大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌，耐受丁醇的大肠杆菌其分类命名为大肠杆菌Bw1.8-4(Escherichia？coli)Bw1.8-4，保藏号CCTCC？NO：M2015365。本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌,能在0.85％V/V丁醇的LB液体培养基中高效的生长。本发明运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受丁醇的大肠杆菌，避免了传统理化诱变菌带来的化学试剂和辐射的污染，也避免了连续驯化周期长的缺点,与传统的全基因组改组技术相比，本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌比出发菌株耐受丁醇能力强。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种运用易错全基因组改组技术提高大肠杆菌的丁醇耐 受性的方法及耐受丁醇大肠杆菌。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁可替代的生物能源已成为全球的 研究热点。大肠杆菌具有繁殖速度快、易进行基因修饰等优点，作为细胞工厂构建代谢途径 生产化工产品已经备受瞩目[1]。但E.coli菌体对丁醇的耐受性不高，成为其作为工业化宿 主菌株的一大缺陷。因此，有效的提高E.coli对丁醇的耐受性是其作为细胞工厂生产丁醇的 必要条件[1-4]。

目前通过丁醇耐受性相关基因的过表达、适应性进化等手段获得丁醇耐受性菌株。利用 代谢工程提高菌株丁醇耐受性需要掌握详尽的遗传学知识，而很多菌种的代谢机制、转录调 控机制等认知不全，使得基因工程、代谢工程技术在菌种改造中存在局限性[2-4]。运用分子 生物学手段对某一或某几个特定基因过表达或敲除难以多方位改造菌的特性、大幅度提高其 耐受性。目前大肠杆菌的丁醇耐受机制不清晰，也限制了运用系统生物学手段同时改变多基 因表达以获得优化的耐受菌株。因此，随机突变获得的耐受丁醇菌是有效途径之一。

全基因组改组技术能有效的获得多基因突变有特定性能的菌株。传统的全基因组改组技 术需要结合理化诱变获得优良菌株进而通过原生质体融合而实现各菌株全基因的洗牌，从而 筛选出耐受性状提高的菌[5]。理化诱变筛选菌的方法对操作人员有一定的危害、适应进化也 费时费力。因而，本发明运用易错全基因改组手段获得具有耐受性的大肠杆菌，以提高其作 为细胞工厂构建丁醇代谢菌的应用能力。

参考文献：

1.刘增然张光一.合成高级醇的微生物细胞工厂研究进展生物工程学报， 2013,29(10):1421-1430.

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5.罗剑，杨民和，施巧琴.微生物菌种选育中的基因组改组技术及其应用进展生物技术 2008,81-83.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种大肠杆菌的易错全基因组改组方法。

本发明的第二个目的是提供一种耐受丁醇的大肠杆菌。

本发明的技术方案概述如下：

大肠杆菌的易错全基因组改组方法，包括如下步骤：

(1)基因组DNA提取：提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA；

(2)易错PCR扩增全基因组：

取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10-17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl₂、 5μL的10×突变buffer、20ng步骤(1)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μL Taq DNA聚 合酶、补充无菌水至50μL；所述dNTPS母液含10mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP；所 述10×突变buffer含1mM pH8.3的Tris-HCl，0.7mM MgCl₂、5mM KCl、1g/100mL甘油；

易错PCR反应条件：94℃预变性5分钟；92℃1min，再在37℃的条件下退火1min，再 由37℃以每秒变化0.1℃的速度升至55℃，55℃延伸4min，进行50个循环，55℃补充延伸 10min；

(3)全基因组改组：将步骤(2)获得的PCR产物通过乙醇沉淀浓缩10倍，制备出发菌株大 肠杆菌BW25113的感受态细胞；取浓缩后的PCR产物3-5μL至50ul所述大肠菌的感受态细 胞，1800V电击后加入LB液体培养基，混匀后转移到无菌离心管中于37℃静置培养1-2小时， 涂布于丁醇浓度为1-1.6％V/V的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱37℃培养1-3天， 得丢失含有pKD46质粒的单克隆即转化子；

(4)评价：挑取步骤(3)所述单克隆至LB液体培养基中于静置培养至对数晚期,保存菌 液；分别接种上述单克隆的菌液和出发菌株大肠杆菌至LB液体培养基，培养至OD₆₀₀为 1.2-1.8；再分别转接至丁醇浓度为0.8％V/V的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度 一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇的转化子；

(5)第二轮全基因组改组，即转化子Bw1.3(2)‐4的改组：将步骤(4)中获得的丁醇耐受性 最强的转化子Bw1.3(2)‐4进行第二轮的易错全基因改组；为提高外源易错PCR产物与基因组 中的各个基因的重组效率，将含有Red重组酶基因的pKD46质粒从大肠杆菌BW25113菌中提 取后重新转化到转化子Bw1.3(2)‐4，获得含有pKD46质粒的BW1.3(2)‐4的菌株，按照步骤(1) ‐(3)对含有pKD46质粒的BW1.3(2)‐4的菌株进行全基因组改组，其中步骤(3)所述LB固 体培养基筛选平板的丁醇浓度改为1.6‐2.0％V/V，筛选得到单克隆即转化子；

