中目标物的保留时间及峰面积值，按公式 (1)计算回收率：

式中：

R－回收率；

A添－添加样品中标准物质的峰面积平均值；

W纯－标准物质浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)；

A纯－标准物质的峰面积平均值；

M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)。

6、定性结果评价

6.1、阴性结果评价

如果样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，且添加样品相应目标物的回 收率在60％以上，则阴性结果可靠。

如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或回收率低于60％，则 阴性结果不可靠。

如果添加样品的添加含量≤0.02μg/mL时，可不计算回收率，则阴性结果 按以下方式评价：

如果案件样品未出现与标准品Rt值相同的色谱峰，添加样品的色谱峰信噪 比大于10，则阴性结果可靠。

如果添加样品中未出现与标准品Rt值相同的色谱峰或添加样品的色谱峰 的信噪比小于等于10，则阴性结果不可靠。

6.2阳性结果评价

如果样品中出现与目标物相同的两对定性离子对，其色谱峰保留时间与添加 样品中目标物的色谱峰保留时间比较，相对误差在±2.5％之内，且所选择的相对 离子对丰度比与添加样品中的相对离子对丰度比之相对误差不超过表3规定的 范围，空白样品中未出现相应的色谱峰，则阳性结果可靠。相关的液相色谱-串 联质谱图参见图1～图3。

如果空白样品中出现与添加样品中目标物保留时间一致的色谱峰，且定性离 子对及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。

本发明中钩吻素子、钩吻素甲在血样中的检出限为0.2ng/mL。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度 ＞50％ ＞20％～50％ ＞10％～20％ ≤10％ 允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％

实施例2定量分析

1、试剂同实施例1

2、仪器与材料同实施例1

3、样品萃取

准确量取案件样品1.0mL～2.0mL或1.0g～2.0g平行两份；另取相同基质的 空白样品两份，分别添加相应目标物标准品(添加量应与案件样品粗测量相近) 制备成添加样品，混匀。其他同实施例1。

4、仪器检测同实施例1

5、记录和计算

5.1、计算药物含量

记录各样品平行进样2～3次中目标物峰面积值，按公式(2)计算含量：

式中：

W－单位质量样品中目标物质的含量，单位为微克每克(μg/g)或微克每毫升(μ g/mL)；

A样－样品中目标物的峰面积平均值；

M添－添加样品中标准物质的添加量，单位为微克(μg)；

V样－样品的定容体积，单位为毫升(mL)；

A添－添加样品中目标物的峰面积平均值；

M样－样品的取样量，单位为克(g)或毫升(mL)；

V添－添加样品的定容体积，单位为毫升(mL)。

5.2、计算相对相差

记录两份平行操作的样品含量，按公式(3)计算相对相差：

$RD=\frac{|X_1-X_2|}{\bar{X}}100\%---\left(1\right)$

式中：

RD－相对相差；

X1、X2－两份样品平行定量测定的含量数值；

－两份样品平行定量测定含量的平均值。

6、定量结果评价

如果案件样品中目标物含量的RD＞20％，定量数据不可靠。如果目标物含量 的RD≤20％，定量数据可靠。其含量按两份案件样品的平均值计算。

实施例3利用非新鲜血液对本发明的方法进行评价

1、试剂，同实施例1。

2、仪器和材料，同实施例1。

3、样品萃取

分别取空白的非新鲜血液1.0mL于具塞试管中；分别添加钩吻素甲和钩吻素 子标准品制备成添加样品，混匀。

上述样品中分别加一定量的氢氧化钠溶液调pH10，加入10.0mL乙酸乙酯， 振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合 并两次有机相(对二次提取后的无机相进行高效液相色谱分析，样品的提取率为 98.1％)，置于50℃浓缩仪上挥干。残渣用1000μL初始流动相定容,过0.22μm微 孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。

4、仪器检测

液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别 为86.1％、90.4％、97.0％；RSD％分别为3.3、3.5、2.0。

钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别 为85.6％、89.8％、94.9％；RSD％分别为3.7、3.2、1.3。

钩吻素甲和钩吻素子在10～1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。

钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内) 分别为1.43、2.96、2.57，RSD％(日间)分别为3.31、2.67、4.01。

钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内) 分别为1.53、2.70、2.19，RSD％(日间)分别为3.40、2.65、4.00。

以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.2ng/mL，以信噪比3/1计，该 方法的最小检出限为0.08ng/mL。

实施例4利用新鲜血液对本发明的方法进行评价

1、试剂,同实施例1。

2、仪器和材料，同实施例2。

3、样品萃取

分别取空白的新鲜血液1.0mL于具塞试管中；分别添加钩吻素甲和钩吻素子 标准品制备成添加样品，混匀。

分别加入pH 5.8磷酸盐缓冲液5mL，充分混旋，超声15min，8000r/min以 上高速离心20min，取上清液待过柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL 水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为1.0mL/min；再以3mL去离子水和 3ml0.5％甲醇水溶液先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液置于50℃快速 浓缩仪上吹干，残渣用1000μL初始流动相定容,过0.22μm微孔有机滤膜，滤液 供液相色谱-串联质谱仪分析。

4、仪器检测

4.1液相色谱-串联质谱仪条件

以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：

色谱柱：kinetex C18(3.0mm×50mm，2.6μm柱或等效色谱柱；

流动相及梯度洗脱条件见表1；

表1流动相和梯度洗脱条件

进样量：1μL～10μL；

扫描方式：正离子扫描(ESI+)；

检测方式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：5500V；

离子源温度：650℃；

雾化气压力：55psi；

气帘气压力：50psi；

辅助气压力：50psi；

监测离子对、去簇电压、碰撞能参见表2。

表2监测离子对、锥孔电压、碰撞能

钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别 为88.3％、93.1％、98.9％；RSD％分别为3.0、3.3、1.0。

钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分别 为87.5％、92.8％、99.0％；RSD％分别为3.2、3.0、1.0。

钩吻素甲和钩吻素子在10～1000ng/mL浓度范围内均有着良好的线性关系。

钩吻素甲添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内) 分别为1.30、2.53、2.12，RSD％(日间)分别为3.25、2.43、4.00。

钩吻素子添加浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD％(日内) 分别为1.28、2.63、2.11，RSD％(日间)分别为3.30、2.52、4.01。

以信噪比10/1计，该方法的最小定量限为0.2ng/mL，以信噪比3/1计，该方法 的最小检出限为0.08ng/mL。

实施例3和实施例4中，回收率的计算、线性关系的得出、以及日内和日间 精密度，均采用现有技术中的常规方法：以测得的添加各生物样品中钩吻素甲或 钩吻素子的峰面积与相同浓度钩吻素甲或钩吻素子标准工作溶液峰面积的比值 来计算回收率。用测得的钩吻素甲或钩吻素子的峰面积(Y)对生物样品待萃取 标准液中钩吻素甲或钩吻素子浓度(X)求得线性回归，得到回归方程，进而得 到线性关系。计算钩吻素甲或钩吻素子峰面积的相对标准偏差，得到日内精密度； 连续测三天，计算钩吻素甲或钩吻素子峰面积三天的相对标准偏差，得到日间精 密度。