骨靶向胶束的制备及其对骨转移癌的治疗作用研究

摘要

研究背景：
　　骨肿瘤是一种发生于骨组织或者其附属组织的一种常见病，研究发现至少50％的癌症晚期患者会出现骨转移的现象。肿瘤细胞在骨组织中形成骨转移时，会对骨质造成破坏。骨的破坏会产生骨相关事件（SREs），包括病理性骨折、高钙血症、骨髓功能的下降等。这些并发症影响了对肿瘤的治疗，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨质硬度大、血管分布少、药物渗透性低等特点，按传统给药方式很难将药物有效递送至骨转移瘤处。如何有效递送药物，是解决骨转移瘤治疗难题的关键。
　　双膦酸盐类（BPs）对骨的羟基磷灰石（HA）具有很高的亲和力。一旦 BPs进入体内后，BPs就会被快速从血液循环中清除而吸附到暴露的骨矿物质区域。阿仑膦酸钠（ALN）属于第三代 BPs类药物，具有很强的亲骨性，其结构简单，可化学修饰，被广泛用作递药系统中的骨靶向配体。研究表明，对环境响应的递药系统对药物的可控释放起到关键作用。腙键是一种对pH敏感的化学键，在血液循环（pH=7.4）中稳定，在肿瘤细胞溶酶体（pH<6）中会发生断裂。通过腙键将嵌段共聚物连接可制备出对pH敏感的递药系统。二硫键是一种对谷胱甘肽（GSH）敏感的化学键，肿瘤细胞内外GSH的含量差别巨大。肿瘤细胞内GSH的浓度可达到2-10 mM，而肿瘤细胞外GSH的浓度约为2-20μM，浓度几乎相差1000倍。利用二硫键连接的递药系统可以选择性的将药物释放在GSH含量高的肿瘤细胞内，而在血液中可以稳定存在。
　　聚乙二醇（PEG）是一种水溶性、生物相容性良好且无免疫原性的非离子聚合物，在药物递送系统研究领域被广泛应用。利用PEG上的可修饰基团，将其作为靶向配体分子与药物（或者药物载体）之间的桥连臂，可构建主动靶向药物载体。多糖是一类天然来源的可生物降解的聚合物材料，多糖骨架上的功能基团，尤其是羟基，具有显著增溶作用。
　　目的：
　　本研究以阿仑膦酸钠为骨靶向配体，以阿霉素（DOX）为模型药物，分别制备基于聚乙二醇（PEG）的pH敏感胶束和基于葡聚糖（DEX）的氧化还原敏感胶束。观察其体内外抗肿瘤活性及骨靶向性，为骨转移瘤的靶向治疗探索新的技术手段。
　　方法：
　　1．分别制备了pH敏感胶束 DOX-hyd-PEG-ALN和氧化还原敏感胶束OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN。
　　2．通过改变蒸馏水用量、温度、投药量等筛选出载药胶束的最优制备工艺。
　　3．通过测定载药量、包封率、粒径、Zeta电位、稳定性等对胶束进行表征。
　　4．测定载药胶束在不同介质溶液中的释药特性。
　　5．测定载药胶束对HA的吸附性。
　　6．通过 MTT法测定载药胶束的细胞毒性；利用荧光显微镜以及流式细胞术观察肿瘤细胞对载药胶束的摄取；通过激光共聚焦观察载药胶束转运DOX在肿瘤细胞中的分布；选用Caspase-3试剂盒测定载药胶束对肿瘤细胞凋亡的诱导作用；采用流式细胞术观察载药胶束对肿瘤细胞周期的影响。
　　7．采用直接注射法制备肺癌骨转移瘤模型；通过 Micro-CT技术观察骨转移瘤对骨的影响；利用活体成像仪和荧光显微镜等手段测定载药胶束给药后DOX在荷瘤裸鼠体内的分布；通过测定裸鼠肿瘤体积以及生存率等评价载药胶束的体内抗肿瘤活性；通过组织HE染色法观察载药胶束的毒副作用。
　　结果：
　　一、基于PEG的pH敏感胶束DOX-hyd-PEG-ALN
　　1．通过1H NMR和IR等方法证实合成的DOX-hyd-PEG-ALN为目标物聚合物材料。
　　2．采用透析法制备DOX@DOX-hyd-PEG-ALN，制备温度为60 oC，制备用水量为32 mL，DOX-hyd-PEG-ALN与DOX的投料比为10:2。最终制得的DOX@DOX-hyd-PEG-ALN粒径为114 nm，载药量为24.3%，包封率为64.3%，CMC为2.3 mg/L。TEM观察显示DOX@DOX-hyd-PEG-ALN为球形，XPS分析表明骨靶向配体ALN存在于胶束表面。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN体外释药具有明显的 pH依赖性。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN对HA呈现迅速吸附的特性。
