一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束

摘要

本发明公开了一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，该胶束以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖(DEX(5K))为亲水材料，以十四胺(MA)为疏水材料，以3,3二硫二丙酸(DPC)为交联剂，以阿霉素(DOX)为模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的胶束DOXMA-DEX(5K)-ALN。该骨靶向胶束DOXMA-DEX(5K)-ALN对DOX具有较高的载药量与包封率，可明显增加DOX对羟基磷灰石(HA)的吸附量，将更多的DOX递送至骨转移瘤处，从而使DOX在肿瘤组织富集，增加DOX对骨转移癌的治疗作用，减轻肿瘤对骨的破坏作用；同时降低DOX在正常组织的分布，提高DOX的疗效，降低毒副作用，为治疗骨转移癌递药系统的开发提供新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型葡聚糖(DEX)氧化还原敏感骨靶向胶束的 设计制备及应用方案。

背景技术

研究发现至少50％的癌症晚期患者会出现骨转移的现象。肿瘤骨 转移的发生影响了药物对肿瘤的治疗，增加了患者的疼痛，降低了患 者的存活率。由于骨质硬度大、血管分布少、药物渗透性低等特点， 传统给药方式很难将药物有效递送至骨转移瘤处。如何有效递送药 物，是解决骨转移瘤治疗难题的关键。骨靶向递药系统的提出，为骨 转移瘤的治疗带来了曙光。

双膦酸盐类(BPs)对骨的HA具有很高的亲和力。一旦BPs进 入体内后，BPs就会被快速从血液循环中清除而吸附到暴露的骨矿物 质区域。阿仑膦酸钠(ALN)属于第三代BPs类药物，具有很强的 亲骨性，其结构简单，可化学修饰，被广泛用作递药系统中的骨靶向 配体。研究表明，对环境响应的递药系统对药物的可控释放起到关键 作用。二硫键是一种对谷胱甘肽(GSH)敏感的化学键，在肿瘤细胞 内外GSH的含量差别巨大。其中肿瘤细胞内GSH的浓度可达到2-10 mM，而肿瘤细胞外GSH的浓度约为2-20μM，浓度几乎相差1000 倍。利用二硫键连接的递药系统可以选择性的将药物释放在GSH含 量高的肿瘤细胞内，而在血液中可以稳定存在。

葡聚糖(DEX)具有良好的生物相容性和水溶性，已被广泛应用 于生物医药领域。基于DEX制备的胶束递药系统，因其具有粒径小、 载药力强等特征已被广泛研究。最近的研究还表明基于DEX的胶束 在体内循环也具有类似PEG“隐形”的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感 骨靶向胶束，可以将更多DOX递送到骨转移瘤处，同时显著降低 DOX在正常组织的分布，从而有效提高DOX的抗肿瘤活性，降低其 毒副作用，为治疗骨转移癌递药系统的开发提供新思路。

一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，其特征是 以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖 (DEX_(5K))为亲水材料，以十四胺(MA)为疏水材料，以3,3二硫 二丙酸(DPC)为交联剂合成MA-DEX_(5K)-ALN，以阿霉素(DOX) 为模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响 应的纳米胶束DOX@MA-DEX_(5K)-ALN。

具体制备方法如下：

(1)二硫二丙酸-阿仑膦酸钠(DPC-ALN)的合成方法

①在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 501.1mg，4.8 mmol的EDCI 916.8mg，搅拌30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2 mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h；②在20mL的蒸馏水中 加入1.2mmol的ALN 325.6mg，充分溶解后，分三批次缓慢滴加入 上述反应液，在反应过程中，缓慢滴加0.2M NaOH使反应液的pH 值稳定维持在7.0左右，2小时后继续滴加0.2M NaOH使pH调成 9.0，继续反应过夜，反应结束后旋干溶剂，固体用大量二氯甲烷反 复润洗三次，甲醇润洗三次，得产物；

(2)二硫二丙酸-十四胺(DPC-MA)的合成方法

在20mL的1,4二氧六环中加入2.4mmol的DPC 500mg，4.8 mmol的EDCI 916.8mg，搅拌30min，然后加入5.0mmol的NHS 575.2 mg以及150μL的TEA，继续搅拌活化3h，随后在反应液中加入1.3 mmol的MA 217.6mg，室温反应12h，TLC监测反应，结束反应后， 过柱分离，其中展开剂以体积比计为：二氯甲烷:甲醇＝10:1；

(3)葡聚糖_(5K)-3,3二硫二丙酸-十四胺(DEX_(5K)-DPC-MA)的合 成方法

称取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的 DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX_(5K)，室温反应12h，结束 反应后，过滤反应液，得淡黄色澄清液体，滤液用大量二氯甲烷沉淀， 并反复用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇润洗沉淀三次，最后将沉淀溶于少 量蒸馏水中透析冻干，即得DEX_(5K)-DPC-OA；

