用于使用两相萃取发酵和可循环利用的提取剂组合物制备丁醇的方法

摘要

本文提供了包括下列步骤的方法：提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；使所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；从所述发酵液体培养基回收所述丁醇和提取剂组合物的至少一部分；将(c)中回收的所述提取剂组合物在所述发酵液体培养基中循环利用一次或多次；任选地调节所述提取剂组合物中的有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，由此所述循环利用的提取剂组合物中的氧化的速率或氧化的产物的效应是实质上降低的和/或避免的，使得所述提取剂组合物可被循环利用。

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2012年9月21日提交的美国临时申请61/704,300的 优先权，该文献据此全文以引用方式并入。

技术领域

本发明涉及用于使用提取剂回收发酵中产生的丁醇的方法。更具体 地，本发明涉及通过(例如)向提取剂提供足够量的抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物，随时间推移(包括随着提取剂的循环)维持提取剂的效率。

背景技术

丁醇是重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在 塑料工业中用作化学原料，以及在食品和风味剂工业中用作食品级的提取 剂。因此，存在对丁醇、以及对高效的和环境友好的制备方法的高需求。 一种此类环境友好的制备方法包括通过微生物利用发酵制备丁醇。在发酵 过程期间，使用提取剂，能够从发酵液体培养基提取丁醇。

将脂肪酸用作提取剂用于从发酵过程回收丁醇是有吸引力的，因为通 过随着玉米醪引入的可用的玉米油的脂肪酶催化的水解，能够持续地生成 新鲜的脂肪酸。玉米油三甘油酯中的亚油酸∶油酸∶棕榈酸比率基于重量 计为大约4∶2∶1。考虑到多不饱和脂肪酸的高浓度，如果允许多不饱和脂肪 酸与氧气接触(这可在发酵期间和/或用于制备丁醇的方法的其他步骤期间 发生)，氧化的风险是高的。与生玉米油相关联的抗氧化剂，尤其是生育 酚，提供了一些保护。然而，考虑到由玉米油生成的脂肪酸能够再利用和 再循环，以提取发酵产物(诸如丁醇)许多次，以及抗氧化剂当其阻断氧 化循环时被消耗这一事实，在提取剂中需要足够量的抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物来保持氧化的速率在可接受的低水平，或者抵消氧化产物(例 如，醛和酮)的效应，尤其是当发酵过程是在有氧和/或微氧条件下进行 时。

本发明满足了在提取剂中维持或提供有效水平的抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物的需求用于从发酵过程回收丁醇。

发明内容

本文提供了用于改善通过可再生资源(即，生物质)的发酵利用重组 微生物产生的产物醇的提取的方法。具体地，本文提供了用于改善通过生 物质的发酵产生的丁醇的提取的方法，其中所述发酵使用用丁醇生物合成 途径工程化改造的重组微生物。此类改善包括控制氧化的速率或氧化产物 对包含不饱和脂肪酸的提取剂的效应。本文提供了用于在提取剂中维持或 提供有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，以从发酵过程回收丁醇的方 法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可 发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)使 所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取 剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所 述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养基回收丁醇和提取剂组合物的至少一 部分；(d)将(c)中回收的提取剂组合物循环利用至所述发酵液体培养基一次 或多次；以及(e)任选地调节所述循环利用的提取剂组合物中的有效量的抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物，由此所述循环利用的提取剂组合物中的氧化 的速率或氧化产物的效应被实质上降低和/或避免，使得所述提取剂组合物 能够以在步骤(d)中提供的方式被循环利用至少十次循环。任选地，所述提 取剂组合物能够被循环利用至少二十次循环。任选地，所述提取剂组合物 能够被循环利用至少五十次循环。

对提取剂组合物的有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的调节能 够，例如，包括用一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物补充循环利用 的提取剂组合物。补充可通过在添加至发酵容器之前、发酵期间、或随着 提取剂的循环，将抗氧化剂或抗氧化剂样化合物添加至提取剂组合物而发 生。补充还可通过提供随着生物质(例如，玉米醪)的、随着发酵液体培 养基的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物发生，或者由经工程化以制备丁醇的 重组微生物产生。在一个实施例中，被作为碳源用于丁醇发酵的原料 (即，生物质)可基于具有改善的脂肪酸分布型和/或天然的抗氧化剂或抗 氧化剂样组合物来选择，或者可经过基因修饰，以提供较少受氧化影响的 或包括了有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的脂肪酸分布型，以改善 发酵期间丁醇的提取。

在其中通过提取回收丁醇的丁醇制备期间，提取剂循环可通过多种方 式实现，包括提取剂和丁醇的蒸馏。通过避免或降低可在丁醇制备中回收 和/或其他处理期间暴露于氧气的提取剂的氧化速率或氧化产物对提取剂的 效应，有助于循环利用提取剂组合物。提取剂组合物能够在提取剂组合物 的每次循环被调节，以维持有效水平的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。另 选地，提取剂组合物能够被调节一次，使得其包含有效量的抗氧化剂或抗 氧化剂样化合物至少5次循环、优选地10次循环、更优选地20次循环、 最优选地100次循环。另选地，提取剂组合物能够每隔一次循环地被调 节。本领域的技术人员将能够确定给定的提取剂组合物在哪次循环数将需 要被调节，这可包括监测提取剂组合物的氧化状态。确定提取剂组合物的 氧化状态可通过监测提取剂的一种或多种组分的损耗(例如，玉米油脂肪 酸(COFA)中亚油酸18∶2的损耗)而实现。任选地，确定提取剂组合物的氧 化状态可通过监测提取剂的抗氧化活性指数(例如，通过使用Rancimat方 法)实现。任选地，确定提取剂组合物的氧化状态可通过以下方式实现： 在发酵过程中测量重组微生物的生长速率或有效收率之外，监测发酵生产 能力的一个或多个指标诸如速率、滴度、产物醇的收率。确定提取剂的氧 化状态能够在每一循环、每隔一次循环、每第三次循环、每第四次循环、 每第五次循环、每第十次循环、或每第二十次循环进行。本领域的技术人 员将能够确定在哪次循环数将需要监测氧化状态。

用一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物补充提取剂组合物还可包 括将包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物的新鲜的 或未使用过的部分添加至循环利用的提取剂组合物。任选地，用一种或多 种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物补充循环利用的提取剂能够包括将抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物直接添加至循环利用的提取剂组合物，以形成包含 有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物。

抗氧化剂可选自但不限于生育酚、生育三烯酚、具有抗氧化活性的氨 基酸、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、其他烷基化的 酚、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶 素没食子酸酯(ECG)、没食子酸、没食子酸酯(例如，没食子酸丙酯)、卡 诺醇、鼠尾草酸、乌索酸、丹参I、二氢丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮 IIB、丹参新醌B、过氧化物酶类、固定化的硼氢化物、L-抗坏血酸6-棕榈 酸酯、花青素、花青苷、乙氧喹、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、以及它们的组 合。在某些实施例中，所述一种或多种抗氧化剂能够包括生育酚。在某些 实施例中，所述一种或多种抗氧化剂能够包括BHT。在某些实施例中，所 述一种或多种抗氧化剂能够包括BHT和BHA。

任选地，所述一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物能够包括氨基 酸。具有抗氧化活性的氨基酸能够包括但不限于半胱氨酸、甲硫氨酸、苯 丙氨酸、组氨酸、色氨酸、和酪氨酸。具有抗氧化活性的氨基酸能够与提 取剂组合物的新鲜的或未使用过的部分一起被添加至循环利用的提取剂组 合物。任选地，在发酵过程中，可发酵的碳源能够通过处理生物质来提 供。在此类示例中，通过用从生物质制备抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的 酶或其他试剂的添加进一步处理生物质，能够将氨基酸添加至循环利用的 提取剂组合物。任选地，将蛋白酶添加至生物质，由此所述蛋白酶从生物 质释放游离氨基酸，其为提取剂组合物提供抗氧化剂或抗氧化剂样活性。

蛋白酶能够，例如，在至少约85℃的温度下灭活。蛋白酶的灭活在至 少约85℃的温度下能够消耗至少15分钟。灭活蛋白酶的方法是本领域已知 的。任选地，所述蛋白酶是能够水解多肽中的全部氨基酸键的通用蛋白 酶。

在某些实施例中，通过测量提取剂的氧化敏感组分的损耗(例如，玉 米油脂肪酸(COFA)中的亚油酸18∶2的损耗)相对于不包含抗氧化剂或抗氧 化剂样化合物的提取剂样品中这些组分的损耗的速率，能够指示有效量的 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。当氧化敏感组分损耗的速率相对于没有抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂中氧化敏感组分损耗的速率为小于约 0.9时，指示具有有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物， 优选所述比率为小于约0.5，更优选所述比率为小于约0.2，最优选所述比 率为小于约0.1。通过测定每一循环之前和之后所述提取剂的每一组分的量 (例如，亚油酸18∶2的量)，能够确定所述速率。使用AOCS(美国石油 化学家协会)方法Ce 1e-91结合AOCS方法Ce2-66的分析型GC(气相色 谱法)或类似的方法，能够被用于测定具有基于脂肪酸和脂肪酸酯的提取 剂的每一组分的量，但其他技术对于本领域的技术人员将是显而易见的。

任选地，包含有效量的抗氧化剂的提取剂组合物具有至少约1.1的抗 氧化活性指数。所述提取剂组合物的抗氧化活性指数可为至少约1.1至约 15、至少约2至约12、或至少约5至约10。所述提取剂组合物的抗氧化活 性指数可为约1.1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、 8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、或 15。

任选地，通过在提取剂的每一循环之后测量提取剂的过氧化物、醛、 和/或酮含量，并与上一循环的测量进行比较，以确定是否存在提取剂的过 氧化物、醛、和/或酮含量的升高，能够指示有效量的抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物。过氧化物、醛、和/或酮含量的升高指示提取剂中降低的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物水平。过氧化物、醛、和/或酮含量的水平能够在提 取剂的每一循环、每隔一次循环、每第五次循环、每第十次循环、或每第 二十次循环被测定。本领域的技术人员将能够确定何时测量提取剂的过氧 化物、醛、和/或酮含量。

任选地，所述提取剂选自但不限于玉米油脂肪酸(COFA)、大豆油脂肪 酸(SOFA)、蓖麻油脂肪酸、油醇、基于脂肪酸甲酯(FAME)的COFA、基于 FAME的SOFA、脂肪酸丁酯(FABE)、以及它们的混合物。

还提供了用于将有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物引入用于从发 酵过程回收丁醇的提取剂组合物的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体 培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合 成途径的重组微生物、和丁醇，其中所述可发酵的碳源是通过处理生物质 来提供的；(b)使所述发酵液体培养基与提取剂组合物接触，由此所述提取 剂组合物不包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，并且由此所述发 酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；(c)通过用蛋白 酶进一步处理所述生物质，调节所述提取剂组合物中抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物的量，由此所述蛋白酶刺激游离氨基酸从所述生物质的释放，并 且由此所述氨基酸提供具有有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取 剂组合物；(d)从所述发酵液体培养基回收所述丁醇和提取剂组合物的至少 一部分；(e)将(d)中回收的所述提取剂组合物循环利用至所述发酵液体培养 基一次或多次；以及(f)任选地调节所述提取剂组合物中的有效量的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物，由此所述循环利用的提取剂组合物中的氧化速率 或氧化产物的效应是被实质上降低的和/或避免的，使得所述提取剂组合物 可被循环利用。另外，提取剂组合物能够以在步骤(d)中提供的方式被循环 利用至少十次循环。任选地，所述提取剂组合物可被循环利用至少二十次 循环。任选地，所述提取剂组合物可被循环利用至少五十次循环。

还提供了用于避免或降低循环利用的提取剂的氧化速率或氧化产物对 循环利用的提取剂的效应的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养 基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途 径的重组微生物、和丁醇；(b)使所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧 化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基 中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养基回 收丁醇和提取剂组合物的至少一部分；(d)将抗氧化剂或抗氧化剂样化合物 添加至(c)中回收的提取剂组合物；以及(e)将步骤(d)的提取剂组合物在所述 发酵液体培养基中循环利用一次或多次。

还提供了用于在丁醇发酵过程期间维持提取剂组合物的氧化状态的方 法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可 发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)使 所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取 剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所 述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养基回收丁醇和提取剂组合物的至少一 部分；(d)在发酵期间监测丁醇制备的抗氧化活性指数、有效速率、滴度、 收率的一者或多者或重组微生物的生长；(e)当所述监测指示抗氧化活性指 数的降低或所述监测指示对所述重组微生物的毒性时，在步骤(d)之后向所 述提取剂组合物补充抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。

还提供了用于优化从丁醇发酵过程提取丁醇的方法。所述方法包括： (a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工 程化丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提供提取剂组合物，所 述提取剂组合物包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、丁醇和游离 脂肪酸，其中所述抗氧化剂或抗氧化剂样化合物是在发酵期间由所述重组 微生物产生的；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触， 由此丁醇分配到所述提取剂组合物中并从所述提取剂蒸馏。任选地，所述 方法还包括在蒸馏丁醇之后循环利用(c)的提取剂组合物。

还提供了用于改善异丁醇发酵期间产生的异丁醇的收率的方法。所述 方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳 源、含有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提供包 含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提取剂 组合物；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此异 丁醇分配到所述提取剂组合物中，其中异丁醇的收率与不存在所述抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物时的异丁醇的收率相比是改善的。

还提供了用于改善异丁醇发酵过程期间产生的异丁醇的滴度的方法。 所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵 的碳源、含有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提 供包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提 取剂组合物；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由 此异丁醇分配到所述提取剂组合物中，其中异丁醇制备的滴度与不存在所 述抗氧化剂或抗氧化剂样化合物时的异丁醇制备的滴度相比是改善的。

还提供了用于改善异丁醇发酵期间的异丁醇制备速率的方法。所述方 法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳 源、含有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提供包 含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提取剂 组合物；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此异 丁醇分配到所述提取剂组合物中，其中异丁醇制备的速率与不存在所述抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物时的异丁醇制备的速率相比是改善的。

还提供了用于提高丁醇发酵过程中分配到提取剂组合物中的丁醇的水 平的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基 包含可发酵的碳源、含有丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提 供包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物，其中所述 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物使所述提取剂的丁醇分配系数升高；以及(c) 使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此与在不包含有效量 的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物中或者不包含使提取剂的 丁醇分配系数升高的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物中分配 的丁醇水平相比，提高分配到所述提取剂组合物中的异丁醇的水平。

还提供了用于减少丁醇发酵过程中的微生物污染的方法。所述方法包 括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含 有丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提供包含有效量的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物，其中所述抗氧化剂或抗氧化剂样 化合物包含抗微生物活性；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组 合物接触，由此与利用不包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提 取剂组合物或者不包含具有抗微生物活性的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物 的提取剂组合物的丁醇发酵相比，减少丁醇发酵的微生物污染。

还提供了双相组合物。所述双相组合物能够包含：(a)包含发酵液体培 养基的第一相，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有用于制备产 物醇的工程化生物合成途径的重组微生物、和产物醇；和(b)包含提取剂组 合物的第二相，所述提取剂组合物包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物、产物醇、和游离脂肪酸；其中所述游离脂肪酸和抗氧化剂或抗氧化 剂样化合物来源于所述可发酵的碳源。任选地，所述工程化生物合成途径 是丁醇生物合成途径，并且所述产物醇是丁醇。

附图说明

图1示出展示纯(100％)粗制玉米油脂肪酸(COFA)(100％)、纯蒸 馏的COFA(100％)、以及粗制的和蒸馏的COFA的混合物(90％蒸馏的 /10％粗制的；75％蒸馏的/25％粗制的；以及50％蒸馏的/50％粗制的)的样 品随时间推移的过氧化物含量的图。