　　3．MTT结果显示在48 h后，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的细胞毒性明显强于DOX。荧光显微镜以及流式细胞术结果表明，肿瘤细胞对DOX@DOX-hyd-PEG-ALN的摄取具有时间依赖性。激光共聚焦结果表明游离DOX与肿瘤细胞孵育后能迅速分布于细胞核内，而DOX@DOX-hyd-PEG-ALN转运DOX首先分布在细胞质内，随着DOX@DOX-hyd-PEG-ALN破坏，释放出 DOX，然后分布在细胞核内。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN诱导A549细胞凋亡的作用具有时间和浓度依赖性。DOX以及DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能够时间依赖性地诱导A549细胞发生G2期和S期阻滞。
　　4．Micro-CT结果显示肿瘤生长处骨质被破坏，可见溶骨性区域。肿瘤切面目测呈鱼肉状，部分肿瘤细胞突破骨质生长。HE组织染色结果显示肿瘤细胞核仁清楚且大，细胞呈不规则状排列。
　　5．活体成像仪和荧光显微镜结果显示，与DOX相比，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN展现出良好的骨靶向性以及对肿瘤组织更强的渗透性，同时 DOX@DOX-hyd-PEG-ALN降低了DOX在心脏组织的分布。体内抗肿瘤实验结果显示，相比于DOX治疗组，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN治疗组裸鼠的生存期得到了显著延长，肿瘤生长得到了明显抑制。Micro-CT结果显示，相比于DOX，DOX@DOX-hyd-PEG-ALN能够提高骨肿瘤处的平均骨质密度。HE组织染色结果说明DOX@DOX-hyd-PEG-ALN对荷瘤裸鼠主要脏器没有毒副作用，但对肿瘤组织具有明显的杀伤作用，肿瘤细胞排列疏散，肿瘤组织出现大片空洞。
　　二、基于DEX的氧化还原敏感胶束
　　1．通过1H NMR和IR等方法证实合成的OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、ODA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(20K)-ALN、DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN为目标聚合物材料。
　　2．采用透析法制备载药胶束，制备温度为60 oC，制备用水量为32 mL，材料药物投料比为10:3。其中 DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@ODA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的粒径约为60 nm，而 DOX@DSPE-DEX(70K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(150K)-ALN粒径约为90 nm。7种载药胶束的Zeta电位处于-18到-25 mV之间。胶束载药量均高于17%，包封率均高于70%。胶束稳定性实验结果显示OA-DEX(5K)-ALN、MA-DEX(5K)-ALN、DSPE-DEX(5K)-ALN以及DSPE-DEX(20K)-ALN在含有20%FBS的 PBS溶液中可以稳定存在5天以上；而 DSPE-DEX(70K)-ALN、DSPE-DEX(150K)-ALN和ODA-DEX(5K)-ALN在相同条件下稳定性较差，随着孵育时间延长，其粒径表现出明显增大的趋势。TEM结果显示DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的外观接近球形；XPS分析表明骨靶向配体ALN存在于胶束的表面。体外释药研究表明，胶束释药具有GSH浓度依赖性。HA吸附实验结果显示，经过ALN修饰的胶束中，70%以上DOX与HA发生了吸附。
　　3．MTT实验结果显示 DOX@OA-DEX(5K)-ALN、DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN对A549细胞、PC-3细胞、MDA-MB-231细胞以及MDA-MB-231/ADR细胞的毒性作用均明显大于DOX，其中DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN对A549细胞、PC-3细胞和MDA-MB-231细胞的毒性强于 DOX@OA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(5K)-ALN，且对 A549细胞的毒性作最强。荧光显微镜以及流式细胞术实验结果表明，A549细胞对DOX@MA-DEX(5K)-ALN与DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN的摄取具有时间依赖性。