蒲公英萃取物用于制备腺苷酸活化蛋白酶活化剂的用途

摘要

本发明公开了一种蒲公英(Taraxacum mongolicum)萃取物用于制备腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)活化剂的用途。其中该蒲公英萃取物是由蒲公英以一醇类萃取而得。且该蒲公英萃取物进一步包含由蒲公英的乙醇萃取物以一溶剂萃取而得的萃取物，该溶剂为正己烷(n-Hexane)、二氯甲烷(Dichloromethane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)或水。本发明可应用于调节人体内的脂肪酸、胆固醇、脂肪、三酸甘油酯、糖份的代谢、癌症及免疫功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)活化剂的用途，特别涉及 一种蒲公英萃取物用于制备腺苷酸活化蛋白酶活化剂的用途。

背景技术

蒲公英(Taraxacum mongolicum)，又称黄花地丁、婆婆丁，是温带至亚热 带常见的一种植物。生长力非常强，一般人将它视为杂草，甚至会为了花园或 草坪的美观去除蒲公英。然而蒲公英叶子含有丰富的维生素A与维生素C， 其嫩叶可作为一种野菜，用于凉拌、烧汤或炒熟食用，欧洲人在中世纪时也有 用蒲公英花来酿酒。而蒲公英的药用用途也很广泛，例如利尿、抗氧化、抗发 炎、治疗卵巢功能不全、不孕以及缓解更年期症状，对金黄色葡萄球菌、溶血 性链球菌等真菌类有杀菌作用，亦有疏通乳脉管的阻塞，促进泌乳的作用，另 外，也广泛地被使用于各种呼吸道疾病和肠胃炎的治疗上。

腺苷酸活化蛋白酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase，简 称AMPK)是一种由三种蛋白质组成的酶，从酵母菌到人类体内皆可见AMPK 的存在，主要作用在于维持细胞能量平衡。人体内许多组织表现AMPK，包 括肝、脑、以及骨骼肌。AMPK活化的净效应是刺激肝脏脂肪酸氧化和生成， 抑制胆固醇的合成，脂肪合成和甘油三酯的合成，抑制脂肪细胞的脂肪分解和 脂肪生成，骨骼肌脂肪酸氧化和肌肉摄取葡萄糖的刺激，调节胰岛素分泌胰腺 β-细胞。所以在过去的研究中认为AMPK与许多生物功能包括癌症、糖尿病、 适当的免疫功能有关。

因此，蒲公英易于遍殖特性，若能在蒲公英中发现可活化AMPK的活性 成分，对于需要调节脂肪酸、胆固醇、脂肪、甘油三酯、以及糖份的代谢者有 莫大的帮助，并对于癌症及免疫功能亦有相当的帮助。

发明内容

鉴于上述原因，本发明提供一种蒲公英(Taraxacum mongolicum)萃取物用 于制备腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)活化剂的用途，其中该蒲公英萃取物是由蒲 公英以醇类萃取而得。

于本发明一较佳实施例中，其中该蒲公英萃取物进一步包含由蒲公英的乙 醇萃取物以溶剂萃取而得的萃取物，该溶剂为正己烷(n-Hexane)、二氯甲烷 (Dichloromethane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)或水。

于本发明另一较佳实施例中，其中该蒲公英萃取物由醇类萃取而得且包含 蒲公英素(Taraxacerin A；结构式I)、紫黄质(All-trans-Violaxanthin；结构式II)、 或二者的混合物。

藉由前述的化合物蒲公英素与紫黄质，可应用于活化腺苷酸活化蛋白酶 (AMPK)，可调节脂肪酸、胆固醇、脂肪、甘油三酯、糖份的代谢、癌症及免 疫功能的相关疾病。在本发明的一实施例中，该蒲公英萃取物可活化个体的腺 苷酸活化蛋白酶，该个体较佳为人类。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用 以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本 发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后 附的权利要求书所界定的范围为准。

附图说明

图1表示蒲公英初步萃取流程图。

图2表示50％乙醇(TM-2)分液进一步分离的萃取流程图。

图3表示以MTT分析50％乙醇(TM-2)的各分液于48小时后的细胞存活 率。实验重复3次，棒(bar)代表标准误差(standard error，SE)。

图4表示TM-4经由抑制FASN的表现及ACC的活性以降低脂肪酸合成 活性。(A)HepG2细胞培养于12.5μg/mL TM-4一段时间。(B)HepG2细胞培 养于浓度为6.25、12.5及2.5μg/mL的TM-4一段时间。收集后将细胞裂解并 利用抗FASN、磷酸化ACC(p-ACC，Ser79)、以及β-actin的抗体做西方墨点 分析。(C)HepG2细胞以12.5μg/mL TM-4处理一段指定的时间，并以西方墨 点法分析萃取物中的磷酸化AMPK(p-AMPK^Thr172)以及β-actin含量。(D)HepG2 细胞与浓度为6.25、12.5及2.5μg/mL的TM-4培养24小时，以西方墨点法分 析萃取物中的磷酸化AMPK(p-AMPK^Thr172)与β-actin的含量。西方墨点法数据 皆为至少三次实验结果的平均。并将西方墨点法的结果依据控制组的表现量量 化。