图2示出展示纯粗制COFA(100％)、纯蒸馏的COFA(100％)、以 及粗制的和蒸馏的COFA的混合物(90％蒸馏的/10％粗制的；75％蒸馏的 /25％粗制的；以及50％蒸馏的/50％粗制的)中双键亚油酸的百分比随时间 推移的图。

图3示出展示粗制COFA以及粗制COFA加上不同水平的BHT在110 ℃的氧化稳定性指数的图。

图4示出在具有和不具有BHT时在COFA的存在下生长的丁醇菌的生 物相容性。图4A示出展示在以指示的时间用空气喷射的粗制COFA的存在 下生长的丁醇菌的碳消耗的图。图4B示出展示在以指示的时间用空气喷射 的具有0.2重量％BHT的COFA的存在下生长的丁醇菌的碳消耗的图。图 4C示出展示在以指示的时间用空气喷射的具有0.8重量％BHT的COFA的 存在下生长的丁醇菌的碳消耗的图。

图5示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中在使发酵液体 培养基与提取剂在发酵容器中接触之前使第一与水不混溶的提取剂和任选 的第二与水不混溶的提取剂在容器中混合。

图6示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中将第一与水不 混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂分别地添加至发酵液体培 养基在其中与提取剂接触的发酵容器中。

图7示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中将第一与水不 混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂分别地添加至不同的发酵 容器中，用于使发酵液体培养基与提取剂接触。

图8示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中产物的提取在 发酵罐的下游发生，并且在发酵液体培养基与提取剂在不同的容器中接触 之前使第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不混溶的提取剂在容器 中混合。

图9示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中产物的提取在 发酵罐的下游发生，并且将第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不 混溶的提取剂分别地添加至发酵液体培养基在其中与所述提取剂接触的容 器中。

图10示意性地示出了本发明的方法的一个实施例，其中产物的提取在 发酵罐的下游发生，并且将第一与水不混溶的提取剂和任选的第二与水不 混溶的提取剂分别地添加至不同的容器，用于使发酵液体培养基与提取剂 接触。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其 定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数 术语将包括单数。所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均 全文以引用方式并入本文用于所有目的。

为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们 的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其 它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方 法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元 素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此 外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他 性的“或”。例如，以下中的任一者均满足条件A或B：A是真的(或存 在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的 (或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

另外，涉及元素或组分的示例的数目(即次数)在本发明元素或组分 前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一 个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数 形式也包括复数形式，除非有数字明显地表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨 在意指本发明的任何单个实施例，而是涵盖如专利申请中所述的所有可能 的实施例。

如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指 可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用 于产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作；这些操作中非故意的误 差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等。 术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡 条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等 同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或者在 报告数值的5％范围内。

如本文所用，术语“有氧条件”是指在氧气存在下的生长条件。

如本文所用，术语“微氧条件”是指具有低水平的氧气(即低于正常 的大气氧气水平)的生长条件。

如本文所用，术语“厌氧条件”是指不存在氧气时的生长条件。

如本文所用，“生物质”指包含可水解的多糖的天然产物，该可水解 的多糖提供可发酵的糖，包括来源于天然来源诸如玉米、甘蔗、小麦、纤 维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚 糖、二糖和/或单糖的材料、以及它们的混合物的任何糖和淀粉。生物质还 可包含另外的组分，诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或 者生物质可包含来源于多于一种来源的混合物；例如，生物质可包含玉米 棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能 作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭 院垃圾、废弃糖、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于：玉米 粒、玉米棒、农作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、裸麦、小 麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、 大豆、乳清、乳清渗透物、从谷物研磨获得的组分、树、枝、根、叶、木 屑、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合 物。例如，醪、果汁、糖蜜或水解产物可通过本领域已知的用于出于发酵 目的处理生物质的任何处理方法，诸如研磨、处理和/或液化来由生物质形 成，并且包含可发酵糖，并且可包含一定量水。例如，可通过湿磨或干磨 加工玉米并随后使其液化以产生醪。可通过本领域技术人员已知的任何方 法处理纤维素和/或木质纤维素生物质，以获得包含可发酵的糖的水解产物 (参见，例如美国专利申请公布2007/0031918，其以引用方式并入本 文)。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化利用酶聚生体来降解纤维 素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉 伯糖。适用于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶参见Lynd等人， Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-77(2002)。

如本文所用，术语“生物质”在一些情况下是指培养物的质量，例 如，重组微生物的量，通常以克/升(g/l)干细胞重量(dcw)的单位提供。

如本文所用，“生物质收率”是指产生的微生物生物质(即细胞生物 质制备)与消耗的碳底物的比率。

如本文所用，“生物燃料”或“生物燃料产品”是指来源于生物过程 例如但不限于发酵的燃料。

如本文所用，“丁醇”指处于单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁 醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(t-BuOH)、和/或异丁醇 (iBuOH或i-BuOH，也称为2-甲基-1-丙醇)。如本文所用，术语“生物 丁醇”有时可与“丁醇”同义使用。

如本文所用，“产物醇”是指在发酵过程中能够由微生物产生的任何 醇，所述发酵过程利用生物质作为可发酵的碳底物的来源。产物醇包括但 不限于，C₁至C₈烷基醇、以及它们的混合物。在一些实施例中，产物醇为 C₂-C₈烷基醇。在其它实施例中，产物醇为C₂-C₅烷基醇。应当理解，C₁至 C₈烷基醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它们的混合 物。同样地，C₂-C₈烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇、和戊醇。 “醇”在本文中也用于指产物醇。

如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵液体培养基通过发酵产 生的特定醇(例如丁醇)或通过醇的酯化作用产生的醇酯的醇等同物的总 量。例如，在单位体积发酵中的丁醇的有效滴度包括：(i)发酵液体培养基 中的丁醇量；(ii)由有机萃取剂回收的丁醇量；(iii)如果使用汽提，由气相回 收的丁醇量；和(iv)有机相或水相中的丁基酯的醇等同物。

如本文所用，术语“有效速率”是有效滴度除以发酵时间。

如本文所用，术语“有效收率”是指每克消耗的葡萄糖产生的总产物 醇克数。

如本文所用，术语“丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇、2-丁醇、 或异丁醇的酶途径。

术语“1-丁醇生物合成途径”是指产生1-丁醇的酶途径。“1-丁醇生 物合成途径”能够指由乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)产生1-丁醇的酶途径。例 如，1-丁醇生物合成途径公开于美国专利申请公布2008/0182308和国际公 布WO 2007/041269中，上述文献全文以引用方式并入本文。

术语“2-丁醇生物合成途径”是指产生2-丁醇的酶途径。“2-丁醇生 物合成途径”能够指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。例如，2-丁醇生物合 成途径公开于美国专利8,206,970、美国专利申请公布2007/0292927、国际 公布WO 2007/130518和WO 2007/130521中，上述文献全文以引用方式并 入本文。

术语“异丁醇生物合成途径”是指产生异丁醇的酶途径。“异丁醇生 物合成途径”能够指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。例如，异丁醇生物合 成途径公开于美国专利7,851,188、美国专利7,993,889、美国专利申请公布 2007/0092957、和国际公布WO 2007/050671中，上述文献全文以引用方式 并入本文。“异丁醇生物合成途径”有时与“异丁醇制备途径”同义地使 用。

如本文所用，“原位产物去除(ISPR)”指从诸如发酵的生物过程中， 当产物产生时选择性去除发酵产物以控制产物浓度。

如本文所用，“可发酵的碳源”或“可发酵的碳底物”是指能够被本 文所公开的微生物代谢用于制备发酵醇的碳源。合适的可发酵碳源包括但 不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖；二糖诸如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖诸 如淀粉或纤维素；C5糖诸如木糖和阿拉伯糖；包括甲烷的一碳底物；氨基 酸；以及它们的混合物。

如本文所用，“原料”是指发酵过程中的进料，所述进料包含具有或 不具有不溶解的固体的可发酵的碳源，并且在适用的情况下，所述进料在 通过进一步加工(诸如通过液化、糖化、或其它方法)已经从淀粉中释放 可发酵的碳源或从复糖降解中获取可发酵的碳源之前或之后包含可发酵的 碳源。原料包括生物质或来源于生物质。合适的原料包括但不限于裸麦、 小麦、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、大麦、纤维素材料、木质纤维素材 料、或它们的混合物。在涉及“原料油”的情况下，应当理解该术语涵盖 由给定原料制得的油。

如本文所用，“糖”是指低聚糖、二糖、单糖、和/或它们的混合物。 术语“糖类”还包括碳水化合物，包括淀粉、葡聚糖、糖原、纤维素、戊 聚糖、以及糖。

如本文所用，“可发酵的糖”是指能够被本文所公开的微生物代谢用 于制备发酵醇的一种或多种糖。

如本文所用，“不溶解的固体”，是指原料的不可发酵的部分，例 如，胚芽、纤维、和谷蛋白。例如，原料的不可发酵的部分包括保持为固 体并且可从发酵液吸收液体的原料的部分。

如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖、溶解的固体、任选的 微生物产生的醇、产物醇、和材料的所有其他组分的混合物，其中产物醇 由所存在的微生物通过使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO₂)而制得。如 本文所用，术语“发酵液”和“发酵混合物”有时能够与“发酵液体培养 基”同义地使用。发酵液体培养基还可包含能够避免或降低提取剂组合物 中的不饱和脂肪酸的氧化速率的抗氧化剂。

如本文所用，术语“双相发酵液体培养基”是指包含发酵液体培养基 (即，水相)和适当量的与水不混溶的有机提取剂的两相生长培养基。

如本文所用，“发酵容器”是指在其中进行发酵反应由此由糖制得诸 如丁醇的产物醇的容器。“发酵罐”在本文中与“发酵容器”可互换地使 用。

术语“回收”或其变体，是指从初始混合物中去除化学化合物以获得 纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。

如本文所用，“提取剂”是指用于去除或分离产物醇诸如丁醇的溶 剂。如本文所用，术语“溶剂”有时与“提取剂”可同义地使用。就本文 所述的方法而言，提取剂是与水不混溶的。

如本文所用，“与水不混溶的”或“不溶解的”是指化学组分诸如提 取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水性溶液诸如发酵液混合。

如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混 溶的有机提取剂而获得的双相混合物中的水相。在本文所述的包括发酵提 取的方法的一个实施例中，术语“发酵液”这时具体地指双相发酵提取中 的水相，并且术语“贫溶剂相”可与“水相”和“发酵液”同义地使用。 此外，不溶解的固体(例如，谷物固体)能够存在于发酵液中，使得双相 混合物包括主要分散于水相中的不溶解的固体。

如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液接触与水不混溶的有 机提取剂而获得的双相混合物中的非水相。如本文所用，术语“富溶剂 相”有时可与“有机相”同义地使用。

如本文所用，术语“脂肪酸”指具有C₄至C₂₈碳原子(最常见地为C₁₂至C₂₄碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是饱和或不饱和的。脂肪 酸还可以是支化或非支化的。脂肪酸在动物或植物的脂肪、油或蜡中可来 源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然 存在，或者可通过水解脂肪或通过合成获得。术语脂肪酸可描述单种化学 物质或脂肪酸的混合物。此外，术语脂肪酸还可涵盖游离脂肪酸。

如本文所用，术语“脂肪醇”是指具有C₄至C₂₂碳原子的脂族链的 醇，所述脂族链为饱和或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C₄至C₂₂碳原子的脂族链的 醛，所述脂族链为饱和或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪酰胺”是指具有C₄至C₂₂碳原子的长脂族链 的酰胺，所述脂族链为饱和或不饱和的。

如本文所用，术语“脂肪酸酯”是指具有C₄至C₂₂碳原子的长脂族链 的酯，所述脂族链为饱和或不饱和的。

如本文所用，术语“羧酸”指具有一般化学式-COOH的任何有机化合 物，其中碳原子通过双键键合到氧原子以形成羰基基团(-C＝O)，并且通 过单键键合到羟基(-OH)。羧酸可为质子化的羧酸形式、羧酸盐形式(例 如铵、钠、或钾盐)、或质子化的羧酸与羧酸盐的混合物的形式。术语羧 酸可描述单独的化学物质(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通过例如水 解生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯、和磷脂产 生。

如本文所用，“部分”包括整体的一部分或该整体。例如，发酵液的 一部分包括发酵液的部分以及整体(或全部)发酵液。

“分配系数”是指化合物在两种不混溶的溶剂的混合物的两相中平衡 时的浓度的比率。分配系数是化合物在两种不混溶的溶剂中不同的溶解度 的量度。如本文所用，分配系数与术语分布系数同义。

如本文所用，术语“抗微生物活性”是指化合物和/或分子杀灭微生物 或抑制微生物的生长的能力。用于测定抗微生物活性的方法是本领域已知 的，例如，平板扩散测定法、琼脂稀释测定法、培养液稀释测定法、和抑 制区域测定法。

如本文所用，术语“重组微生物”是指诸如细菌或酵母的微生物，其 通过重组DNA技术的使用被修饰，例如，通过工程化宿主细胞以包含生物 合成途径，例如用于产生醇诸如丁醇的生物合成途径。

如本文所用，“有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物”是指能够淬 灭不饱和脂肪酸的氧化期间形成的过氧自由基或过氧自由基的次级反应产 物(例如，醛和酮)的水平的抗氧化剂(例如，化合物、物质、或分子) 或抗氧化剂样化合物(例如，氨基酸)。所谓的“淬灭”是指所述抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物避免、降低、或中和了过氧自由基或过氧自由基的 次级反应产物的活性。

如本文所用，“抗氧化剂样化合物”是指能够反应并中和氧化反应的 次级氧化产物(例如，醛或酮)的化合物。例如，氨基酸的氨基基团能够 与醛或酮反应，以淬灭或抵消醛或酮的效应。

如本文所用，“氧化产物”是指由过氧化物形成的氢过氧化物、过氧 化物、醛、酮、和/或聚合产物。

在这种情况下，提取剂中的有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物能 够通过测量在具有循环利用的提取剂的发酵过程中重组微生物的生长速率 或有效收率而确定。重组微生物的生长或有效收率的基线水平能够在暴露 于循环利用的提取剂之前的发酵过程中被测定。这种生长或有效收率的基 线水平能够被用于确定循环利用的提取剂是否具有抗氧化剂或抗氧化剂样 化合物的水平的不足。例如，与暴露于循环利用的提取剂之前的重组微生 物的生长或有效收率相比，在其中重组微生物暴露于循环利用的提取剂的 发酵过程中，重组微生物的生长或有效收率的降低指示提取剂中抗氧化剂 或抗氧化剂样化合物水平的不足。重组微生物的生长和/或有效收率的降低 能够是与在提取剂的循环利用之前采用相同的重组微生物和提取剂的先前 的发酵的生长和/或有效收率相比较。另选地，重组微生物的生长和/或有效 收率的降低能够是与相同的重组微生物在具有有效量的抗氧化剂或抗氧化 剂样化合物的标准提取剂中的标准的生长或有效收率相比较。例如，在其 中提取剂被循环利用多次的发酵过程中，通过比较重组微生物的生长和有 效收率与先前的生长和有效收率，能够监测微生物的生长和有效收率，以 确定提取剂是否在每一循环之后保持了有效水平的抗氧化剂或抗氧化剂样 化合物。生长或有效收率的降低指示提取剂具有抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物水平的不足。