相比于 DOX，DOX@MA-DEX(5K)-ALN与DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以很好的将DOX递送至耐DOX乳腺癌细胞（MDA-MB-231/ADR）内。激光共聚焦结果表明 DOX能迅速的分布于 A549细胞核内，但并不能有效进入MDA-MB-231/ADR细胞内。DOX@MA-DEX(5K)-ALN与DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN均可将 DOX转运至 A549以及耐 DOX的 MDA-MB-231/ADR细胞质内。DOX@MA-DEX(5K)-ALN与DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN诱导 A549细胞和MDA-MB-231/ADR细胞凋亡的作用均具有时间和浓度依赖性，且凋亡诱导作用强于DOX。与DOX相比，DOX@MA-DEX(5K)-ALN、DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN诱导细胞发生G2期阻滞的作用更强。
　　5．活体成像仪和荧光显微镜结果显示，与DOX相比，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN展现出了良好的骨靶向性以及肿瘤组织蓄积性，同时载药胶束降低了DOX在心脏组织的分布。体内抗肿瘤实验结果显示，相比于 DOX治疗组，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN治疗组裸鼠的生存期得到了显著延长，肿瘤生长得到了明显抑制。DOX@MA-DEX(5K)-ALN对荷瘤裸鼠的体重无明显影响，治疗效果优于DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN。Micro-CT结果显示，相比于DOX，DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN能够明显提高骨肿瘤处的平均骨质密度。HE组织染色结果显示DOX@MA-DEX(5K)-ALN对荷瘤裸鼠主要脏器没有毒副作用，对肿瘤组织具有明显的杀伤作用。
　　结论：
　　一、DOX@DOX-hyd-PEG-ALN具有较高的载药量以及包封率。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可以有效的被肿瘤细胞摄取，具有较强的细胞毒性作用。DOX@DOX-hyd-PEG-ALN可使DOX更多的蓄积在骨转移瘤处，增强了DOX的抗肿瘤活性，延长了荷瘤裸鼠的生存时间，减轻了肿瘤细胞对骨的破坏作用，并降低了DOX的毒副作用。
　　二、基于 DEX的载药胶束粒径均小于100 nm。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN可以有效的被肿瘤细胞以及耐药肿瘤细胞摄取；其比DOX具有更强的细胞毒性。DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DSPE-DEX(20K)-ALN具有很强的骨靶向性，增强了DOX对肿瘤的杀伤作用，延长了荷瘤裸鼠的生存时间，减弱肿瘤对骨的侵袭以及对骨密度的降低作用，降低了DOX的毒副作用。纵向比较DOX@MA-DEX(5K)-ALN和DOX@DOX-hyd-PEG-ALN对荷瘤裸鼠的治疗作用，结果显示 DOX@MA-DEX(5K)-ALN可以将更多的 DOX递送至肿瘤组织内，具有更好的抗肿瘤活性。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 骨肿瘤及其治疗

2. 治疗骨转移瘤的靶向递药系统

3. 多糖作为递药系统载体的研究进展

第一部分 基于PEG骨靶向胶束的制备及其抗肿瘤活性研究

实验一 基于PEG骨靶向胶束的制备及其表征

1 材料

2方法

3结果

3讨论

实验二 基于PEG骨靶向胶束的体外抗肿瘤活性研究

1 材料

2方法

3结果

3讨论

实验三 基于PEG骨靶向胶束的体内抗肿瘤活性研究

1材料

2方法

3 结果

4讨论

小结

第二部分 基于DEX骨靶向胶束的制备以及抗肿瘤活性研究

实验一 基于DEX骨靶向胶束的制备及其表征

1 材料

2 方法

3结果

4讨论

实验二 基于DEX骨靶向胶束的体外抗肿瘤活性研究

1 材料

2方法

3结果

4 讨论

实验三 基于DEX骨靶向胶束的体内抗肿瘤活性研究

1材料

2方法

3 结果

4讨论

小结

全文结论

参考文献

个人简历和研究成果

致谢