一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用，属于转基因作物检测技术领域。本发明提供的试剂盒，包括B73-6-1品系的特异性引物和探针以及内源参照基因的引物和探针；所述B73-6-1的品系特异性引物及探针是根据B73-6-1的5′端上游旁侧序列设计的；所述内源参照基因是根据GAG56D小麦醇溶蛋白基因设计的。本发明试剂盒既能够定性，又能够定量，准确度好，灵敏度高，检测灵敏度可达0.01％，特异性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒及应用，属于转基因作物检测技术领域。

背景技术

转基因小麦是利用基因工程技术，将外源基因导入小麦基因中，经过筛选得到的能够表达目的基因的小麦。转基因小麦B73-6-1是由基因枪将pHMW-1Dx5(携带高分子量麦谷蛋白亚基HMW-GS基因，由自身胚乳特异启动子驱动)和pAHC25(携带标记基因bar和GUS基因，上游连接广谱ubiquitin启动子)两个质粒通过共转化转入普通小麦品种中，经过筛选获得的表达外源基因HMW-GS、GUS和bar基因的纯合体转基因材料。目前，对于转基因小麦B73-6-1检测方法的研究仅限于定性检测，而不能够定量PCR检测，同时定性检测灵敏度不高，现有技术中缺少转基因小麦B73-6-1的定量PCR检测方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种转基因小麦B73-6-1的品系特异性定量PCR检测试剂盒，包括B73-6-1品系的特异性引物和探针以及内源参照基因的引物和探针；所述B73-6-1的品系特异性引物及探针是根据B73-6-1的5′端上游旁侧序列设计的；所述内源参照基因是根据GAG56D小麦醇溶蛋白基因设计的。

所述B73-6-1的5′端上游旁侧序列如SEQ ID NO.7所示。

所述B73-6-1的品系特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

所述内源参照基因的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

所述试剂盒在转基因小麦B73-6-1品系的定量检测中的应用。

优选地，所述应用，为利用核苷酸序列为SEQ ID NO.8-10所示的B73-6-1的品系特异性引物和探针以及SEQ ID NO.11-13所示的内源参照基因的引物和探针进行PCR反应，对转基因小麦B73-6-1进行特异性定量PCR检测。

优选地，所述PCR反应，条件为：预变性95℃30s；扩增95℃5s，60℃31s，40个循环。

优选地，所述PCR反应，每20μL定量扩增体系含有：待测样品DNA100ng，上游引物和下游引物各0.2μM，探针0.4μM，Taqman探针荧光染料1×，ROX参比染料1×，灭菌蒸馏水补足至20μL。

所述应用，具体步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)以样品DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.8-10所示的B73-6-1的特异性引物和探针进行荧光定量PCR反应；以内部参照基因为模板，利用核苷酸序列SEQ ID NO.11-13所示的特异性内源参照基因的引物和探针进行荧光定量PCR反应；设置空白对照；所述PCR反应条件为：预变性95℃30s；扩增95℃5s，60℃31s，40个循环；所述PCR反应，每20μL定量扩增体系含有：待测样品DNA100ng，上游引物和下游引物各0.2μM，探针0.4μM，Taqman探针荧光染料1×，ROX参比染料1×，灭菌蒸馏水补足至20μL。

本发明有益效果：

本发明通过分析外源基因HMW-GS基因的旁侧序列，设计引物进行品系特异性定性和定量PCR检测方法的建立。本发明方法既能够定性，又能够定量，并且准确度好，灵敏度高，检测灵敏度可达0.01％，品系特异性好。