在某些实施例中，通过测量提取剂的氧化敏感组分的损耗(例如，玉 米油脂肪酸(COFA)中的亚油酸18∶2的损耗)相对于不包含抗氧化剂或抗氧 化剂样化合物的提取剂的样品中那些组分的损耗的比率，能够指示有效量 的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。当氧化敏感组分损耗的速率相对于不含 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂中氧化敏感组分损耗的速率为小于 约0.9时，指示具有有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合 物，优选地所述比率小于约0.5，更优选地所述比率小于约0.2，最优选地 所述比率小于约0.1。通过测定每一循环之前和之后所述提取剂的每一组分 的量(例如，亚油酸18∶2的量)，能够确定所述速率。使用AOCS(美国 石油化学家协会)方法Ce 1e-91结合AOCS方法Ce2-66的分析型GC(气 相色谱法)或类似的方法，能够被用于测定具有基于脂肪酸和脂肪酸酯的 提取剂的每一组分的量，但其他技术对于本领域的技术人员将是显而易见 的。

在某些实施例中，通过在提取剂的每次循环测量提取剂的过氧化物含 量、醛含量、和/或酮含量，能够确定有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合 物。提取剂的过氧化物含量、醛含量、和/或酮含量与对照相比随时间推移 的升高指示提取剂的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物水平的不足。如本文所 用，对照能够包括在提取剂的循环利用之前对提取剂的过氧化物含量、醛 含量、和/或酮含量或在上一循环中的提取剂的过氧化物、醛、和/或酮含量 的测量。另选地，对照能够包括在提取剂的使用之前，提取剂的基线的过 氧化物含量、醛含量、和/或酮含量，其中所述提取剂包含有效量的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物。

在某些实施例中，通过测量抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的水平，能 够确定有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。基于在提取剂使用之前提 取剂中抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的初始有效水平，能够测量和监测抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物的水平随时间推移(即，提取剂的每次循环) 的降低。本领域的技术人员能够以实验方式确定抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物的有效水平并监测提取剂，以确保抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的水 平不低于测定的有效水平。测定抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的水平的方 法是本领域中已知的，并且能够包括但不限于气相色谱法(GC)、高压液相 色谱法(HPLC)、紫外光谱法(UV)、或红外光谱法(IR)。

“抗氧化活性指数”是指对抗氧化剂或抗氧化剂混合物使可氧化的油 的氧化速率降低的有效性的量度。抗氧化活性指数能够，例如，使用 Rancimat方法测定。Rancimat方法测定在具有200ppm抗氧化剂的油的氧化 之前的诱导时间除以未强化的油的诱导时间的比率。Rancimat方法是本领 域已知的，例如，参见“Determination of antioxidant activity by the Rancimat  method，”Application Bulletin，Metrohm，No.232/1，1-3页。

在其中进行液-液萃取的发酵过程中，可能期望循环利用提取剂。如美 国专利申请2009/0305370A1和2011/0312043A1中所述，C₁₂至C₂₂脂肪酸 被例示为作为提取剂是可用的，并且，利用原料(例如，玉米)的方法有 利地利用了存在于所述原料中的那些否则将成为多余材料的材料。本文所 述的方法允许反复地循环利用此类提取剂，进一步改善了采用液-液萃取方 法的效率和优点，所述液-液萃取方法具有包含，例如，C₁₂至C₂₂脂肪酸的 提取剂。

例如，在一种发酵方法中，用于从发酵中回收丁醇的提取剂可被氧 化。尽管旨在不受理论的约束，氧化能够，例如，是由于暴露于有氧发酵 条件和/或制备中的任何工艺步骤中氧气的存在。提取剂组合物的氧化能够 导致不希望的过氧化物、醛、酮、和自由基在提取剂组合物中产生，这能 够是对负责发酵的微生物有害的。提取剂组合物的氧化速率能够被提取剂 组合物内的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物抵消或减慢；然而，提取剂的循 环利用能够导致提取剂组合物中的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的消耗或 损耗。

为了降低循环利用的提取剂的氧化速率，提取剂能够暴露于含量降低 的氧气，或者提取剂在不含氧气的环境中被利用。为了降低提取剂暴露于 氧气的水平，发酵过程中的液体(例如，发酵液、提取剂、水)能够被脱 气，或者被不含氧气的气体吹扫。另外，发酵容器的透气能够被减少或排 除。

为了降低提取剂的氧化速率，提取剂能够被储存在用缺乏氧气的惰性 气氛覆盖的储存罐中。例如，提取剂储存罐能够具有主要或完全由氮气、 二氧化碳、惰性气体(例如，氦、氖、氩、氪、氙)、或它们的组合组成 的惰性气氛。二氧化碳能够作为由重组微生物产生的废气来源于发酵过 程。本领域的技术人员能够确定有助于减少或消除提取剂的氧化的用于储 存罐的惰性气氛。

本发明涉及用于在提取剂中维持或提供有效量的抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物以从发酵过程回收丁醇的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体 培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合 成途径的重组微生物、和丁醇；(b)使所述发酵液体培养基与包含有效量的 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物接触，由此所述发酵液体培 养基中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养 基回收丁醇和提取剂组合物的至少一部分；(d)将(c)中回收的提取剂组合物 循环利用至所述发酵液体培养基一次或多次；以及(e)任选地调节所述提取 剂组合物中的有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，由此所述循环利用 的提取剂组合物中的氧化产物形成速率或氧化产物的效应被实质上降低或 避免，使得所述提取剂组合物能够以在步骤(d)中提供的方式被循环利用至 少十次循环。

任选地，所述提取剂组合物能够被循环利用至少20次循环。任选地， 所述提取剂组合物可被循环利用至少50次循环。任选地，所述提取剂组合 物能够被循环利用约5至约100次循环。任选地，所述提取剂组合物能够 被循环利用约10至约80次循环、约20至约60次循环、或约30至约50次 循环。

在某些实施例中，所述方法的步骤能够同时地发生。例如，步骤(b)和 (c)同时发生。又例如，步骤(c)和(d)同时发生。又例如，步骤(b)、(c)、和(d) 同时发生。

在某些实施例中，所述方法的步骤能够在相同容器中发生。例如，步 骤(b)和(c)在相同容器中发生。又例如，步骤(c)和(d)在相同容器中发生。又 例如，步骤(d)和(e)在相同容器中发生。又例如，步骤(b)、(c)、(d)、和(e) 在相同容器中发生。所述容器能够(例如)是发酵容器。

在一些实施例中，步骤(d)可在步骤(c)的下游发生，同时仍然同时地发 生。

调节提取剂的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的量一般是指增加抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物的量。对提取剂组合物的抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物的有效量的调节能够，例如，包括用一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物补充提取剂组合物。补充可通过在添加至发酵容器之前、发酵期 间、或随着提取剂的循环利用，将抗氧化剂或抗氧化剂样化合物添加至提 取剂组合物而发生。补充还可通过提供随着生物质(例如，玉米醪)的、 随着发酵液体培养基的、或由经工程化以制备丁醇的重组微生物产生的抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物发生。在一个实施例中，被作为碳源用于丁醇 的发酵的原料(即，生物质)可基于具有改善的脂肪酸分布型和/或天然的 抗氧化剂或抗氧化剂样组合物来选择，或者可经基因修饰，以提供较少受 氧化影响的或包括了有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的脂肪酸分布 型，用于改善发酵期间丁醇的提取。

通过避免或降低可在丁醇制备的回收和/或其他处理期间暴露于氧气的 提取剂的氧化，有助于循环利用提取剂组合物。提取剂组合物能够在提取 剂组合物的每一循环被调节，以维持提取剂组合物的氧化状态(即，避免 进一步氧化或降低氧化产物对提取剂的影响)。另选地，提取剂组合物能 够被调节一次，使得其包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物至少5 次循环、优选地10次循环、更优选地20次循环、最优选地100次循环。 另选地，提取剂组合物能够每隔一次循环地被调节。本领域的技术人员将 能够确定给定的提取剂组合物在哪次循环数将需要被调节，这可包括监测 提取剂组合物的氧化状态。确定提取剂组合物的氧化状态可通过在每一循 环监测提取剂的一种或多种组分的损耗(例如，玉米油脂肪酸(COFA)中亚 油酸18∶2的损耗)而实现。任选地，确定提取剂组合物的氧化状态可通过 在每一循环监测提取剂的抗氧化活性指数(例如，通过使用Rancimat方 法)而实现。任选地，确定提取剂组合物的氧化状态可通过以下方式而实 现：除了在发酵过程中测量重组微生物的生长速率(例如，碳消耗速率) 或有效收率之外，监测发酵生产能力的一种或多种指标诸如有效速率、有 效滴度、产物醇的有效收率，或通过针对氧化的提取剂的初级或次级氧化 产物的存在的化学分析。

用一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物补充提取剂组合物能够包 括将包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的相同或不同的提取剂组 合物的新鲜的或未使用过的部分添加至提取剂组合物。任选地，用一种或 多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物补充提取剂能够包括将一种或多种抗氧 化剂或抗氧化剂样化合物直接添加至提取剂组合物。待添加至包含无效量 的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物的一种或多种抗氧化剂或 抗氧化剂样化合物的量或者包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的 提取剂组合物的量，能够由本领域的技术人员确定。

氧化过程的关键因素是氧气。在基态下，氧气作为双自由基存在，并 且易于与碳自由基反应，产生过氧自由基。除非这些自由基类被抑制，具 有与氧气反应并氧化的强烈趋势的有机物质能够迅速地劣化。抗氧化剂化 合物能够抑制导致有机物质的氧化的自由基物质。抗氧化剂能够通过作用 机制被分类：初级或链破坏型抗氧化剂和次级或预防性抗氧化剂。一些抗 氧化剂能够表现出多于一种的作用机制。抗氧化剂是本领域已知的，例 如，参见Antioxidants，Peter P.Klemchuk，“Ullmann’s Encyclopedia of  Industrial Chemistry，”第4卷；Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.，第158-178 页(2012)；和Antioxidants：Science，Technology，and Applications，P.K.J.P.D. Wanasundara和F.D.Shahidi，“Bailey’s industrial oil and fat products，”第6 版，第1卷，第11章；John Wiley & Sons，Inc.，第431-489页(2005)。

初级抗氧化剂能够被称为1型或链破坏型抗氧化剂。由于初级抗氧化 剂的化学性质，这类化合物能够充当自由基受体/清除剂，并延缓或抑制起 始步骤或中断自氧化的传播步骤。初级抗氧化剂不能抑制感光的氧化或清 除单态氧。与脂质相比，初级抗氧化剂能够具有对过氧自由基的更高的亲 和力，并且至少由于下列原因主要地与过氧自由基反应。传播是脂质氧化 过程中的缓慢步骤；因此，过氧自由基能够以比其他自由基相对更大的量 存在。另外，过氧自由基能够具有比烷氧基自由基更低的能量；因此，与 不饱和脂肪酸相比，过氧自由基能够更容易地与初级抗氧化剂的低能量的 氢反应。由于自由基清除剂能够以低浓度存在，所述自由基清除剂可能不 能有效地与初始自由基(例如，羟基自由基)竞争。因此，通过与其他化 合物竞争过氧自由基，初级抗氧化剂能够更有效地抑制脂质氧化，并且初 级抗氧化剂能够清除自氧化的传播和其他反应期间形成的过氧自由基和烷 氧基自由基。

表现出初级抗氧化活性的化合物能够包括多羟基酚醛类、无位阻或有 位阻的酚类。存在多种可通过初级抗氧化剂机制起作用的合成的环取代的 酚类以及天然存在的酚类化合物。所述初级抗氧化剂的共同特征是，它们 是具有各种环取代的单羟基酚或多羟基酚。具有酚的羟基邻位或对位的供 电子基团的取代能够通过诱导效应提高所述化合物的抗氧化活性(例如， 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚或BHA)。第二羟基在酚的2-位(邻位)或4-位 (对位)的存在能够提高抗氧化活性(例如，TBHQ)。类胡萝卜素、类黄 酮、酚酸、生育酚和生育三烯酚是用于食品中的天然的初级抗氧化剂。能 用于食品中的合成的初级抗氧化剂还包括但不限于丁基化羟基苯甲醚 (BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙氧喹、没食子酸丙酯(PG)、和叔丁基对 苯二酚(TBHQ)。具有羟基对位的丁基或乙基基团的取代也能够增强抗氧化 活性。位于邻位的支链的烷基基团的取代能够增强分子形成稳定共振结构 的能力，该稳定共振结构能够减少自由基参与传播反应。

次级抗氧化剂能够被称为预防性或II类抗氧化剂。次级抗氧化剂能够 通过多种机制起作用，以减慢氧化反应的速率。与初级抗氧化剂的主要区 别是，次级抗氧化剂不将自由基转化为稳定的分子。次级抗氧化剂能够充 当针对促氧化剂或催化剂金属离子的螯合剂、向初级抗氧化剂提供氢、使 氢过氧化物分解为非自由基物质、使单态氧失活、吸收紫外线辐射、或充 当氧清除剂。次级抗氧化剂能够增强初级抗氧化剂的抗氧化活性。次级抗 氧化剂的示例包括但不限于柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；乙二胺四 乙酸；磷酸盐；抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯；异抗坏血酸；异抗坏血酸 钠；亚硫酸盐；和类胡萝卜素(例如，b-胡萝卜素、番茄红素、和叶黄 素)。

抗氧化剂的示例能够选自但不限于生育酚、生育三烯酚、具有抗氧化 活性的氨基酸、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、其他烷 基化的酚、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、 表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸、没食子酸酯(例如，没食子酸丙 酯)、卡诺醇、鼠尾草酸、乌索酸、丹参I、二氢丹参酮、丹参酮IIA、丹 参酮IIB、丹参新醌B、过氧化物酶类、固定化的硼氢化物、L-抗坏血酸6- 棕榈酸酯、花青素、花青苷、乙氧喹、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、以及它们 的组合。在某些实施例中，所述一种或多种抗氧化剂能够为生育酚。在某 些实施例中，所述一种或多种抗氧化剂能够包括BHT。在某些实施例中， 所述一种或多种抗氧化剂能够包括BHT和BHA的组合。

抗氧化剂能够基于抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的其他有利特性来选 择。其他有利特性能够包括但不限于，提高针对提取剂的丁醇分配系数的 能力(即，能够充当共提取剂)、抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的抗微生 物活性、提高/改善产物醇的两相提取期间的相分离的能力、和在产物醇纯 化期间提高的对提取剂的亲和力(即，抗氧化剂或抗氧化剂样化合物在产 物醇的纯化过程中保持在提取剂中)。某些类别的抗氧化剂能够提高丁醇 的提取效率。提高丁醇分配系数的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的添加能 够导致改善的丁醇提取。在提高针对提取剂的丁醇分配系数方面能够提供 有益效果的抗氧化剂类型的示例能够包括酚醛树脂型抗氧化剂。酚醛树脂 型抗氧化剂能够包括无位阻的和部分位阻的酚。无位阻的和部分位阻的酚 是本领域中已知的，参见，例如，美国专利3,536,662、美国专利 4,744,881。

某些类别的抗氧化剂能够为提取剂同时提供抗氧化剂和抗微生物有益 效果。具有抗微生物活性的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的添加能够导致 丁醇制备的改善。例如，诸如丁基化羟基甲苯(BHT)的抗氧化剂具有对革兰 氏阴性和革兰氏阳性细菌(例如，乳杆菌属(Lactobacillus))的抗微生物活 性，但不影响酵母(例如，酵母属(Saccharomyces))。本领域中已示出抗 氧化剂的抗微生物活性，例如，参见Fung等人，CRC Critical Reviews  Microbiol.12(2)：153-83(1985)；Sankaran，J.Food Science Technol.13：203-4 (1976)；Yankah等人，Lipids AOC Press 33(11)：1139-1145(1998)。