图5表示蒲公英素(Taraxacerin A)and紫黄质(All-trans-Violaxanthin)活化 人类肝癌HepG2细胞。(A)HepG2细胞以DMSO(控制组)、浓度为10、20、 40、80μM的蒲公英素处理48小时。(B)HepG2细胞以DMSO(控制组)、浓度 为10、20、40、80μM的紫黄质处理48小时。收集细胞之后，将细胞裂解并 利用抗磷酸化AMPK(p-AMPK^Thr172)、AMPK以及β-actin的抗体进行西方墨点 分析。西方墨点法数据皆为至少三次实验结果的平均。并将西方墨点法的结果 依据控制组的表现量量化。

具体实施方式

本发明实施例中所使用的β-actin的抗体购自Sigma(St.Louis，MO)。 蒲公英全株购自当地中药市场(屏东，台湾)。脂肪酸合成酶(fatty acid  synthase,FASN)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(phospho-acetyl-CoA  carboxylase(ACC，Ser 79)、以及磷酸化AMPK(phospho-AMPK，Thr 172)的 抗体购自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。LKB1的抗体购自Santa  Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。鼠及兔被标定辣根过氧化酶 (horseradish peroxidase，HRP)的抗体购自Chemicon(Temecula，CA)。西 方化学冷光HRP基质(Western chemi luminescent HRP substrate)购自 Millipore Corporation(Billerica，MA)。

所有的实验数值以平均值±标准偏差表示。每个值均为至少三次实验的平 均。实验组与对照组间的差异是以学生t检定(student’s t test)分析。

以下就蒲公英萃取物的制备、以西方墨点法验证制备出的蒲公英萃取物对 于活化AMPK的活性，并以MTT分析蒲公英萃取物的细胞毒性；并进一步利用 气相层析质谱分析仪(GC-MS)分析蒲公英萃取物中是何种活性成分具有活化 AMPK的实验过程及结果，详述如实施例1至4。

实施例1

蒲公英萃取物的制备

蒲公英(Taraxacum mongolicum)全株切碎并分别以1.5L的水(TM-l)、50％ 乙醇(TM-2)、以及95％(TM-3)乙醇回流萃取三次，共三小时，请参见图1。初 步实验发现TM-l、TM-2及TM-3中，活化AMPK的效果以TM-2最佳。将50％乙 醇萃取物(TM-2)过滤并将溶剂蒸发后溶于水中，并依图2的流程图将50％乙醇 (TM-2)以溶剂-溶剂分离的方式分成不同的分液：正己烷(n-hexane)、二氯甲 烷(dichloromethane)、以及乙酸乙酯(ethyl acetate)三溶剂，由低至高极性 以溶剂-溶剂分离的方式分成不同的分液。将50％乙醇萃取物(TM-2)、正己烷 (TM-4)、二氯甲烷(TM-5)、乙酸乙酯(TM-6)及水(TM-7)这五个分液存放于冷藏 库中备用。

此外，蒲公英于水或乙醇萃取前的切碎动作为获得较小碎片的蒲公英，以 利于后续萃取的进行，但不限于切碎方式，其他可使蒲公英成为较小碎片的物 理性处理方法例如捣碎或粉末研磨等方式亦可应用于此。

实施例2

蒲公英萃取液的细胞毒性分析

细胞以1×10⁴细胞/孔的密度植入24孔培养盘中隔夜。细胞在以50％ 乙醇(TM-2)的各分液(TM-4、TM-5、TM-6及TM-7)处理48小时。接着，于容积 为500μL的每孔加入40μL的MTT(浓度为2mg/mL；购自Sigma Chemical Co.)， 于37℃培养2小时。MTT-甲臜结晶形成，然后加入250μL的DMSO以融化结 晶。最后，以酶联免疫吸附测定法(enzyme-l inked immunosorbent assay，ELISA) 读取器测量550nm的吸亮度。实验结果如图3所示，MTT分析结果显示TM-2 的四个分液皆未对细胞造成细胞毒性。

实施例3

蒲公英萃取液活化AMPK的效果

3-1HepG2细胞培养

将人类肝癌的HepG2细胞以37℃、5％CO₂的加湿环境中，培养于含有10％ 胎牛血清(购自Invitrogen Carlsbad,CA)及1％青霉素-链霉素 (penicillin-streptomycin，购自Invitrogen,Carlsbad,CA)的Dulbecco’ s修改的Eagle’s培养基(DMEM，购自Invitrogen,Carlsbad,CA)。

3-2西方墨点分析

细胞以1×10⁶个细胞/孔的密度植入100-mm组织培养盘上，并以含有 10％胎牛血清的DMEM培养。然后细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM并以图4 及图5的图式简单说明所列不同药剂处理24小时。处理后将细胞置于冰上并 以冰的磷酸盐缓冲溶液冲洗，再将其以裂解缓冲溶液裂解。西方墨点法的方法 依Way et al.,2009完成。