(4)十四胺-3,3二硫二丙酸-葡聚糖_(5K)-3,3二硫二丙酸-阿仑膦酸 钠(MA-DPC-DEX_(5K)-DPC-ALN)的合成方法

称取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL 的DMSO中，充分溶解后加入一定量的DEX_(5K)-DPC-MA，油浴60℃ 反应48h，反应结束后透析冻干即得MA-DPC-DEX_(5K)-DPC-ALN， 缩写为MA-DEX_(5K)-ALN；

(5)MA-DEX_(5K)-ALN载阿霉素(DOX)胶束的制备

称取3mg DOX·HCl于4mL DMSO中，再加入3μL的TEA， 在60℃油浴中避光磁力搅拌1h使其充分溶解，加10mg的 MA-DEX_(5K)-ALN于制备液中，持续搅拌2h后缓慢滴加蒸馏水32 mL，继续搅拌12h；将上述混合液装入分子截留量为2000的透析袋 中，透析48h，每6h换一次水，透析后冷冻干燥得聚合物载药胶束。

本发明骨靶向胶束DOX@MA-DEX_(5K)-ALN对DOX具有较高的 载药量与包封率，可明显增加DOX对羟基磷灰石(HA)的吸附量， 将更多的DOX递送至骨转移瘤处，从而使DOX在肿瘤组织富集， 增加DOX对骨转移癌的治疗作用，减轻肿瘤对骨的破坏作用；同时 降低DOX在正常组织的分布，提高DOX的疗效，降低毒副作用。

附图说明

图1是DOX及DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后肿瘤 体积的变化图。裸鼠胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给药。 A：普通相机观察荷瘤裸鼠肿瘤体积；B：测量荷瘤裸鼠肿瘤体积变 化；C：各给药组肿瘤体积抑制率。n＝3，*P<0.05，VS DOX； #P<0.05，VS Control。

图2是DOX及DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后裸鼠 体重的变化曲线图。裸鼠胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给 药。n＝3，*P<0.05，VS DOX。

图3是DOX及DOX@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后荷 瘤裸鼠右后肢Micro-CT重建(A)及矢状位图像(B)；荷瘤裸鼠右 后肢Micro-CT数据分析(C和D)。BV/TV为骨体积/组织体积。n＝3， *P<0.05，VS DOX。

具体实施方法

DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束的体内外抗肿瘤活性研究

1目的：通过体内外实验，评价DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束的抗 肿瘤活性。

2研究方法：

2.1包封率及载药量测定

应用荧光分光光度法测定DOX浓度，激发波长为470nm，发射 波长为597nm，用DMSO作为溶媒配制100μg/mL DOX标准储备液， 然后分别稀释为0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、25.0μg/mL，荧光 分光光度计测定荧光强度，以荧光强度对浓度进行线性拟合，得到检 测DOX标准曲线的回归方程为y＝20.118x-15.352，R²＝0.9976。其中 DOX在0.1-25μg/mL范围内，荧光光度值与浓度具有良好的线性关 系。

称取1mg的载药胶束DOX@MA-DEX_(5K)-ALN溶解于3mL DMSO中，测定DOX荧光强度，每个样品测定三次。载药量以及包 封率由以下公式计算：

载药量＝(胶束中药物量/胶束的量)×100％

包封率＝(胶束中包封的药物量/制备胶束投入的药物总量)×100％

2.2评价DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束与HA的吸附动力学

精密称取1mg的DOX和DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束溶解于 10mL的PBS中，测定溶液的吸光度值，记录数据。然后分别加入 100mg的HA搅拌，在5、15、30和60min时，样品于5000rmp离 心10min，吸取上清液分别测定吸光度值。

吸附率＝[(测前-测后)/测前]×100％

2.3评价DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束的体外细胞毒性

利用MTT法测定DOX以及DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束对 A549细胞、PC-3细胞、MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231/ADR细 胞的毒性作用。取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化， 接种于96孔板(细胞浓度1×10⁴/mL，接种体积200μL)。置于孵箱 (37℃)中培养24h，弃去培养液。分别将DOX和 DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束溶于无血清的培养液中，以不加药物为 阴性对照组。胶束折合DOX的浓度分别为0.08、0.8、8.0和40.0 μg/mL，每孔加入200μL药物溶液，孵育24h。每孔加入20μL MTT 溶液，继续培养4h后弃去培养液，每孔加入200μL的DMSO。将 培养板置于摇床振摇10min，酶标仪490nm处测定吸光度值。细胞 生存率％＝(给药后的吸光度值/阴性对照的吸光度值)×100％。

2.4评价DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束的体内抗肿瘤活性

2.4.1试验分组

雄性裸鼠随机分为3组：荷瘤模型组、DOX组(5mg/kg)、 DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束组(5mg/kg)。

