转基因小麦B73-6-1品系特异性检测技术研究

摘要

自从1996年转基因作物大面积商业化种植以来，每年都以惊人的速度在发展，世界各国正在建立和不断完善转基生物(GMO)标签法，加强对转基因产品的安全监督，保障消费者的选择权和知情权。因此，对转基因作物检测技术的特异性、灵敏度和精确性提出了严格的要求。本研究以转基因小麦B73-6-1为研究对象，利用染色体步移技术，得到pAHC25质粒3’端旁侧序列信息，建立了品系特异性定性PCR检测方法。转基因小麦B73-6-1定性和定量检测技术体系的建立，这为制定准确、快速、高效地检测转基因小麦及其产品和相应试剂盒的开发提供技术支持提供了重要的技术手段。
　　 本研究通过接头连接介导染色体步行技术，成功分离到B73-6-1上pAHC25质粒外源基因插入位点的3’端旁侧序列4.7kb，其扩增片段覆盖了转化载体及转基因小麦基因组旁侧序列。生物信息学分析显示，2538bp之前的序列来源于不同载体的骨架序列，2538bp之后的序列未发现与之同源的序列，推测这2.2kb序列应该是bar基因整合到小麦基因组上时产生的重组序列和未知的小麦基因组序列。同时根据旁侧序列设计引物，建立品系特异性定性PCR检测方法，以典型的转基因作物证明该方法检测B73-6-1具有高特异性。根据旁侧序列设计定量引物，采用SYBR Green定量PCR技术进行定性检测并检测转基因小麦pAHC25载体bar基因的拷贝数，以蜡质WX012基因作为内参照基因，以非转基因小麦基因组DNA为内参照基因标准品，通过梯度稀释法，分别获得内参照基因Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程。在转基因小麦B73-6-1中，bar基因拷贝数是11。在建立定性、定量品系特异性检测方法同时，对检测方法的特异性、重现性、灵敏度进行研究，转基因小麦B73-6-1品系特异性定性PCR检测灵敏度是0.1％，品系特异性定量PCR检测低限是0.01％。本研究通过接头连接介导的染色体步移技术，成功得到4.7kb转基因小麦B73-6-1上pAHC25质粒外源基因插入位点的3’端旁侧序列。并通过定性和定量两种方法建立了B73-6-1品系特异性检测方法，重现性好、可信度高，进一步标准化后可望成为检测转基因小麦B73-6-1的常规方法。本研究成果为相关转基因产品进出口检验提供了强有力的技术支持。