任选地，所述一种或多种抗氧化剂或抗氧化剂样化合物能够是氨基 酸。具有抗氧化活性的氨基酸能够包括但不限于半胱氨酸、甲硫氨酸、苯 丙氨酸、组氨酸、色氨酸、和酪氨酸。具有抗氧化剂或抗氧化剂样活性的 游离氨基酸能够与提取剂组合物一起添加。任选地，在发酵过程中，可发 酵的碳源通过处理生物质来提供，并且生物质能够通过从所述生物质产生 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的酶或其他剂的添加被进一步处理。任选 地，蛋白酶被添加至生物质，由此蛋白酶的添加刺激游离氨基酸从生物质 的释放，所述游离氨基酸为提取剂组合物提供抗氧化剂或抗氧化剂样活 性。不受理论的约束，游离氨基酸能够通过与脂质过氧化反应来源的醛反 应作为抗氧化剂样化合物起作用，中和所述醛对重组微生物的影响，并且 具有抗氧化活性的游离氨基酸能够通过所述游离氨基酸(例如，半胱氨 酸、甲硫氨酸、和芳香族氨基酸)的游离侧链的氧化来淬灭反应性氧自由 基。另外，蛋白酶向生物质的添加能够产生重组微生物可用的氨基酸形式 的另外的游离氨基酸，其能够提高细胞生长速率和丁醇的制备，因为其已 被显示提高了产乙醇生物中的乙醇制备(参见，例如，Piddocke等人， Microb.Cell Fact.10：27(2011))。

蛋白酶能够，例如，在至少85℃的温度下灭活。蛋白酶的灭活在至少 约85℃的温度下能够消耗至少15分钟。用以灭活蛋白酶的方法是本领域已 知的。蛋白酶能够，例如，在重组微生物被引入用于发酵过程之前灭活。 不受理论的约束，蛋白酶在重组微生物的引入之前的灭活，能够防止不希 望的重组微生物的细胞死亡。

任选地，所述蛋白酶是能够水解多肽中的全部氨基酸键的通用蛋白 酶。通用蛋白酶的示例能够包括但不限于和 通用蛋白酶是本领域已知的。

在其中底物包含蛋白质如原料固体的醇制备方法能够被修改，以包括 下列步骤：生物质原料在其中经受化学或酶促水解，以生成用于本方法的 蛋白质水解产物。例如，蛋白质水解产物可从存在于发酵容器中、稀塔馏 物中、全釜馏物湿滤饼中、糖浆中、逆流中、或湿滤饼中的底物产生。

蛋白质水解产物(即，肽和氨基酸的混合物)通常是在化学水解或酶 促水解过程期间由多肽制得，如下文所进一步描述的。根据本发明的方 法，蛋白质水解产物能够通过多种工艺料流(例如，原料浆液、湿滤饼、 发酵罐内、全釜馏物湿滤饼、稀塔馏物、和/或糖浆)的水解产生。

化学水解多肽能够通过化学方法(例如，用于氨基酸分析的那些)被 彻底水解。这些包括使用6N HCl在110℃或在更高的温度进行更短的时间 的液相或汽相酸水解。多肽的水解还可以通过使用微波加热来加速。由于 丝氨酸和苏氨酸是不稳定的，并且在P1是异亮氨酸或缬氨酸且P1’是异亮 氨酸或缬氨酸的情况下，肽键裂解缓慢，水解通常根据时间进行。跟随时 间进程使得能够确定丝氨酸和苏氨酸的降解速率以及异亮氨酸和缬氨酸的 裂解速率。天冬酰胺和谷氨酰胺被水解为相应的天冬氨酸和谷氨酸。半胱 氨酸被氧化为胱氨酸，而甲硫氨酸的一些氧化将产生砜。色氨酸是对氧化 尤其不稳定的，但能够在硫醇试剂的存在下被稳定化至一定的程度(例 如，巯基乙磺酸，巯基乙酸)。

酶促水解由于不同蛋白酶的特异性，多肽至其组成氨基酸的彻底的酶 促转化经常比酸水解更加困难。通过广谱蛋白酶(例如，蛋白酶K、木瓜 蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)或内切肽酶(例如，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶、和弹性蛋白酶)协同的处理，然后是外肽酶(例如，羧肽酶 和氨肽酶)处理以及二肽和三肽肽酶的组合处理，有可能实现相当彻底的 水解，尽管同时可能存在所添加的蛋白酶的一些自体溶解或交叉蛋白水 解。由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)分泌的蛋白酶的混合物即链霉蛋白 酶，将实现许多多肽的彻底的或几乎彻底的水解。所使用的蛋白酶的选择 和浓度可能需要被调整以适合将要水解的多肽。

美国专利5,231,017中描述了用于从包含可发酵的糖类或能够被转化为 糖类的成分的原材料制备乙醇的方法，该方法包括以下步骤：(a)使原材料 在α-淀粉酶的存在下液化，以获得液化醪；(b)使液化醪在葡糖淀粉酶的存 在下糖化，以获得水解淀粉和糖类；(c)水解淀粉和糖类被酵母发酵，以获 得乙醇；(d)回收乙醇；其中蛋白酶在糖化期间被引入液化醪和/或在发酵期 间被引入水解淀粉和糖类。酵母有利地具有提高的乙醇制备速率和收率， 据推测是由于供酵母消耗的能量的提高的可用性。

根据美国专利5,231,017，酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属 (Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属(Candida)、 革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtora、耙菌属(Irpex)、 青霉属(Penicillium)、菌核属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。在实施 例中，所选择的酸性真菌蛋白酶是热稳定的，并且来源于曲霉属 (Aspergillus)诸如黑曲霉(A.niger)、佐氏曲霉(A.saitoi)或米曲霉(A.oryzae)， 来源于毛霉属(Mucor)诸如微小毛霉(M.pusillus)或米黑毛霉(M.miehei)，来 源于内座壳属(Endothia)诸如寄生内座壳(E.parasitica)，或来源于根霉属 (Rhizopus)。最优选地，酸性真菌蛋白酶来源于黑曲霉(Aspergillus niger) (例如，来自黑曲霉变种(Aspergillus niger，var.)的一种酸性真菌蛋白酶可以 以商标AFP-2000够自Solvay Enzymes，Inc.)。

用于本文方法中的酸性真菌蛋白酶的量将取决于该蛋白酶的酶活性， 如本领域的技术人员所已知的。

本领域中还可用的是用于淀粉和蛋白质的同时水解的葡糖淀粉酶和蛋 白酶共混物制剂。例如，Fermenzyme L-400提供了～10-15％葡糖淀粉酶和 ＜1％蛋白酶的混合物(Palo Alto，CA)。

用于从干式分级的玉米制备乙醇的蛋白酶已被研究(Bernardo，Jr.，C. Vidal，Ph.D.Thesis，Univ.of Illinois at Urbana-Champaign，2010)。尤其需注意 的是，发现蛋白酶NS50045(Novozymes，Franklinton，NC)处理导致了由胚乳 和胚芽制得的玉米浆液中全部氨基酸(半胱氨酸除外)的摩尔含量至少1％ 的提高。例如，在对胚乳和胚芽进行蛋白酶处理之后，分别测量到亮氨酸 含量～9.3％和～7.5％的提高。

还提供了用于将有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物引入用于从发 酵过程回收丁醇的提取剂组合物的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体 培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合 成途径的重组微生物、和丁醇，其中所述可发酵的碳源是通过处理生物质 来提供的；(b)使所述发酵液体培养基与提取剂组合物接触，由此所述提取 剂组合物不包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，并且由此所述发 酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；(c)通过用蛋白 酶进一步处理所述生物质，调节所述提取剂组合物中抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物的量，由此所述蛋白酶使游离氨基酸从所述生物质释放，并且由 此所述氨基酸提供具有有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组 合物；(d)从所述发酵液体培养基回收丁醇和提取剂组合物的至少一部分； (e)将(d)中回收的提取剂组合物循环利用至所述发酵液体培养基一次或多 次；以及(f)任选地调节所述提取剂组合物中的有效量的抗氧化剂或抗氧化 剂样化合物，由此所述循环利用的提取剂组合物的氧化的速率或氧化产物 的效应被实质上降低和/或避免，使得所述提取剂组合物能够以在步骤(e)中 提供的方式被循环利用至少十次循环。

在某些实施例中，所述方法的步骤能够同时地发生。例如，步骤(b)和 (c)同时发生。又例如，步骤(c)和(d)同时发生。又例如，步骤(b)、(c)、和(d) 同时发生。

在某些实施例中，所述方法的步骤能够在相同容器中发生。例如，步 骤(b)和(c)在相同容器中发生。又例如，步骤(c)和(d)在相同容器中发生。又 例如，步骤(b)、(c)、和(d)在相同容器中发生。所述容器能够，例如，是发 酵容器。

蛋白酶能够，例如，在至少约85℃的温度下持续至少约15分钟而被 灭活。任选地，所述蛋白酶是能够在多肽中的任何氨基酸键之间水解的通 用蛋白酶。通用蛋白酶的示例能够包括但不限于和 通用蛋白酶是本领域已知的。

还提供了用于避免或降低循环利用的提取剂的氧化速率或氧化产物对 循环利用的提取剂的效应的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养 基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途 径的重组微生物、和丁醇；(b)使所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧 化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基 中的丁醇的至少一部分分配到所述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养基回 收丁醇和提取剂组合物的至少一部分；(d)将抗氧化剂或抗氧化剂样化合物 添加至(c)中回收的提取剂组合物；以及(e)将步骤(d)的提取剂组合物在所述 发酵液体培养基中循环利用一次或多次。

还提供了用于在丁醇发酵过程期间维持提取剂组合物的氧化状态的方 法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可 发酵的碳源、含有工程化丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)使 所述发酵液体培养基与包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取 剂组合物接触，由此所述发酵液体培养基中的丁醇的至少一部分分配到所 述提取剂中；(c)从所述发酵液体培养基回收丁醇和提取剂组合物的至少一 部分；(d)在发酵期间监测丁醇制备的抗氧化活性指数、有效速率、滴度、 收率的一者或多者或重组微生物的生长；(e)当所述监测指示抗氧化活性指 数的降低或对所述重组微生物的毒性时，在步骤(d)之后向所述提取剂组合 物补充抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。

还提供了用于优化从丁醇发酵提取丁醇的方法。所述方法包括：(a)提 供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化 丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提供提取剂组合物，所述提 取剂组合物包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、丁醇和游离脂肪 酸，其中所述抗氧化剂或抗氧化剂样化合物是在发酵期间由所述重组微生 物产生的；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此 丁醇分配到所述提取剂组合物中并从所述提取剂蒸馏。任选地，所述方法 还包括在蒸馏丁醇之后循环利用(c)的提取剂组合物。

还提供了用于改善异丁醇发酵的收率的方法。所述方法包括：(a)提供 发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有工程化异 丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提供包含有效量的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提取剂组合物；以及(c)使 (a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此异丁醇分配到所述提 取剂组合物中，其中异丁醇的收率与不存在所述抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物时的异丁醇的收率相比是改善的。

还提供了用于改善发酵过程期间产生的异丁醇的滴度的方法。所述方 法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳 源、含有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提供包 含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提取剂 组合物；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此异 丁醇分配到所述提取剂组合物中，其中异丁醇制备的滴度与不存在所述抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物时的异丁醇制备的滴度相比是改善的。

还提供了用于改善发酵过程期间的异丁醇制备速率的方法。所述方法 包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、 含有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物、和异丁醇；(b)提供包含有 效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物、异丁醇和游离脂肪酸的提取剂组合 物；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此异丁醇 分配到所述提取剂组合物中，其中异丁醇制备的速率与不存在所述抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物时的异丁醇制备的速率相比是改善的。

还提供了用于提高丁醇发酵过程中分配至提取剂组合物中的丁醇的水 平的方法。所述方法包括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基 包含可发酵的碳源、含有丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提 供包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物，其中所述 抗氧化剂或抗氧化剂样化合物使所述提取剂的丁醇分配系数升高；以及(c) 使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组合物接触，由此与分配进不包含有 效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物或者不包含使提取剂 的丁醇分配系数升高的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物的丁 醇水平相比，提高的水平的丁醇分配到所述提取剂组合物中。

还提供了用于减少丁醇发酵过程中的微生物污染的方法。所述方法包 括：(a)提供发酵液体培养基，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含 有丁醇生物合成途径的重组微生物、和丁醇；(b)提供包含有效量的抗氧化 剂或抗氧化剂样化合物的提取剂组合物，其中所述抗氧化剂或抗氧化剂样 化合物包含抗微生物活性；以及(c)使(a)的发酵液体培养基与(b)的提取剂组 合物接触，由此与利用不包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的提 取剂组合物或者不包含具有抗微生物活性的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物 的提取剂组合物的丁醇发酵相比，丁醇发酵的微生物污染是减少的。

还提供了双相组合物。所述双相组合物能够包含：(a)包含发酵液体培 养基的第一相，所述发酵液体培养基包含可发酵的碳源、含有用于制备产 物醇的工程化生物合成途径的重组微生物、和产物醇；和(b)包含提取剂组 合物的第二相，所述提取剂组合物包含有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化 合物、产物醇、和游离脂肪酸，其中所述游离脂肪酸和抗氧化剂或抗氧化 剂样化合物来源于所述可发酵的碳源。任选地，所述工程化生物合成途径 是丁醇生物合成途径，并且所述产物醇是丁醇。

任选地，包含有效量的抗氧化剂的提取剂组合物具有至少约1.1的抗 氧化活性指数。所述提取剂组合物的抗氧化活性指数可为至少约1.1至约 15、至少约2至约12、或至少约5至约10。所述提取剂组合物的抗氧化活 性指数可为约1.1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、 8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、或 15。

任选地，所述提取剂选自玉米油脂肪酸(COFA)、大豆油脂肪酸 (SOFA)、蓖麻油脂肪酸、油醇、基于脂肪酸甲酯(FAME)的COFA、基于 FAME的SOFA、脂肪酸丁酯(FABE)、以及它们的混合物。

重组微生物

不受理论的束缚，据信本文所述的方法可与任何产生醇的微生物、尤 其是产生醇的重组微生物相结合地使用。

产生醇的重组微生物也是本领域已知的(例如，Ohta等人，Appl. Environ.Microbiol.57：893-900(1991)；Underwood等人，Appl.Envrion. Microbiol.68：1071-81(2002)；Shen和Liao，Metab.Eng.10：312-20(2008)； Hahnai等人，Appl.Environ.73：7814-8(2007)；美国专利5,514,583；美国专 利5,712,133；国际公布WO 1995/028476；Feldmann等人，Appl.Microbiol. Biotechnol.38：354-61(1992)；Zhang等人，Science 267：240-3(1995)；美国专 利公布2007/0031918A1；美国专利7,223,575；美国专利7,741,119；美国专 利公布2009/0203099A1；美国专利公布2009/0246846A1；和国际公布WO  2010/075241，上述文献以引用方式并入本文)。

例如，微生物的代谢途径可经基因修饰以产生丁醇。这些途径也可经 修饰以减少或消除非期望的代谢物，从而改善产物醇的收率。任选地，在 其中微生物的生长和丁醇制备需要氧气的发酵方法中，这些途径能够被修 饰，以实现微生物的生长和丁醇制备与提取剂氧化动力学之间的适当平 衡。例如，所述途径能够被修饰，以提高微生物在较低的氧气水平或在氧 气不存在时的生长速率，从而降低提取剂氧化动力学。由微生物制备丁醇 公开于例如美国专利7,851,188；7,993,889；8,178,328，8,206,970；美国专利 申请公布2007/0292927；2008/0182308；2008/0274525；2009/0305363； 2009/0305370；2011/0250610；2011/0313206；和2011/0111472中，它们每个 全文以引用方式并入本文。在一些实施例中，微生物包含丁醇生物合成途 径或丁醇异构体诸如1-丁醇、2-丁醇、或异丁醇的生物合成途径。在一些 实施例中，生物合成途径将丙酮酸转化成发酵产物。在一些实施例中，生 物合成途径将丙酮酸以及氨基酸转化成发酵产物。在一些实施例中，催化 途径中底物至产物的转化的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种多 肽在微生物中被异源性多核苷酸编码。在一些实施例中，微生物中的异源 性多核苷酸编码所有多肽，所述多肽催化途径中底物至产物的转化。