2.4.2荷瘤动物模型的建立

取对数生长期的A549细胞，经洗涤、消化、离心后得到浓缩细 胞，然后加入无血清RPMI 1640培养液稀释细胞使其浓度达到 1×10⁷/mL，待用。将裸鼠膝关节弯曲60°，然后用1mL的注射器吸 取100μL的上述细胞悬液，针头倾斜插入裸鼠胫骨骨髓腔内，将细 胞注入，建立荷瘤动物模型。待肿瘤可触及时，按照分组，分别静脉 注射药物，七天后再次给予相同剂量药物。

2.4.3观察指标

①观察肿瘤的体积变化：每天观察肿瘤生长情况，根据公式计算 肿瘤体积。

Tumor Volume＝L×W²×0.5(L，W分别代表肿瘤最长直径和最短 直径)

②观察裸鼠的体重变化。记录动物体重变化，绘制体重变化曲线， 观察药物对动物体重的影响。

③Micro-CT观察骨转移瘤处骨质的变化。

3实验结果：

3.1包封率及载药量

表1 DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束的载药量及包封率

结果显示本专利设计的胶束具有高载药量和高包封率特性。

3.2体外抗肿瘤活性

DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、 MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/ADR细胞的毒性具有明显的浓 度依赖性，随着DOX浓度的增大细胞存活率逐渐降低。相比于DOX， DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、 MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/ADR细胞的毒性更强。DOX对 MDA-MB-231/ADR细胞几乎无毒性，而DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶 束显示出较强的细胞毒性。

细胞毒性研究为评价药物体外抗肿瘤活性的重要指标，上述结果 显示，DOX@MA-DEX_(5K)–ALN胶束对肿瘤细胞具有突出的细胞毒 性，同时对于耐药肿瘤细胞也具有良好的体外抗肿瘤效果。

3.3体内抗肿瘤活性

图1A是利用普通相机记录的各组荷瘤裸鼠的生长情况，图1B 所示为荷瘤裸鼠肿瘤体积的变化。从图中可以看出，空白对照组的裸 鼠肿瘤体积增长迅速。在第30天的时候，空白对照组的平均肿瘤体 积已经增加到4168±204mm³。DOX组的治疗能一定程度抑制肿瘤的 快速增长，在第30天肿瘤体积到达了2711±372mm³。而相同剂量条 件下，DOX@MA-DEX_(5K)-ALN表现出比DOX更好的抗肿瘤效果。 在给药第30后DOX@MA-DEX_(5K)-ALN给药组裸鼠肿瘤体积为 789±118mm³。图1C为不同给药组对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率。从图 中可以看出DOX@MA-DEX(5K)-ALN相比于DOX具有更好的肿瘤 抑制能力。实验结束后，DOX、DOX@MA-DEX_(5K)-ALN的肿瘤抑制 率分别是38.4％，67.9％。

图2所示为裸鼠的体重变化。从图中可以看出所有裸鼠在最初的 两周内体重都有缓慢上升，但是随着治疗时间的延长，空白对照组和 DOX给药组裸鼠的体重出现迅速下降趋势。 DOX@MA-DEX(5K)-ALN给药组的裸鼠体重略有下降。体重变化是 衡量DOX对机体毒副作用的一个重要指标，DOX装载于 MA-DEX_(5K)-ALN胶束后，体重变化较游离DOX显著降低，毒副作 用明显下降。

利用Micro-CT对骨转移瘤处的骨组织进行扫描。从图3A、图3B 中可以看出阳性对照组的小鼠胫骨及腓骨处被严重破坏，呈现出明显 的溶骨性病变，皮质破坏，大多数骨小梁消失。而DOX组的裸鼠胫 骨及腓骨处呈现出中度破坏，部分皮质尚完整存在，骨小梁也相对较 多。DOX@MA-DEX_(5K)-ALN给药组对骨质的破坏较小，与阴性对照 组相比，骨质基本保持完整形态。图3C、图3D结果是利用Micro-CT 分析软件对胫骨骨小梁的体积以及数量做了进一步的分析。结果显示 DOX@MA-DEX_(5K)-ALN给药组可以明显改善肿瘤细胞对骨小梁的 破坏作用。同时利用Micro-CT对胫骨近端的骨密度值进行了检测， 从结果可以看出DOX@MA-DEX_(5K)-ALN给药组骨密度值均大于 DOX组，且具有显著性差异；DOX@MA-DEX_(5K)-ALN与正常对照 组相比，没有显著性差异。结果说明DOX@MA-DEX_(5K)-ALN通过 积极地抗肿瘤作用能够减弱肿瘤对骨质的侵袭，减轻对骨密度的降低 作用。

4结论：

体内外的抗肿瘤实验结果表明，与游离DOX相比， DOX@MA-DEX_(5K)-ALN胶束可有效提高DOX在肿瘤组织的富集， 同时显著减少DOX在正常组织的分布，减轻毒副作用，呈现出显著 增强的抗肿瘤活性，具有良好的开发前景。