FASN与ACC为脂质生成的关键酵素。为进一步研究TM-4降血脂的机制， 研究ACC磷酸化作用。为评估ACC的活性，ACC于丝胺酸79(serine 79)的磷 酸化作用以西方墨点法分析。TM-2的四个分液的实验结果(图中未示)，以TM-4 活化AMPK的效果最佳；其中，以TM-4处理的HepG2细胞在ACC于丝胺酸79 的磷酸化作用以剂量及时间依赖的方式增加，请参见图4。其中，(A)HepG2 细胞培养于12.5μg/mL TM-4一段时间；(B)HepG2细胞培养于浓度为6.25、 12.5及2.5μg/mL的TM-4一段时间；(C)HepG2细胞以12.5μg/mL TM-4 处理一段指定的时间；(D)HepG2细胞与浓度为6.25、12.5及2.5μg/mL的 TM-4培养24小时。此外，以TM-4处理的HepG2细胞在FASN蛋白质以剂量及 时间依赖的方式增加(图4中A、B图)。这些结果表示蒲公英抑制脂肪酸合成 的酵素活性，并造成总脂质含量降低。FASN抑制剂明显活化降低体重路径； 因此，经由FASN抑制剂调节下丘脑(hypothalamic)途径及/或新颖神经胜肽 (neuropeptide)系统的化合物可能为一抗肥胖的候选药物。

AMPK活化被认为是细胞能量平衡反应的关键，而目前被接受的AMPK活化 指标，是AMPK在羟丁氨酸172(threonine 172)的磷酸化，即p-AMPK^Thr 172。 因此，我们测定以TM-4处理的HepG2细胞的AMPK磷酸化。西方墨点分析结果 指出，TM-4可时间及剂量依赖地激发AMPK磷酸化(图4中C、D图)。其中， (C)HepG2细胞以12.5μg/mL TM-4处理一段指定的时间；(D)HepG2细胞与 浓度为6.25、12.5及2.5μg/mL的TM-4培养24小时。这些结果显示蒲公英 经由活化AMPK途径以抑制脂肪酸合成酶的活性。AMPK于脂质代谢的角色是近 年来的重点研究，在脂肪酸合成中表现出重要的角色。这重要的代谢调节剂至 少在调节ACC的磷酸化与去磷酸化周期以及FASN的表现量上发挥功能。快速 活化AMPK磷酸化并且抑制ACC。缓慢活化AMPK降低固醇调节因子结合蛋白 (sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)表现量，而抑 制ACC、FASN以及其他脂质生成酶的合成。药学上造成一「低能量状态」，于 体内(in vivo)及体外(in vitro)皆导致AMPK引起ACC磷酸化、FASN降解。

实施例4

蒲公英萃取物的气相层析质谱分析仪(GC-MS)分析组成

因先前结果显示在TM-4于活化AMPK的效果最佳，因此我们进一步研究在 TM-4中的活化AMPK活性化合物。

成份分析中，利用氦气为载流气体，以Shimadzu GCMS-QP2010GC-MS系 统的微管柱(DB-5,30m×0.250mm,J&W Scientific,USA)完成。注入量 与流速分别为1μL及0.82ml/min。注入温度设定为250℃。管柱温度初始 维持45℃然后以5℃/min的速率升至270℃。以70eV电子撞击游离法 (electron impact ionizat ion)得到质谱。于GC-MS数据库中做峰值的化学识 别。

最后分离出二主要化合物蒲公英素(Taraxacerin A；结构式I)与紫黄质 (All-trans-Violaxanthin；结构式II)。结构式I的外观为淡黄色糖浆状， 分子量为198.07，熔点为283℃。结构式I的外观为橘色结晶，分子量为600.85， 熔点为200℃。

为测试此二化合物活化AMPK的效果，利用实施例3的西方墨点法测定 以蒲公英素与紫黄质二化合物处理的人类HepG2肝癌细胞的AMPK磷酸化程 度。结果发现蒲公英素(图5中A图)与紫黄质(图5中B图)于人类HepG2肝癌 细胞中大致呈现剂量依赖地激发AMPK磷酸化。由此可知，蒲公英素与紫黄 质二化合物具有活化AMPK的效果。

综上所述，蒲公英乙醇萃取物及前述具有结构式Ⅰ、结构式II的化合物： 蒲公英素与紫黄质，具有可有效活化AMPK的活性。故可藉由蒲公英萃取物、 蒲公英素或紫黄质作为腺苷酸活化蛋白酶(AMPK)的活化剂。另外，本发明实 施例结果亦高度显示蒲公英素与紫黄质可为一调节AMPK活化的有效化合物， 可藉由该些天然物质例如用于调节脂肪酸、胆固醇、脂肪、甘油三酯、糖份的 代谢、癌症及免疫功能。