在一些实施例中，微生物可为细菌、蓝细菌、丝状真菌、或酵母。能 够经由生物合成途径制备产物醇(例如，丁醇)的合适的微生物包括下列 属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属 (Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌属 (Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属 (Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌 (Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆 菌属(Alcaligenes)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、节杆菌(Arthrobacter)、棒状 杆菌(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、耶氏酵母属 (Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利 氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、酒香酵母属 (Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨 酵母属(Issatchenkia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、Yamadazyma或酵母属 (Saccharomyces)。在一个实施例中，重组微生物可选自大肠杆菌 (Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌属 (Bacillus lichenifonnis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球 菌(Rhodocuccus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳 杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球 菌(Enterococcus gallinarium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、Candida  methanosorbosa、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces  thermotolerans)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、汉逊德巴利酵母 (Debaryomyces hansenii)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一个实 施例中，所述经基因修饰的微生物是酵母。在一个实施例中，所述经基因 修饰的微生物是克拉布特里阳性酵母，其选自酵母属(Saccharomyces)、接 合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德克酵 母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及 假丝酵母属(Candida)的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限 于，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克氏酵母(Saccharomyces  kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母 (Saccharomyces bayanus)、Saccharomyces mikitae、奇异酵母(Saccharomyces  paradoxus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、芽殖酵母(Saccharomyces  castelli)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、拜耳接合酵母 (Zygosaccharomyces bailli)、和光滑假丝酵母(Candida glabrata)。

在一些实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是本领域已知的，并且可得 自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(American Type  Culture Collection)(Rockville，MD)、荷兰真菌培养物保藏中心 (Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre)、 LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、 Martrex、和Lallemand。酿酒酵母(S.cerevisiae)包括但不限于BY4741、 CEN.PK 113-7D、Ethanol酵母、Ferm Pro^TM酵母、XR酵 母，Gert Strand Prestige Batch Turbo醇酵母、Gert Strand Pot Distillers酵 母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMax^TMGreen酵母、FerMax^TMGold 酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960、和 CBS7961。

在一些实施例中，微生物可被固定或封装。例如，可使用藻酸酯、藻 酸钙、或聚丙烯酰胺凝胶将微生物固定或封装，或通过在多种高表面积载 体矩阵诸如硅藻土(diatomite)、硅藻土(celite)、硅藻土(diatomaceous earth)、 硅胶、塑料或树脂上诱导生物膜形成来将微生物固定或封装。在一些实施 例中，ISPR可与固定的或封装的微生物结合地使用。该组合可提高生产能 力诸如比体积生产能力、代谢率、产物醇收率、和产物醇耐受性。此外， 固定和封装可使工艺条件诸如剪切对微生物的影响最小化。

可使用的用于制备异丁醇的生物合成途径包括Donaldson等人在美国 专利7,851,188；美国专利7,993,388；以及国际公布WO 2007/050671中所 公开的那些，上述文献以引用方式并入本文。在一个实施例中，异丁醇生 物合成途径包括下列底物至产物的转化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸 还原异构酶催化；

c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟 酸脱水酶催化；

d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链α-酮酸脱羧 酶催化；以及，

e)来自步骤d)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转 化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还 原异构酶催化；

c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至a-酮异戊酸，其可被例如二羟 酸脱水酶催化；

d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至缬氨酸，其可被例如转氨酶或缬氨酸 脱氢酶催化；

e)来自步骤d)的缬氨酸至异丁胺，其可被例如缬氨酸脱羧酶催化；

f)来自步骤e)的异丁胺至异丁醛，其可被例如ω转氨酶催化；以 及，

g)来自步骤f)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

在另一个实施例中，异丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转 化：

a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸 还原异构酶催化；

c)来自步骤b)的2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如乙酰 羟酸脱水酶催化；

d)来自步骤c)的α-酮异戊酸至异丁酰-CoA，其可被例如支链酮酸脱 氢酶催化；

e)来自步骤d)的异丁酰-CoA至异丁醛，其可被例如酰化乙醛脱氢酶 催化；以及，

f)来自步骤e)的异丁醛至异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

可使用的用于制备1-丁醇的生物合成途径包括在美国专利申请公布 2008/0182308和WO2007/041269中描述的那些，上述文献以引用方式并入 本文。在一个实施例中，1-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转 化：

a)乙酰-CoA至乙酰乙酰-CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催 化；

b)来自步骤a)的乙酰乙酰-CoA至3-羟丁酰-CoA，其可被例如3-羟丁 酰-CoA脱氢酶催化；

c)来自步骤b)的3-羟丁酰-CoA至巴豆酰-CoA，其可被例如巴豆酸酶 催化；

d)来自步骤c)的巴豆酰-CoA至丁酰-CoA，其可被例如丁酰-CoA脱 氢酶催化；

e)来自步骤d)的丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以 及，

f)来自步骤e)的丁醛至1-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。

可使用的用于制备2-丁醇的生物合成途径包括Donaldson等人在美国 专利8,206,970；美国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870；国际公 布WO 2007/130518和WO 2007/130521中所描述的那些，这些专利均以引 用方式并入本文。在一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至 产物的转化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶 催化；

c)来自步骤b)的乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻氨基酶 催化；

d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸，其可被例如氨 基丁醇激酶催化；

e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮，其可被例如氨基丁醇 磷酸磷酸化酶催化；以及，

f)来自步骤e)的2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。

在另一个实施例中，2-丁醇生物合成途径包括下列底物至产物的转 化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶 催化；

c)乙偶姻至来自步骤b)的2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催 化；

d)来自步骤c)的2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催 化；以及，

e)来自步骤d)的2-丁酮至2-丁醇，其可被例如丁醇脱氢酶催化。

可使用的用于制备2-丁酮的生物合成途径包括美国专利8,206,970和美 国专利申请公布2007/0292927和2009/0155870中描述的那些，上述文献以 引用方式并入本文。在一个实施例中，2-丁酮生物合成途径包括下列底物 至产物的转化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶 催化；

c)来自步骤b)的乙偶姻至3-氨基-2-丁醇，其可被例如乙偶姻氨基酶 催化；

d)来自步骤c)的3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸，其可被例如氨 基丁醇激酶催化；以及，

e)来自步骤d)的3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮，其可被例如氨基丁醇 磷酸磷酸化酶催化。

在另一个实施例中，2-丁酮生物合成途径包括下列底物至产物的转 化：

a)丙酮酸至α-乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

b)来自步骤a)的α-乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶 催化；

c)来自步骤b)的乙偶姻至2，3-丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催 化；

d)来自步骤c)的2，3-丁二醇至2-丁酮，其可被例如二醇脱水酶催 化。

有机提取剂

可用于本文所述的方法的提取剂是与水不混溶的有机溶剂。合适的有 机提取剂应当满足就用于丁醇的制备或回收的商业两相萃取发酵的理想溶 剂而言的标准。具体地，提取剂应当(i)对产生丁醇的微生物(诸如例如本 文所述的重组微生物)是无毒的，(ii)基本上不与发酵液体培养基混溶，(iii) 就丁醇的提取而言具有高的分配系数，(iv)就营养物质的提取而言具有低的 分配系数，(v)具有低的与发酵液体培养基形成乳液的趋势，并且(vi)是低成 本和无危害的。用于本文所公开的方法的合适的有机提取剂选自C₁₂至C₂₂脂肪醇、C₁₂至C₂₂脂肪酸、C₁₂至C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂至C₂₂脂肪醛以及它 们的混合物。如本文所用，术语“它们的混合物”涵盖了这些组成员之内 的混合物和这些组成员之间的混合物，例如C₁₂至C₂₂脂肪醇之内的混合 物，以及例如C₁₂至C₂₂脂肪醇和C₁₂至C₂₂脂肪酸之间的混合物。

合适的有机提取剂还选自油醇(CAS No.143-28-2)、二十二醇(CAS  No.661-19-8)、鲸蜡醇(CAS No.36653-82-4)、月桂醇(也被称为1-十 二烷醇)(CAS No.112-53-8)、肉豆蔻醇(112-72-1)、硬脂醇(CAS No. 112-92-5)、1-十一烷醇(CAS No.112-42-5)、油酸(CAS No.112-80- 1)、月桂酸(CAS No.143-07-7)、肉豆蔻酸(CAS No.544-63-8)、硬脂 酸(CAS No.57-11-4)、肉豆蔻酸甲酯(CAS No.124-10-7)、油酸甲酯 (CAS No.112-62-9)、十一醛(CAS No.112-44-7)、月桂醛(CAS No. 112-54-9)、20-甲基十一醛(CAS No.110-41-8)、以及它们的混合物。这 些有机提取剂是可从多种来源(诸如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO))以各 种等级商购获得的，它们中的许多可能适合用于萃取发酵，以制备或回收 丁醇。技术级包含化合物的混合物，包括所期望的组分以及更高和更低的 脂肪组分。例如，一种可商购获得的技术级油醇包含约65％的油醇以及更 高和更低的脂肪醇的混合物。

在某些实施例中，所述提取剂能够是下列脂肪酸的一者或多者：杜鹃 花酸、癸酸、辛酸、蓖麻、椰子(即，作为天然存在的脂肪酸的组合，例 如包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、己酸、花生 酸、油酸、和亚油酸)、二聚体、异硬脂酸、月桂酸、亚麻籽、肉豆蔻 酸、油酸、橄榄、棕榈油、棕榈酸、棕榈仁、花生、壬酸、蓖麻油酸、癸 二酸、大豆、硬脂酸、妥尔油、牛油、＃12羟基硬脂酸、或任何种子油。在 一些实施例中，所述提取剂能够是二酸、壬二酸的、二聚体和癸二酸的一 者或多者。因此，在一些实施例中，所述提取剂能够是两种或更多种不同 脂肪酸的混合物。在一些实施例中，所述提取剂能够是来源于来自天然油 的甘油酯的化学或酶促水解的脂肪酸。例如，在一些实施例中，所述提取 剂能够是通过天然油(诸如生物质脂质)的酶促水解获得的游离脂肪酸。 在一些实施例中，所述提取剂能够是选自下列的脂肪酸提取剂：脂肪酸、 脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸的低级醇酯、脂肪酸乙二醇酯、 羟基化三甘油酯、以及它们的混合物，得自天然油(诸如生物质脂质)的 化学转化，如美国专利公布2011/0312044中所述。在此类实施例中，用于 制备提取剂的生物质脂质能够是从其获得原料的相同的或不同的生物质来 源。例如，在一些实施例中，用于制备提取剂的生物质脂质能够来源于大 豆，而原料的生物质来源是玉米。就提取剂对原料而言，不同生物质来源 的任何可能的组合均可被使用，如对于本领域的技术人员应当显而易见 的。在一些实施例中，另外的提取剂包括COFA。

本领域的适当技术人员能够知道，使用有机提取剂的混合物可以是有 利的。例如，溶剂混合物可被用于提高产物的分配系数。另外，溶剂混合 物可被用于调节和优化溶剂的物理特性，诸如密度、沸点、和粘度。

用于制备的生长

本文所公开的重组宿主细胞与适合的碳底物接触，通常是在发酵液体 培养基中。附加的碳底物可包括但不限于单糖诸如果糖，低聚糖诸如乳 糖、麦芽糖、半乳糖、或蔗糖，多糖诸如淀粉或纤维素或它们的混合物和 来自可再生的原料诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜、和大麦 芽的未纯化的混合物。其它碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐、或甘 油。

此外，碳底物还可是一碳底物诸如二氧化碳、或甲醇，其向关键生物 化学中间体的代谢转化已被证明。除一和二碳底物之外，甲基营养生物体 还已知利用多种其他包含碳的化合物诸如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸用于 代谢活动。例如，甲基营养酵母已知利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘 油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，第7版(1993)， 415-32，编辑：Murrell，J.Collin，Kelly，Don P.；Publisher：Intercept， Andover，UK)。相似地，假丝酵母属(Candida)的多种菌种将会代谢丙氨 酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，预期 本发明中利用的碳源可涵盖广阔范围的包含碳的底物，并将仅受生物体的 选择的限制。

尽管预期全部上文提及的碳底物以及它们的混合物均适合本发明，在 一些实施例中，所述碳底物是葡萄糖、果糖、和蔗糖，或对于经改性以利 用C5糖类的酵母细胞是这些与C5糖类诸如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。 蔗糖可来源于可再生的糖源诸如甘蔗、糖用甜菜、木薯、甜高粱、以及它 们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过淀粉基原料包括谷物诸如玉米、小 麦、裸麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物的糖化而来源于可再生的谷物 来源。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维 素的生物质或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布 2007/0031918 A1中所述，该专利以引用方式并入本文。当与碳底物相关地 使用时，生物质指任何纤维素或木质纤维素材料，并且包括含有纤维素的 材料，以及任选地还含有半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材 料。生物质也可包含附加组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质能够来源于单 一来源，或生物质可包括来源于多于一种来源的混合物；例如，生物质可 包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限 于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的 淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于：玉米 粒、玉米棒、作物残余诸如玉米壳、玉米秸秆、玉米纤维、草、小麦、小 麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、 大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木 和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。

除适当的碳源之外，发酵液体培养基还必须包含本领域的技术人员已 知的适合培养物的生长并促进本文所述的酶途径的合适的矿物、盐、辅因 子、缓冲液和其他组分。

在一些实施例中，丁醇菌以至少90％的有效收率、至少91％的有效收 率、至少92％的有效收率、至少93％的有效收率、至少94％的有效收率、 至少95％的有效收率、至少96％的有效收率、至少97％的有效收率、至少 98％的有效收率、或至少99％的有效收率制备丁醇。在一些实施例中，丁 醇菌以约55％至约75％的有效收率、约50％至约80％的有效收率、约45％ 至约85％的有效收率、约40％至约90％的有效收率、约35％至约95％的有 效收率、约30％至约99％的有效收率、约25％至约99％的有效收率、约 10％至约99％的有效收率、或约10％至约100％的有效收率制备丁醇。

培养条件

通常，使细胞在约20℃至约40℃的温度范围内在适当培养基中生长。 在一些实施例中，细胞在20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、 37℃或40℃的温度下生长。在一些实施例中，细胞在约25℃至约40℃的温 度下在适当培养基中生长。本发明中的合适的生长培养基是普通的商业制 备的培养基，诸如Luria Bertani(LB)液体培养基、沙氏葡糖(SD)液体培养基 或酵母培养基(YM)液体培养基、或包含酵母氮源基础、硫酸铵、和右旋糖 (作为碳源/能量源)的液体培养基，或YPD培养基——蛋白胨、酵母提取 物和右旋糖以大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株生长的最佳比 例混合的共混物。其他限定的或合成的生长培养基也能够被使用，微生物 学或发酵科学领域的技术人员将知道用于特定微生物生长的适当培养基。 已知用于直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷2’，3’-单磷酸 (cAMP)，也可以掺入发酵液体培养基中。

适于发酵的pH范围是介于pH 5.0至pH 9.0之间，其中pH 6.0至pH  8.0优选作为起始条件。适于酵母发酵的pH范围通常是介于约pH 3.0至约 pH 9.0之间。在一个实施例中，约pH 5.0至约pH 8.0被用于初始条件。适 于其他微生物发酵的pH范围是介于约pH 3.0至约pH 7.5之间。在一个实 施例中，约pH 4.5至约pH 6.5被用于初始条件。