附图说明

图1为B73-6-1转基因小麦基因组用Pst I、Dra I、Pvu I和EcoR V酶切检测结果；

(1，DL2000DNA分子量标准；2，Pst I；3，Dra I；4，Pvu I；5，EcoR V)。

图2为B73-6-1转基因小麦中质粒pHMW-1Dx5在基因组上的整合图谱。

图3结果；

(M，DL2000DNA分子量标准；1，HMW-GS 5'上游旁侧序列扩增片段)。

图4B73-6-1转基因小麦5'端上游旁侧序列Blast比对结果。

图5B73-6-1品系特异性定量PCR产物位置图示；

(M，DL2000DNA分子量标准；1，B73-6-1品系特异性定量PCR引物位置)。

图6标准品中GAG56D基因扩增曲线、标准曲线；

(A，标准曲线；B，扩增曲线)。

图7标准品中B73-6-1外源基因的扩增曲线、标准曲线；

(A，标准曲线；B，扩增曲线)。

图8不同转基因作物内参基因扩增检测结果；

(1，DL2000DNA marker；2-4为小麦内参基因GAG56D引物扩增非转基因小麦、转基因小麦B73-6-1、转基因小麦B72-8-1的检测结果(目的片段大小为319bp)；5-7为玉米内参基因zSSIIb引物扩增转基因玉米Bt176、MON810、MON863的检测结果(目的片段大小为88bp)；8-10为大豆内参基因lectin引物扩增转基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12的检测结果(目的片段大小为118bp)；11-13为水稻内参基因SPS引物扩增转基因水稻TT51、抗虫水稻科丰6号、非转基因水稻的检测结果(目的片段大小为277bp)；14-16为棉花内参基因sad1引物扩增转基因棉花MON531、MON1445、LLCOTTON25的检测结果(目的片段大小为107bp)；17-19为油菜内参基因HMYG引物扩增转基因油菜MS1、MS8、RF1的检测结果(目的片段大小为206bp))。

图9B73-6-1品系特异性定量PCR检测方法的特异性测定。

图10B73-6-1品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度测定。

图11 6种小麦的定量PCR扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

1转基因小麦B73-6-1外源基因旁侧序列分析

1.1DNA提取

将转基因小麦B73-6-1和非转基因小麦按质量百分比混合，制成八个不同转基因含量(10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％)的样品。称取100mg于研磨成粉末状的样品材料，使用植物DNA提取试剂盒提取样品总DNA。提取的总DNA溶于100μLddH₂O中，经NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美国)紫外分光光度计测定其浓度，最终稀释成100ng/μL备用。用紫外分光光度计测定DNA溶液的OD260与OD280，并计算OD260/OD280的比值来评价提取的质量，本研究中所用DNA其OD比值均在1.9左右。

1.2DNA文库构建

转基因小麦基因组建库所用试剂盒为Clontech Genome WalkerTM Universal Kit，其操作流程参照说明书。

1.2.1酶切

具体操作如下：取2μg的基因组DNA分别用100U的Pst I、Dra I、Pvu I和EcoR V限制性内切酶酶切，总体积500μL于1.5mL管中37℃过夜，直至基因组充分酶解；将酶切消化的DNA片段用酚∶氯仿(1∶1)抽提2次，70％酒精洗1次，沉淀后溶解在20μL的重蒸水中，电泳检测酶切效果(如图1)，酶切产物需弥散且均匀分布用于构建文库进行染色体步移分析。

1.2.2酶切产物与接头连接

将4μL酶解DNA片段产物加入200μL管中，然后加1.9μL相对应的接头(序列见表1)和1.6μL 10×连接缓冲液，接着加0.5μL T4连接酶，16℃连接过夜。最后，连接产物放置在70℃中5min以终止反应并加入72μL的重蒸水稀释以形成带接头的核基因组酶解DNA片段文库。

表1染色体步移所用接头及引物序列

1.3染色体步移引物设计

根据pHMW-1Dx5质粒的结构，在其5′端上游设计了GSP1和GSP2引物(图2)，引物相关信息如表2。

表2染色体步移所用所有引物

1.4染色体步移PCR扩增及测序

1.4.1巢式PCR反应条件

修饰接头连接PCR分为两轮巢式PCR反应。为了确保扩增的准确性和扩增长度，采用Advantage 2Polymerase Mix聚合酶。

第一轮反应体系为20μL，含1×Advantage 2PCR Buffer，0.25mmol/L dNTP mix，0.2μmol/L AP1和GSP1，1×Advantage 2Polymerase Mix，1μL连接DNA产物；反应条件：7个循环：变性95℃25sec，退火72℃3min；32个循环：变性94℃25sec，退火67℃3min；后延伸延伸67℃7min。

第二轮反应体系同第一轮反应体系为20μL，引物为AP2和GSP2，取稀释50倍的第一轮反应产物1μL为模板；反应条件：5个循环：变性95℃25sec，退火72℃3min；25个循环：变性94℃25sec，退火67℃3min；后延伸67℃7min。

1.4.2染色体步移扩增结果

HMW-GS上游扩增所用模板为使用限制性内切酶EcoRV构建的基因组库，所用GSP1为HR1258，GSP2分别是HR216，对应得到的特异片段大小分别约为1.6k，结果如图3，片段命名为“73-22”，将“73-22”进行测序分析，测序结果见SEQID NO.7。

将测序结果利用NCBI Blast分析，结果如图所示。此片段中有821bp序列为表达载体序列，其同源序列基因注释号为GQ149348，NCBI Blast结果见图4a；有32bp序列与细菌阿拉伯呋喃糖酶基因序列同源；有633bp为小麦基因组序列，其同源序列的小麦BAC文库号为BAC 897M20，详细序列见图4b。