发酵能够在有氧或厌氧条件下进行。在一个实施例中，厌氧或微氧条 件被用于发酵。

在一些实施例中，培养条件是使得发酵没有呼吸作用地发生的。例 如，细胞能够在微氧或厌氧条件下被培养在发酵罐中。

用于使用两相萃取发酵制备丁醇的方法

微生物可以在合适的发酵罐中被培养于合适的发酵液体培养基中，以 制备丁醇。任何合适的发酵罐均可使用，包括搅拌槽发酵罐、气升式发酵 罐、气泡发酵罐、或它们的任何组合。用于微生物培养物的维持和生长的 材料和方法是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的(参见例如 Bailey等人，Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw Hill， New York，1986)。根据微生物、发酵、和方法的具体要求，必须考虑适当 的发酵液体培养基、pH、温度、以及对有氧、微氧、或厌氧条件的要求。 所使用的发酵液体培养基不是决定性的，但其必须支持所使用的微生物的 生长并促进制备所期望的丁醇产物所必需的生物合成途径。常规的发酵液 体培养基可被使用，包括但不限于含有有机氮源(诸如酵母提取物或蛋白 胨)和至少一种可发酵的碳源的复合培养基；基本培养基；和确定成分培 养基。合适的可发酵的碳源包括但不限于单糖，诸如葡萄糖或果糖；二糖 诸如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖诸如淀粉或纤维素；一碳底物；氨基酸； 以及它们的混合物。除适当的碳源之外，发酵液体培养基还可包含合适的 氮源，诸如铵盐、酵母提取物或蛋白胨、矿物质、盐类、辅因子、缓冲液 和其他组分，这是本领域的技术人员已知的(Bailey等人，参见上文)。 用于萃取发酵的合适的条件取决于所使用的特定微生物，并且可由本领域 的技术人员使用常规实验容易地确定。

用于使用萃取发酵回收丁醇的方法

可从包含丁醇、水、至少一种可发酵的碳源、和已经基因修饰(即， 遗传工程的)以通过工程化生物合成途径从至少一种碳源制备丁醇的重组 微生物的发酵液体培养基回收丁醇。此类经基因修饰的微生物能够选自上 文所公开的组。所述方法的第一步骤是使发酵液体培养基与上文所述的与 水不混溶的有机提取剂接触，以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混 合物。“接触”是指使发酵液体培养基和有机提取剂在发酵过程期间的任 何时间发生物理接触。

有机提取剂可在发酵开始时与发酵液体培养基接触，从而形成双相发 液体酵培养基。另选地，有机提取剂可在微生物已达到所期望的生长量 (这能够通过测量培养物的光密度来确定)之后与发酵液体培养基接触。

另外，有机提取剂可在发酵液体培养基中的丁醇水平达到预设水平 (例如，在丁醇浓度达到毒性水平之前)的时间与发酵液体培养基接触。 可以使用本领域已知的方法，诸如气相色谱法或高效液相色谱法，在发酵 期间监测丁醇浓度。

发酵可在有氧条件下运行一段足以使培养物达到预设的生长水平(这 可通过光密度测量来确定)的时间。在达到预设的生长水平之后，发酵条 件可被转换至微氧或萃取条件。将发酵条件转换至微氧或萃取条件能够， 例如，降低提取剂的氧化水平。

发酵液体培养基与有机提取剂接触，并且丁醇产物分配至有机提取剂 中，降低了水相中的浓度，从而限制了生产微生物向抑制性丁醇产物的暴 露。待使用的有机提取剂的体积取决于多种因素，包括发酵液体培养基的 体积、发酵罐的尺寸、就丁醇产物而言提取剂的分配系数、和发酵模式。 在实施例中，有机提取剂的体积是发酵罐工作体积的约3％至约60％。与有 机提取剂的接触可在发酵容器内发生，但也可在发酵容器下游的独立容器 中发生。

从含丁醇的有机相中回收丁醇可利用本领域已知的方法完成，所述方 法包括但不限于蒸馏、树脂吸附、分子筛分离、全蒸发等。具体地，蒸馏 可用于从含丁醇的有机相回收丁醇。

任何在发酵运行完成之后残留在发酵液体培养基中的丁醇可通过使用 新鲜的或循环利用的有机提取剂继续提取而被回收。能够用抗氧化剂或抗 氧化剂样化合物来补充新鲜的或循环利用的有机提取剂。另选地，能够使 用本领域已知的方法从发酵液体培养基回收丁醇，诸如蒸馏、共沸蒸馏、 液-液萃取、吸附、气提、膜蒸发、全蒸发等。

两相萃取发酵方法可以以连续模式在搅拌槽发酵罐中进行。在这种模 式中，发酵液体培养基和含丁醇的有机提取剂的混合物被从发酵罐去除。 通过本领域已知的装置，包括但不限于虹吸、滗析、离心、使用重力沉降 器、膜辅助的相分裂等，使两种相分离，如上文所述。分离之后，发酵液 体培养基可循环利用至发酵罐，或者可以被新鲜的培养基替换。然后，处 理提取剂以回收丁醇产物，如上文所述。提取剂随后可被循环利用回发酵 罐中，用于进一步提取产物。另选地，新鲜的提取剂可以被连续地添加至 发酵罐，以替换所去除的提取剂。这种连续运行模式提供了若干优点。由 于产物被连续地从发酵罐去除，需要的有机提取剂体积较小，使得能够使 用较大体积的发酵液体培养基。这导致了较高的制备收率。有机提取剂的 体积可为发酵罐工作体积的约3％至约50％；发酵罐工作体积的3％至约 20％；或发酵罐工作体积的3％至约10％。在发酵罐中使用尽可能最小量的 提取剂对于使水相的体积最大化，并因此使发酵罐中细胞的量最大化是有 益的。所述方法可以完全连续模式运行，其中提取剂被连续地在发酵罐和 分离设备之间循环利用，并且发酵液体培养基被连续地从发酵罐去除并用 新鲜培养基补充。在这种完全连续模式中，不允许丁醇产物达到临界毒性 浓度，并且连续地提供新鲜的营养物质，使得发酵可以运行很长的一段时 间。任选地，在提取剂的循环利用导致提取剂的氧化的情况下，能够用抗 氧化剂或抗氧化剂样化合物补充提取剂。可用于运行这些模式的两相萃取 发酵的设备是本领域中为人们所熟知的。示例描述于，例如Kollerup等人 的美国专利4,865,973中。

还可以使用分批发酵模式。分批发酵是本领域中已知的，它是封闭的 系统，其中发酵液体培养基的组成在发酵开始时被设置，并且在发酵期间 不经受人工改变。在这种模式中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵 罐，并且提取剂在发酵过程期间不被去除。尽管这种模式比上文所述的连 续或完全连续模式更简单，但它需要更大体积的有机提取剂来使发酵液体 培养基中抑制性丁醇产物的浓度最小化。因此，发酵液体培养基的体积更 小，并且所制备的产物的量是比采用连续模式获得的量更小的。分批模式 中的有机溶剂的体积可为发酵罐工作体积的20％至约60％；或发酵罐工作 体积的30％至约60％。在提取剂被氧化的情况下，在发酵罐种使用尽可能 最小体积的提取剂是有利的，至少因为更低水平的抗氧化剂或抗氧化剂样 化合物将需要被添加至循环利用的提取剂以恢复或提高提取剂的抗氧化能 力。

还可以使用分批补料发酵模式。分批补料发酵是标准的分批系统的变 型，其中营养物质，例如葡萄糖，在发酵期间被递增地添加。营养物质的 添加量和速率可以通过常规实验确定。例如，发酵液体培养基中的临界营 养物质浓度可以在发酵期间被监测。另选地，可监测更容易测量的因素诸 如pH、溶解氧、和废气(诸如二氧化碳)的分压。从这些测量的参数，可 以确定营养物质添加的速率。用于这种模式中的有机溶剂的量是与上文所 述的分批模式中所使用的相同的。

产物的提取可以在发酵罐的下游进行，而不是在原位。在这种模式 中，丁醇产物向有机提取剂中的提取是在从发酵罐移出的发酵液体培养基 上进行的。所使用的有机溶剂的量是发酵罐工作体积的约20％至约60％； 或发酵罐工作体积的30％至约60％。发酵液体培养基可以被连续地或周期 性地从发酵罐去除，并且通过有机提取剂对丁醇产物的提取可以在有或没 有从发酵液体培养基去除细胞的情况下进行。可通过本领域已知的方法从 发酵液体培养基去除细胞，包括但不限于过滤或离心。在通过上文所述的 方法将发酵液体培养基与提取剂分离之后，发酵液体培养基可被循环利用 至发酵罐中、被废弃、或经处理以去除任何残余的丁醇产物。相似地，所 分离的细胞也可被循环利用至发酵罐中。在用以回收丁醇产物的处理之 后，提取剂可被循环利用，以用于提取过程中。另选地，可以使用新鲜的 提取剂。在这种模式中，溶剂不存在于发酵罐中，因此溶剂的毒性远不是 问题。如果细胞在与溶剂接触之前被从发酵液体培养基分离，则溶剂毒性 的问题被进一步减小。此外，使用这种模式，形成乳液的可能性更小并且 溶剂的蒸发被最小化，减轻了环境问题。

提供了用于制备丁醇的方法，其中已经被基因修饰以能够将至少一种 可发酵的碳源转化为丁醇的微生物在双相发酵液体培养基中生长。所述双 相发酵液体培养基包含水相和与水不混溶的有机提取剂，如上文所述，其 中所述双相发酵液体培养基包含按体积计约3％至约60％的有机提取剂。微 生物可以在双相发酵液体培养基中生长一定时间，所述时间足够将丁醇提 取至提取剂中以形成含丁醇的有机相。在其中发酵液体培养基还包含乙醇 的情况下，含丁醇的有机相可包含乙醇。然后将含丁醇的有机相与水相分 离，如上文所述。随后，从含丁醇的有机相回收丁醇，如上文所述。

现在参见图5，示出用于使用原位萃取发酵制备和回收丁醇的方法的 一个实施例的示意图。至少一种可发酵的碳源的水性料流10被引入发酵罐 20中，其包含经基因修饰以将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的至少一 种微生物(未示出)。第一与水不混溶的提取剂的料流12和任选的第二与 水不混溶的提取剂的料流14被引入容器16，其中提取剂被混合，以形成提 取剂18。提取剂18的料流被引入发酵罐20中，由此发生发酵液体培养基 和提取剂之间的接触，以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。 在循环利用提取剂时，在提取剂具有减弱的抗氧化剂能力的情况下，提取 剂能够在料流被引入发酵罐中之前或同时被抗氧化剂或抗氧化剂样化合物 或具有抗氧化剂或抗氧化剂样能力的新鲜提取剂补充。同时包含水相和有 机相的料流26被引入容器38中，其中进行水相和有机相的分离，以产生 含丁醇的有机相40和水相42。

现在参见图6，示出使用原位萃取发酵制备和回收丁醇的方法的一个 实施例的示意图。至少一种可发酵的碳源的水性料流10被引入发酵罐20 中，其包含经基因修饰以将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的至少一种 微生物(未示出)。第一与水不混溶的提取剂的料流12和任选的第二与水 不混溶的提取剂的料流14被分别引入发酵罐20中，由此发生发酵液体培 养基与提取剂之间的接触，以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合 物。在循环利用提取剂时，在提取剂具有减弱的抗氧化剂能力的情况下， 第一与水不混溶的提取剂、第二与水不混溶的提取剂或两者能够在料流被 引入发酵罐中之前或同时被抗氧化剂或抗氧化剂样化合物或具有抗氧化剂 或抗氧化剂样能力的新鲜提取剂补充。同时包含水相和有机相的料流26被 引入容器38中，其中进行水相和有机相的分离，以产生含丁醇的有机相40 和水相42。

现在参见图7，示出使用原位萃取发酵制备和回收丁醇的方法的一个 实施例的示意图。至少一种可发酵的碳源的水性料流10被引入第一发酵罐 20中，其包含经基因修饰以将至少一种可发酵的碳源转化为丁醇的至少一 种微生物(未示出)。第一与水不混溶的提取剂的料流12被引入发酵罐20 中，并且包含所述第一溶剂和发酵罐20的内容物的混合物的料流22被引 入第二发酵罐24。任选的第二与水不混溶的提取剂的料流14被引入第二发 酵罐24中，由此发生发酵液体培养基与提取剂之间的接触，以形成包含水 相和含丁醇的有机相的两相混合物。在循环利用提取剂时，在提取剂具有 减弱的抗氧化剂能力的情况下，第一与水不混溶的提取剂、第二与水不混 溶的提取剂或两者能够在料流被引入发酵罐中之前或同时被抗氧化剂或抗 氧化剂样化合物或具有抗氧化剂或抗氧化剂样能力的新鲜提取剂补充。同 时包含水相和有机相的料流26被引入容器38中，其中进行水相和有机相 的分离，以产生含丁醇的有机相40和水相42。

现在参见图8，示出其中产物的提取是在发酵罐的下游而不是原位进 行的制备和回收丁醇的方法的一个实施例的示意图。至少一种可发酵的碳 源的水性料流110被引入发酵罐120中，其包含经基因修饰以将至少一种 可发酵的碳源转化为丁醇的至少一种微生物(未示出)。第一与水不混溶 的提取剂的料流112和任选的第二与水不混溶的提取剂的料流114被引入 容器116中，其中与水不混溶的提取剂被混合，以形成提取剂118。发酵罐 120中的发酵液体培养基的至少一部分(示出为料流122)被引入容器124 中。提取剂118的料流也被引入容器124中，由此发生发酵液体培养基和 提取剂之间的接触，以形成包含水相和含丁醇的有机相的两相混合物。在 循环利用提取剂时，在提取剂具有减弱的抗氧化剂能力的情况下，第一与 水不混溶的提取剂、第二与水不混溶的提取剂或两者能够在料流被引入发 酵罐中之前或同时被抗氧化剂或抗氧化剂样化合物或具有抗氧化剂或抗氧 化剂样能力的新鲜提取剂补充。同时包含水相和有机相的料流126被引入 容器138中，其中进行水相和有机相的分离，以产生含丁醇的有机相140 和水相142。

现在参见图9，示出在其中产物的提取是在发酵罐的下游而不是原位 进行的制备和回收丁醇的方法的一个实施例的示意图。至少一种可发酵的 碳源的水性料流110被引入发酵罐120中，其包含经基因修饰以将至少一 种可发酵的碳源转化为丁醇的至少一种微生物(未示出)。第一与水不混 溶的提取剂的料流112和任选的第二与水不混溶的提取剂的料流114被分 别引入容器124中，其中与水不混溶的提取剂被混合，以形成提取剂118。 发酵罐120中的发酵液体培养基的至少一部分(示出为料流122)也被引入 容器124中，由此发生发酵液体培养基与提取剂之间的接触，以形成包含 水相和含丁醇的有机相的两相混合物。在循环利用提取剂时，在提取剂具 有减弱的抗氧化剂能力的情况下，第一与水不混溶的提取剂、第二与水不 混溶的提取剂或两者能够在料流被引入发酵罐中之前或同时被抗氧化剂或 抗氧化剂样化合物或具有抗氧化剂或抗氧化剂样能力的新鲜提取剂补充。 同时包含水相和有机相的料流126被引入容器138中，其中所述水相和有 机相的分离，以产生含丁醇的有机相140和水相142。