1.2转基因小麦B73-6-1品系特异性荧光定量PCR检测方法的建立

1.2.1样品及DNA的提取

所用样品包括：非转基因小麦、转基因小麦B73-6-1、转基因小麦B72-8-1、转基因小麦含量为10％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％的小麦样品，转基因玉米Bt176、MON810、MON863、转基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、转基因水稻TT51、抗虫水稻科丰6号、非转基因水稻、转基因油菜MS1、MS8、RF1、转基因棉花MON531、MON1445、LLCOTTON25。

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取实验所用DNA。

1.2.2品系特异性定量PCR检测方法的建立

1.2.2.1品系特异性定量PCR引物和探针的设计

根据所获得的HMW-GS 5′端旁侧序列，设计品系特异性引物B73qF/B73qR和探针B73P，引物、探针序列见表3，其扩增产物大小为126bp(见图5)。

同时以小麦醇溶蛋白基因GAG56D作为内源基因参照(引物、探针序列见表3)，建立转基因小麦B73-6-1品系特异性定量PCR检测方法。

表3B73-6-1品系特异性定量PCR检测所用引物和探针

1.2.2.2品系特异性荧光定量PCR反应条件

内参基因GAG56D PCR反应所用的引物及序列见表3，扩增体系见表4，内参基因扩增的反应条件为预变性95℃30s；扩增95℃5s，60℃31s，40个循环。

5个不同稀释度的内参基因标准品、转基因植株、空白对照同时进行扩增，均设3个平行。实验数据用SDS软件(Sequence Detector System，美国ABI公司)分析。

表4定量扩增体系

1.2.2.3内参基因标准曲线的建立及在转基因小麦中的扩增

所用模板为转基因成分含量分别为5％、2％、1％、0.5％、0.1％转基因小麦。检测基因为GAG56D，构建标准曲线为Quantity＝10(-0.355Ct+12.706)，R²＝0.999，扩增曲线(图6)中的荧光值能够准确地反映目的产物的扩增。

1.2.2.4外源基因标准曲线的建立及在转基因小麦中的扩增

外源基因HMW-GS PCR反应所用的品系特异性引物为B73qF/R，探针为B73P，反应扩增体系见表4。

所用模板为转基因成分含量分别为5％、2％、1％、0.5％、0.1％转基因小麦，检测基因为HMW-GS基因，构建的标准曲线，Quantity＝10(-0.525Ct+16.266)，R²＝0.990，扩增曲线(图7)中的荧光值能够准确地反映目的产物的扩增。

1.2.3检测特异性的测定

为了验证不同转基因作物模板的有效性，分别选择不同作物对应的内参基因进行定性PCR扩增，扩增条件按照农业部下发的检测标准执行，结果显示所有模板都能扩增出内参基因条带(如图8)，说明模板正常工作，PCR反应体系未受抑制。

转基因小麦B73-6-1品系特异性检测使用的引物为B73qF/R，探针为B73P，目的片段大小为126bp。为了验证该定性体系的特异性，同时对所有模板进行扩增。检测结果显示，扩增曲线仅在B73-6-1为模板的时候出现，而其他转基因作物模板没有出现相应的扩增曲线(图9)，说明该引物具有品系特异性。

1.2.4检测灵敏度的测定

为测定该方法对转基因小麦的检测低限，取等量的0.1％和0％的标准品充分混匀，得到0.05％的转基因标准品；取0.1％的标准品0.1g与0.9g的0％标准品充分混匀，得到0.01％的转基因标准品。扩增从0.5％、0.1％、0.05％、0.01％和0％标准品，得到相应的Ct，根据标准曲线判断检测方法的灵敏度，结果显示检测灵敏度达到0.01％，结果如图10。

实施例2：检测实际样品

1、样品制备：选取待测小麦样品6个(鄂麦18、豫麦28、济麦22、山农19、转基因小麦B73-6-1、转基因小麦B72-8-11b)，使用植物DNA提取试剂盒进行小麦基因组DNA提取，使用NanoDrop 2000检测DNA的质量和浓度，确定样品DNA符合实验要求。

2、按照实施例1所建立的方法对6个小麦样品进行检测，结果如图11所示。

从图11中检测结果可以看出，建立的转基因小麦B73-6-1品系特异性荧光定量PCR检测方法可以准确、灵敏、特异性地从转基因小麦B73-6-1样品中检测到扩增曲线，而非转基因小麦和转基因小麦B72-8-11b样品未检测到扩增曲线，与样品实际情况相符。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。