现在参见图10，示出其中产物的提取是在发酵罐的下游而不是原位进 行的制备和回收丁醇的方法的一个实施例的示意图。至少一种可发酵的碳 源的水性料流110被引入发酵罐120中，其包含经基因修饰以将至少一种 可发酵的碳源转化为丁醇的至少一种微生物(未示出)。第一与水不混溶 的提取剂的料流112被引入容器128中，并且发酵罐120中的发酵液体培 养基的至少一部分(示出为料流122)也被引入容器128中。包含第一与水 不混溶的提取剂与发酵罐120的内容物的混合物的料流130被引入第二容 器132中。任选的第二与水不混溶的提取剂的料流114被引入第二容器132 中，由此发生发酵液体培养基与提取剂之间的接触，以形成包含水相和含 丁醇的有机相的两相混合物。在循环利用提取剂时，在提取剂具有减弱的 抗氧化剂能力的情况下，第一与水不混溶的提取剂、第二与水不混溶的提 取剂或两者能够在料流被引入发酵罐中之前或同时被抗氧化剂或抗氧化剂 样化合物或具有抗氧化剂或抗氧化剂样能力的新鲜提取剂补充。同时包含 水相和有机相的料流134被引入容器138中，其中进行水相和有机相的分 离，以产生含丁醇的有机相140和水相142。

本文所述的萃取方法能够作为分批方法运行，或者能够以连续模式运 行，其中新鲜的提取剂被添加，而使用过的提取剂被泵出，使得发酵罐中 的提取剂的量在整个发酵过程期间保持恒定。如此的产物和副产物从发酵 中的连续提取和提取剂的抗氧化剂能力的维持能够提高有效速率、滴度和 收率。

用于从发酵液体培养基中分离丁醇的方法

对于ABE发酵使用本领域已知方法，生物生产的丁醇可从发酵液体培 养基中分离出来(参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639- 648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中 的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等从发酵液体培养基去除 固体。可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或 全蒸发的方法从发酵液体培养基中分离丁醇。

因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏可被用于分离混合物直 至其共沸组合物。蒸馏可以与本文所述的方法结合地用于获得共沸物周围 的分离。可与蒸馏结合地使用以分离和纯化丁醇的方法包括但不限于滗 析、液-液萃取、吸附、和基于膜的技术。另外，使用夹带剂的共沸蒸馏可 用于分离丁醇(参见例如，Doherty和Malone，Conceptual Design of  Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)。

丁醇-水混合物形成非均相共沸物，使得蒸馏可与滗析结合地使用以分 离和纯化异丁醇。在该方法中，包含丁醇的发酵液被蒸馏至接近共沸组合 物。然后，共沸混合物被冷凝，并且丁醇通过滗析被从发酵液体培养基分 离，其中丁醇能够与试剂接触，以降低一种或多种羧酸的活性。滗出的水 相可作为回流被返回至第一蒸馏塔或返回至独立的汽提塔。富含丁醇的滗 出有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏而进一步纯化。

也可使用液-液萃取与蒸馏的组合从发酵液体培养基中分离丁醇。在该 方法中，使用液-液萃取用合适的溶剂从发酵液体培养基中萃取丁醇。然后 蒸馏含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。

蒸馏与吸附的组合也可用于从发酵液体培养基中分离丁醇。在该方法 中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后通过使用吸附剂去 除剩余的水，诸如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol  Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis  and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438， National Renewable Energy Laboratory，2002年6月)。

此外，可组合使用蒸馏和全蒸发以从发酵液体培养基中分离和纯化丁 醇。在该方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全 蒸发通过亲水性膜去除剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210 (2004))。

原位产物去除(ISPR)(也被称为萃取发酵)可用于从制备产物的发酵 容器中去除丁醇(或其它发酵性醇)，从而使微生物以高收率制备丁醇。 本领域已经描述过的一种用于去除发酵性醇的ISPR方法是液-液萃取。一 般来讲，就丁醇发酵而言，例如，使包括微生物的发酵液体培养基在丁醇 浓度达到毒性水平之前的时间与有机提取剂接触。有机提取剂和发酵液体 培养基形成双相混合物。丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物 的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。

可例如根据美国专利申请2009/0305370和2011/0097773中所述的方法 进行液-液萃取，上述文献的公开内容全文以引用方式并入本文。美国专利 申请公布2009/0305370和2011/0097773描述了使用液-液萃取从发酵液制备 和回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液和与水不混溶的提 取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，提取剂可为选 自下列的有机提取剂：饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混 合物)C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪 醛、以及它们的混合物。用于ISPR的提取剂可为非醇提取剂。ISPR提取 剂可为外源有机提取剂诸如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻 醇、硬脂醇、1-十一烷醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸 甲酯、油酸甲酯、十一烷醛、月桂醛、20-甲基十一烷醛、以及它们的混合 物。

在一些实施例中，通过使发酵液体培养基中的醇与有机酸(例如，脂 肪酸)和能够使所述醇与所述有机酸酯化的催化剂接触，能够形成醇酯。 在此类实施例中，有机酸能够作为醇酯被分配至其中的ISPR提取剂。有机 酸能够被供应至发酵容器和/或来源于供应进料至发酵容器的可发酵碳的生 物质。原料中存在的脂质能够被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂 (例如，酶)能够使有机酸与醇酯化。发酵期间产生的羧酸能够另外地与 通过相同的或不同的催化剂产生的醇酯化。催化剂能够在发酵之前被供应 至原料，或者能够在原料的供应之前或与其同时地被供应至发酵容器。当 催化剂被供应至发酵容器时，通过脂质向有机酸的水解以及有机酸与发酵 容器中存在的丁醇的基本上同时的酯化作用，能够获得醇酯。并非来源于 原料的有机酸和/或天然油也能够被进料至发酵容器，而天然油被水解为有 机酸。任何不与醇酯化的有机酸能够作为ISPR提取剂的部分。包含醇酯的 提取剂能够被从发酵液体培养基分离，并且能够从提取剂回收醇。提取剂 能够被循环利用至发酵容器。因此，就丁醇制备而言，例如，丁醇至酯的 转化降低了发酵液体培养基中的游离丁醇浓度，保护了微生物免受提高的 丁醇浓度的毒性影响。此外，未分级的谷物能够被用作原料而其中没有分 离的脂质，因为脂质能够被催化水解为有机酸，从而降低了脂质在ISPR提 取剂中的积累速率。

原位产物去除能够在分批模式或连续模式中进行。在连续模式的原位 产物去除中，产物被连续地从反应器中去除。在分批模式的原位产物去除 中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵容器，并且提取剂在发酵过程期 间不被去除。对于原位产物去除，有机提取剂能够在发酵开始时与发酵液 体培养基接触，形成双相的发酵液体培养基。另选地，有机提取剂能够在 微生物已达到所期望的生长量(这能够通过测量培养物的光密度确定)之 后与发酵液体培养基接触。另外，有机提取剂能够在发酵液体培养基中的 产物醇水平达到预先选定的水平时与发酵液体培养基接触。就根据本发明 的一些实施例的丁醇制备而言，有机酸提取剂能够在丁醇浓度达到毒性水 平之前的时间与发酵液体培养基接触，使得丁醇与有机酸酯化以产生丁醇 酯，并因此降低发酵容器中的丁醇浓度。然后，含酯的有机相能够在达到 所期望的丁醇酯有效滴度之后被从发酵容器去除(并从构成水相的发酵液 体培养基分离)。在一些实施例中，含酯的有机相在发酵容器中的可用的 可发酵糖的发酵基本上完成之后被从水相分离。

异丁醇制备的确认

异丁醇在培养基中的存在和/或浓度能够通过本领域中已知的多种方法 (参见，例如，美国专利7,851,188，该文献以引用方式并入本文)来测 定。例如，一种利用Shodex SH-1011柱和Shodex SHG保护柱(二者均可 购自Waters Corporation(Milford，Mass.))并具有折射率(RI)检测的特异性的 高效液相色谱(HPLC)方法。使用0.01M H₂SO₄作为流动相，以0.5mL/min 流速和50℃的柱温实现色谱分离。在所使用的条件下异丁醇的保留时间为 46.6分钟。

另选地，气相色谱法(GC)是可用的。例如，特异性的GC方法利用 HP-INNOWax柱(30m×0.53mm内径，1μm膜厚度，Agilent Technologies (Wilmington，DE))，具有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为 4.5mL/min，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1∶25；炉温 为45℃持续1分钟，以10℃/min从45℃升温至220℃，并在220℃持续5 分钟；并且FID检测在240℃、26mL/min的氦气补气条件下使用。异丁醇 的保留时间为4.5分钟。

尽管本发明的多个实施例已如上描述，但是应当理解它们仅以举例的 方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在 不脱离本发明的实质和范围下对其进行形式和细节的多种变型。因此，本 申请的广度和范围应不受任何上述示例性实施例的限制，但应仅仅根据以 下权利要求及其等同物限定。

在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领 域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公 布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。

实例

本发明将在下面的实例中进一步阐述。应该理解，尽管这些实例说明 了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例 中，本领域的技术人员能够探知本发明的基本特性，并且在不脱离其实质 和范围的情况下，能够对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和 条件。

一般方法

在实例中使用的标准重组DNA、分子克隆技术和转化规程是本领域所 熟知的并且在如下文献中有所描述：Sambrook等人(Sambrook，J.， Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold  Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989，在这里被称为 Maniatis)，Ausubel等人(Ausubel等人，Current Protocols in Molecular  Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，1987)以 及Amberg等人(Amberg，D.C.，Burke，D.J.和Strathern，J.N.(Methods in  Yeast Genetics：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual，Cold Spring  Harbor Press，2005)。适于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所 熟知的。适用于下列实例中的技术可在下列文献中查到：Manual of  Methods for General Bacteriology(Phillipp等人编辑，American Society for  Microbiology，Washington，DC.，1994)或Thomas D.Brock(Brock， Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer  Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。除非另外指明，用于细菌细 胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料购自Sigma-Aldrich Chemicals (St.Louis，MO)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Invitrogen(Carlsbad， CA)、HiMedia(Mumbai，India)、SD Fine chemicals(India)、或Takara Bio  Inc.(Shiga，Japan)。

缩写的含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时， “nm”指纳米，“uL”指微升，“mL””指毫升，“mg/mL”指毫克每毫 升，“L”指升，“nm”指纳米，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔， “mmol”指毫摩尔，“μmole”指微摩尔，“kg”指千克，“g”指克， “μg”指微克，并且“ng”指纳克，“PCR”指聚合酶链反应，“OD”指 光密度，“OD600”指在600nm波长下测量的光密度，“kDa”指千道尔 顿，“g”也可指引力常数，“bp”指碱基对，“kbp”指千碱基对， “kb”指千碱基，“％”指百分比，“％w/v”指重量/体积百分比，“％ v/v”指体积/体积百分比，“HPLC”指高效液相色谱，“g/L”指克每升， “μg/L”指微克每升，“ng/μL”指纳克每微升，“pmol/μL”指皮摩尔每 微升，“RPM”指每分钟转数，“μmol/min/mg”指微摩尔每分钟每毫克， “w/v”指每单位体积重量，“v/v”指每单位体积的体积。

实例1蒸馏的和粗制的玉米油脂肪酸(COFA)的混合物的氧化水平。

为了确定粗制COFA是否能够恢复蒸馏的COFA的抗氧化活性，制备 了粗制的和蒸馏的COFA的混合物，并使其在30℃暴露于氧气若干天。制 备了100％粗制COFA、100％蒸馏的COFA、90％蒸馏的/10％粗制COFA、 75％蒸馏的/25％粗制COFA、和50％蒸馏的/50％粗制COFA样品，并经由 纯油通过空气的缓慢起泡，使其暴露于氧气若干天。测量了COFA的过氧 化物含量，结果示出于图1中。

下列样品是由如上文所述的粗制COFA和蒸馏的COFA(Emery  Oleochemicals；Cincinatti，OH)制备的。

表1：粗制的、蒸馏的、以及粗制的和蒸馏的COFA的样品的组成。

样品 粗制COFA重量 蒸馏的COFA重量 A 20 0 B 0 20 C 2 18 D 5 15 E 10 10

将样品放入保持在30℃的加热器中，并使空气以11ml/min的速率吹入 液体中。在所指示的时间移出样品，并针对过氧化物含量和同系物分布进 行分析。

在所指示的时间从每一样品取出等分试样并针对过氧化物含量进行分 析，除了使用0.01N硫代硫酸钠溶液代替0.1N硫代硫酸钠用于滴定之外， 分析通过AOCS方法Cd 8-53进行。结果示出于下文的表2和图1中。

表2：样品A-E随时间推移的过氧化物含量(meq/Kg)

还通过使样品衍生化为甲基酯并查看气相色谱(GC)分析，分析了来自 该实验的样品。数据示出于表3和图2中。

表3样品A-E随时间推移的GC分析。

样品 名称 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 A-1 0小时 11.28 1.82 23.68 54.62 A-2 14小时 11.21 1.8 23.48 54.12 A-3 38小时 11.12 1.79 23.28 53.6 A-4 62小时 10.96 1.76 22.96 52.83 A-5 158小时 10.76 1.73 22.54 51.94 A-6 212小时 10.88 1.76 22.92 51.98 B-1 0小时 9.8 2.11 26.38 54.52 B-2 14小时 9.83 2.12 26.77 53.74 B-3 38小时 9.63 2.08 25.95 49.05 B-4 62小时 9.5 2.05 25.34 44.96

C-1 0小时 10 2.09 26.52 55.01 C-2 14小时 9.99 2.08 26.45 54.83 C-3 38小时 9.9 2.07 25.94 54.24 C-4 62小时 9.76 2.04 25.91 53.47 C-5 158小时 9.36 1.96 24.31 42.93 D-1 0小时 10.17 2.03 26.03 54.75 D-2 14小时 10.22 2.04 25.84 55.01 D-3 38小时 10.08 2.01 25.72 54.06 D-4 62小时 9.91 1.98 25.05 53.27 D-5 158小时 9.62 1.92 24.26 51.48 D-6 212小时 9.23 1.99 25.13 50.44 E-1 0小时 10.45 1.94 24.71 54.03 E-2 14小时 10.38 1.93 24.6 53.72 E-3 38小时 10.45 1.94 24.74 54.13 E-4 62小时 10.24 1.9 24.57 52.93 E-5 158小时 9.9 1.84 23.44 51.15 E-6 212小时 9.16 1.91 24.32 50.19

总的来说，上述数据示出，提高粗制COFA在蒸馏的/粗制的混合物中 的比例提供了更多的保护，以免COFA因氧化而损耗。

实例2：氧化的COFA对异丁醇菌的效应。

通过当异丁醇菌的培养物暴露于氧化的COFA的第二液相时观察到的 葡萄糖摄入速率的降低，示出氧化的COFA的负面效应。氧化的COFA是 通过使蒸馏的COFA(即，没有抗氧化能力的COFA)暴露于呼吸气流一 段时间，使得过氧化值从小于10升高至约100meq/kg，非原位地制备的。 通过在N₂气氛下加热至约80℃，另外处理了该材料的一部分，并且过氧化 值因此降低至小于10meg/kg，并且中间过氧化物被转化为次级氧化产物。 这两种材料被称为初级氧化的COFA和次级氧化的COFA。使具有呈现的 残余葡萄糖以及可忽略不计的异丁醇或异丁醇副产物的异丁醇菌的培养物 暴露于初级氧化的COFA或次级氧化的COFA。经过48小时的时间段观察 了暴露于氧化的COFA的分批培养物中异丁醇菌的葡萄糖消耗速率。氧化 的COFA(100meq/kg)使葡萄糖消耗速率降低至零。实验以两种不同的初 始细胞计数值被重复，并且展示了氧化的COFA影响了比生长速率以及比 葡萄糖消耗速率。

实例3：氧化的COFA的范围对异丁醇菌的效应。

假想例

为了确定COFA氧化的范围对重组微生物的葡萄糖消耗速率和生长速 率的效应，使氧化的COFA与天然的COFA(即，具有小于10meq/kg的过 氧化值的COFA)共混，以得到10至100meq/kg范围的COFA过氧化值或 推定的次级氧化产物。经过48小时的时间段观察了暴露于COFA共混物的 分批培养物中异丁醇菌的葡萄糖消耗速率。

实例4：在COFA中维持或提供有效量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物。

假想例

一般方法

发酵规程。在冰/水上使包含工程化丁醇生物合成途径的异丁醇菌酵母 菌株(光密度值(OD)为大约2.0，SEG培养基，30％甘油)的900μL-80℃ 冷冻小瓶批次缓慢解冻，并添加至2升(L)带挡板振荡烧瓶中的150mL DM 中(确定成分培养基(DM)示出于表4中)。在呼吸气存在下以30℃和 250rpm温育培养物24小时，之后以9000rcf离心培养物15分钟，并将回收 的酵母细胞培养物重悬在150mL玉米醪中。玉米醪是使用自来水中的30％ 研磨的干玉米固体(DCS)，通过在85℃在分批中添加Spezyme Fred-L持续 90分钟而制备的。然后在2巴高压消毒上述液化物15分钟。冷却至室温 后，添加2g/L的尿素、35g/L葡萄糖、10％v/v 1M MES缓冲液和5g/L乙 醇，将上述醪分装并冷冻于-20℃待用。将酵母接种的醪添加至2L带挡板 的烧瓶，并添加了另外的150-450mL玉米油脂肪酸(COFA)，并且在呼吸气 存在下以30℃和250rpm温育混合物48小时。在0小时、6小时、24小 时、30小时和48小时对水相和有机相取样，并至少针对异丁醇和葡萄糖进 行分析。计算了异丁醇对消耗的葡萄糖的收率和以体积计的异丁醇制备速 率。

表4：确定成分培养基(DM)

种子烧瓶培养基   成分 所需总量 酵母氮源w/o AA(Difco) 6.7g/L Sigma Y2001 yeast dropout mix 2.8g/L 10g/L亮氨酸溶液 20.0ml/L

10g/L色氨酸溶液 4.0ml/L 酵母提取物(Difco) 2.0g/L 蛋白胨(Bacto) 4.0g/L MES缓冲液 38.4g/L 右旋糖-无水的 10.0g/L 乙醇 6.3mL/L

玉米油脂肪酸(COFA)。COFA的来源是粗制的或蒸馏的。粗制COFA 是通过从玉米制乙醇工厂的后端收集的粗制玉米油的碱解制备的。使玉米 油暴露于碱，直到游离酸含量大于95％。用水洗涤上述材料，并用盐水脱 水。过氧化物值(PV)小于1meq/kg，并且脂肪酸(FA)组成大约为：棕榈酸 12.2％；硬脂酸1.9％；油酸26％；亚油酸57.7％；和亚麻酸2％。蒸馏的 COFA购自Emery Oleochemicals。蒸馏的COFA是作为粗料产生的然后被 煮沸。将产物以冷凝产物(因此为不含抗氧化剂或其他天然存在的脂质的 基本上纯的游离脂肪酸(FFA))收集。

实验结果。进行了三轮实验。在第一轮中有两项平行实验，(a)使用粗 制COFA，(b)使用蒸馏的COFA。连续使用了上文所述的规程，使得新鲜 的醪/酵母(即，异丁醇菌)被用于每次传代，但COFA在每次使用后被回 收、反萃取异丁醇并随后被重新使用。持续进行循环利用，直到异丁醇制 备停止。由于异丁醇在每次传代期间在COFA相中积聚，在后续的再利用 之前对其进行反萃取，这是通过在玻璃烧瓶中在70℃以N₂鼓泡2小时进行 的。以这种方式，在T＝0时的异丁醇含量每次是大约零。取出COFA的样 品，用于过氧化值(PV)和脂肪酸(FA)组成分析。

测量了在COFA的每次再利用时细胞的性能、收率和速率。在蒸馏的 COFA的3-4次循环之后，预期生长收率和速率会降低，然而对于粗制 COFA，生长收率或速率预期会大于10次循环不降低。还测量了PV和FA 组成。还测量了提取剂的抗氧化活性指数。观察到细胞性能的劣化与 COFA氧化的程度之间的相关性。

在第二轮中，蒸馏的COFA被用于三次独立的但相同并且平行的实验 中的每一次。在实验中进行了循环利用，如上文所述。在第一次实验中， 由于COFA的氧化体系是劣化的。在第二次和第三次实验中，通过以下方 式恢复体系：i)在关键传代次数时添加新鲜粗制COFA的少量进料(10％ v/v)和ii)在每次传代(包括第一次)时添加酪蛋白氨基酸(大约占DCS 的3％w/w)。对于恢复实验，测量了生长收率和速率。在其中蒸馏的 COFA在不被粗制COFA或酪蛋白氨基酸恢复的实验中，观察到细胞性能 由于COFA的氧化的损耗。用一份粗制COFA或酪蛋白氨基酸补充体系能 够延长COFA的实用性。

酪蛋白氨基酸的添加提供了从已经存在于玉米醪中、但不太可能被使 用的蛋白质释放氨基酸的蛋白酶的模拟。在第三轮实验中，给予玉米醪一 定剂量的蛋白酶，并测量了释放的游离氨基酸。在COFA的每次循环时提 供了一定剂量的蛋白酶，并基本上如上文所述重复了实验。游离氨基酸从 醪的释放与酪蛋白氨基酸的直接添加相一致。

在上文所述的每一实验中，发酵液体培养基能够是基本培养基，使得 所述发酵液体培养基是氨基酸大体上降低的或不含氨基酸的，尤其是对于 酪蛋白氨基酸的效应在其中将被测定的实验。在这些实验中，对于对照样 品(即，没有添加酪蛋白氨基酸的样品)和实验样品(具有添加的酪蛋白 氨基酸的样品)，发酵液体培养基均是氨基酸大体上降低的或不含氨基酸 的。

实例5：鉴定发酵期间提取剂的氧化。

假想例

为了鉴定提取剂的氧化在发酵过程期间是否已发生，测量了多个发酵 参数。简而言之，使包含丁醇生物合成途径的重组微生物在有益于提取剂 在其中与发酵液体培养基混合的发酵方法的培养条件下生长。反萃取提取 剂中的丁醇，并使提取剂循环利用，如上文所述。在提取剂的每一循环， 测定了提取剂的氧化状态(例如，通过使用Rancimat方法测定抗氧化活性 指数、通过测量提取剂的一种或多种组分的损耗、通过测量提取剂的过氧 化物、醛、和/或酮含量、或通过测量提取剂的一种或多种抗氧化剂或抗氧 化剂样化合物的存在)。另外，在提取剂的每一循环之后的发酵期间测量 了重组微生物的代谢参数。具体地，所测量的微生物的代谢参数包括但不 限于光密度(OD)、pH、呼吸商、可发酵的碳底物利用率、CO₂的产生、和 丁醇的产生。本领域中已知的其他代谢参数同样能够被测量。确定了被引 入发酵液体培养基中的提取剂的氧化状态与发酵过程期间重组微生物的每 种代谢参数之间的相关性。

另选地，将具有已知氧化状态(例如，已知过氧化物水平)的提取剂 引入发酵液体培养基，并使包含丁醇生物合成途径的重组微生物在有益于 发酵过程的培养条件下生长。在发酵过程期间，如上文所述测量了重组微 生物的代谢参数，确定了提取剂的已知氧化状态与所测量的每种代谢参数 之间的相关性并示出于表5中。

表5：氧化状态对重组微生物的代谢参数的效应。

实例6：用抗氧化剂补充提取剂以及补充对丁醇的速率、滴度、收率、以及微生物的生长产生的效应。

假想例

为了确定用抗氧化剂或抗氧化剂样化合物对提取剂的补充是否具有对 丁醇制备速率、滴度、收率、和生长的效应，用递增水平的多种抗氧化剂 或抗氧化剂样化合物补充抗氧化剂，并在发酵过程期间测量了丁醇的速 率、滴度、收率、和重组微生物的生长。

简而言之，使包含丁醇生物合成途径的重组微生物在有益于如本领域 的技术人员所实施的发酵方法的培养条件下生长。为了测试用抗氧化剂或 抗氧化剂样化合物对提取剂的补充是否影响丁醇的速率、滴度、和产物醇 的收率、以及微生物的生长，将包含递增量的抗氧化剂或抗氧化剂样化合 物的提取剂的多份样品引入发酵过程，如表6所示。另外，测试了不同类 型的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物，如表7所示。在发酵过程结束之后， 根据本领域已知的方法测量了丁醇的速率、滴度、和收率。还根据本领域 已知的方法测量了微生物的生长速率。

表6：递增的抗氧化剂或抗氧化剂样化合物浓度对丁醇的速率、滴度、收率、和重组微生物的生长的效应。

表7：抗氧化剂或抗氧化剂样化合物的类型对丁醇的速率、滴度、收率、和重组微生物的生长的效应。

实例7：通过油稳定性指数(OSI)对COFA中抗氧化活性的评估

样品制备

以重量百分比计将抗氧化剂添加至多种玉米油脂肪酸(CAS No.8001- 30-7)，并使其溶解。用如上文所述制备的粗制玉米油脂肪酸(COFA)制备 了样品；并使用不包含天然抗氧化剂的蒸馏的COFA(Emery Oleochemicals) 制备其他样品。抗氧化剂没食子酸和L-抗坏血酸6-棕榈酸酯在所测试的浓 度是不可溶的。包含未溶解的抗氧化剂的COFA样品在取出样品用于分析 之前被彻底混匀，以确保样品包含指定重量百分比的抗氧化剂。

抗氧化活性评估

使用来自Omnion，Inc.(Rockland，MA，USA)的氧化稳定性仪器评估了 含有或不含抗氧化剂的粗制的和蒸馏的COFA样品。根据AOCS方法Cd 12b-92运行了样品并测定了诱导期。全部样品均在110℃下测试。以样品加 抗氧化剂的诱导期与纯的粗制或蒸馏的COFA的诱导期的比率计算了抗氧 化活性。结果示出于表8中。添加抗氧化剂丁基化羟基甲苯(BHT)(目录号 W218405，Sigma Aldrich(Saint Louis，MO，USA))对粗制COFA的诱导期的 效应示出于图3中。

表8：对于补充有抗氧化剂的粗制的和蒸馏的COFA，在110℃下的氧化稳定性指数

实例8：COFA氧化和生物相容性

反应容器准备

用850g粗制玉米油脂肪酸(CAS No.8001-30-7)填充三个玻璃带夹套 的1L柱形反应容器(Wilmad-LabGlass；Vineland，NJ)。3或4个颈的反应容 器盖被紧密密封在反应容器上。4叶片玻璃搅拌轴、聚四氟乙烯(PTFE)搅拌 器轴承、和曝气管被安装进反应容器和盖中。使用偏置适配器将玻璃冷凝 器也安装在反应器上。将金属试样块(304不锈钢，1″×2″)放置在反应器 的底部处。将玻璃塞子安装进盖中的任何剩余的开口中。带夹套的供水和 回流管线被连接至制冷/制热循环浴(VWR；Radnor，PA)，设定为30℃。冷凝 器冷却进水和出水管路被连接至NesLab制冷/制热循环浴(ThermoFisher  Scientific；Waltham，MA)，设定为15℃。排气管路使来自反应体系的鼓泡气 体经过含有矿物油的双管气体鼓泡器(double gas bubbler)转移至通风系 统。抗氧化剂丁基化羟基甲苯(目录号W218405，Sigma-Aldrich(Saint  Louis，MO))被分别以0.2和0.8重量％的浓度装载到反应器2和3中。以 0.024标准升/分钟的速率喷射氮气，并将搅拌速度保持为恒定300rpm。为 了确保抗氧化剂完全溶解，将反应体系在氮气鼓泡下放置68小时。

COFA氧化

在氮气鼓泡之后，停止供气并将带夹套的供水循环浴设定为60℃。然 后将压缩空气以0.034标准升/分钟的速率鼓泡至反应容器中，这标记为实 验的时间t＝0。在0、6、52、124、168、和222小时，从反应器1、2、和 3取出样品。用氮气吹扫样品，并将其冷冻在-20℃冷冻机中。随后使样品 解冻，并分装为小份，用于生物相容性分析。

生物相容性

使异丁醇菌(大约OD＝1.0)的1mL小瓶解冻，并接种到125mL通 气烧瓶中的20mL的SG30培养基(葡萄糖30g/L；酵母提取物2g/L；酵母 氮源(YNB)6.7g/L；dropout 2g/L；MES 30g/L；用KOH将pH滴定至5.5，并 过滤消毒)，并且以30℃和240rpm摇动温育约24小时。培养物被传代至 2L烧瓶中的500mL中，并以相同条件另外孵育一段时间，直到OD为大约 2.0。通过在室温以7000rpm离心10分钟来回收细胞，并弃去上清液。细胞 沉淀物被重悬待新鲜的SG30中至OD为1.0，并将20mL的这种重悬物置 于烧瓶中(不通气的)。添加待评估的提取剂(10mL)，并将无菌氮气 (N₂)填充到烧瓶的顶部空间。然后对烧瓶封盖，并如上文所指出的那样 温育。周期性地从烧瓶取出双相体系的样品，并以15000rpm离心，使得水 相不含提取剂，并获得细胞。通过YSI或液相色谱(LC)方法测定该相中的 葡萄糖浓度，并测定随时间推移的葡萄糖消耗速率，作为发酵活性的量度 (图4)。

反应器1的内容物(其不包含另外的BHT)展示了在进入氧化研究的 124和168小时取出的样品中生物相容性的损耗。反应器2和3(它们分别 包含0.2和0.8重量％BHT)在全部样品中继续展示了生物相容性。对照样 品取自批量的5加仑圆桶的COFA，全部三个反应器初始均用其填充。

实例9：COFA、BHT、和生物相容性

种子烧瓶生长

使异丁醇菌在确定成分培养基(Difco^TM无氨基酸的酵母氮源6.7g/L、 ForMedium^TMSynthetic Complete Drop-out(Kaiser)Mix-HIS、-Ura 3.7g/L、 MES缓冲液19.5g/L、右旋糖30g/L)中生长。用氢氧化钠将培养基的pH 调节至5.8-6.2。通过将解冻的小瓶的一部分添加至具有确定成分培养基的 烧瓶，在29-31℃下在以260-300rpm摇动的培养箱中在种子烧瓶(2L带挡 板的通气振荡烧瓶中的500mL上述确定成分培养基)中开始培养，生长至 光密度值(600纳米波长)为0.68的最终生物质浓度。

生物相容性烧瓶测试

以0.05单位的起始光密度值(600纳米波长)将种子烧瓶培养物传代 培养至确定成分培养基(40g/L右旋糖)中。将20mL的该传代培养物添加 至250mL锥形瓶中。单独地，丁基化羟基甲苯(BHT；Sigma Aldrich)被以多 种浓度(0、0.2、0.4、0.8、和5.0重量％)溶解在COFA中。将20mL的包 含BHT的COFA添加至包含传代培养材料的250mL锥形瓶中。使用不含 BHT的COFA，以相同方式准备了对照烧瓶。然后在以260rpm摇动的培养 箱中温育烧瓶。在培养期间去除样品，并利用本文所公开的方法针对细胞 计数和葡萄糖浓度进行了分析。具有5％BHT的COFA支持了异丁醇菌的 生长，如表9和10所示。

表9：COFA、BHT、和细胞生长

表10：COFA、BHT、和葡萄糖浓度