(6)第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价：挑取步骤(5)所述单克隆、大肠杆菌 BW25113、转化子BW1.3(2)‐4分别接种至LB液体培养基，培养至对数晚期，再分别转接至丁 醇浓度为0.85％V/V的含丁醇的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长 曲线，筛选出耐丁醇能力更强的转化子。

耐受丁醇的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)Bw1.8-4，保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2015365。

本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌,能在0.85％V/V丁醇的LB液体培养基中高效 的生长。与传统的全基因组改组技术相比，本发明有效地运用易错PCR技术实现无需理化诱 变和原生质体融合即能快速有效获得耐受丁醇的大肠杆菌。在丁醇浓度为0.85％V/V的培养基 中出发菌株大肠杆菌BW25113的生长受到严重抑制，而本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠 杆菌比出发菌株耐受丁醇能力强。传统的易错PCR技术只能对特定的基因进行有效突变，而 全基因组改组技术需要结合理化诱变获得优良菌株进而通过原生质体融合而实现各菌株全基 因的洗牌，从而筛选出耐受性状提高的菌^[7]。理化诱变筛选菌的方法给操作人员带来化学试 剂和辐射的污染，本发明采用全基因组改组技术与传统的全基因改组技术比，无需原生质体 融合和诱变、所使用的试剂安全环保，操作快捷高效。,本发明采用含有pKD46质粒的BW25113 菌作为出发菌株，该质粒含有red重组酶基因能提高重组效率，将其运用到易错全基因组改 组，能高效地获得耐丁醇的大肠杆菌，本发明的方法比适应性驯化的方法效率高，时间短。 本发明采用两轮全基因改组提高大肠杆菌的丁醇的耐受性，第二轮改组时将含有red重组酶 基因的pKD46质粒转入转化子中，本发明的方法也可以用于出发菌株不含pKD46质粒的大肠 杆菌，即提取BW25113的pKD46质粒，转化至不含该质粒的其它大肠杆菌菌株，以提高重组 效率。

附图说明

图1为大肠杆菌BW25113的易错PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，M为3μL TIANGEN公司 MarkerⅢ，从上至下所指示的条带分别为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp 和200bp。泳道1至9为实施例2中用12-17bp的随机引物获得的5μL的易错PCR产物的电 泳图。

图2为大肠杆菌BW25113和实施例3获得的单克隆在丁醇浓度为0.8％V/V的LB液体 培养基中的生长发酵比较。

图3M为3μl Maker Ⅲ，1号泳道为pKD46质粒4μL；2-3泳道为pKD46质粒用限制 性内切酶BamHⅠ消化1个小时后上样10μL；4号泳道为限制性内切酶用BamHI酶和NcoI酶 共同消化1h后上样10μL。

图4是实施例5中筛选出的耐受丁醇的大肠杆菌的转化子、实施例3获得的BW1.3(2) -4和大肠杆菌BW25113在含丁醇0.85％V/V的LB液体培养基中的生长曲线。

生物材料样品保藏

本发明涉及的耐受丁醇的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌Bw1.8-4(Escherichia coli) Bw1.8-4，该菌株已于2015年6月19日保藏于地址为中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物 保藏中心，其保藏号CCTCC NO：M2015365。

具体实施方式

大肠杆菌BW25113购于：biovector NTCC公司。大肠杆菌BW25113含有pKD46质粒。 BW25113中的pKD46质粒含有red重组酶基因能提高重组效率，但该质粒是温敏型复制子， 因此在第一轮全基因组改组的时候质粒丢失。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1基因组DNA提取：

提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA，具体操作如下：甘油管中的上述菌液转 接至含有5mL的LB液体培养基的试管中，37℃培养过夜，使OD600＝2～3。将培养物移至离 心管中，4℃13000rpm离心1分钟后弃上清，沉淀用30μL无菌水重悬后，离心弃上清。在 离心管内加入120μL破菌缓冲液、60μL Tris饱和酚、60μL氯仿、120μL TE缓冲液，120 μL体积石英砂，充分震荡4min后，4℃13000rpm/5min离心取上清液。在上清液中加入1mL 无水乙醇，颠倒混匀，于-20℃放置30min后，于4℃，13000rpm/25min离心，弃上清液，沉 淀晾干，取50μL无菌水重悬得到基因组DNA。

LB液体培养基为：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，余量为水。

LB固体培养基为：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，20g/L琼脂粉，余量为水。

破菌缓冲液：

2％(V/V)TritonX‐100，1％(W/V)SDS，100nmol/L NaCl，1nmol/L EDTA，10nmol/L pH8.0 Tris‐cl.

TE缓冲液10nmol/L Tris‐cl(pH8.0)；1nmol/L pH8.0EDTA

实施例2易错PCR扩增全基因组：

取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10-17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl₂、 5μL的10×突变buffer、20ng步骤(1)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μL Taq DNA聚合 酶、补充无菌水至50μL；所述dNTPS母液含10mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP；所述 10×突变buffer含1mM pH8.3的Tris‐HCl，0.7mM MgCl₂、5mM KCl、1g/100mL甘油；

易错PCR反应条件：94℃预变性5分钟；92℃1min，再在37℃的条件下退火1min，再 由37℃以每秒变化0.1℃的速度升至55℃，55℃延伸4min，进行50个循环，55℃补充延伸 10min；扩增产物如图1所示。

16.6μL的100uM10-17个碱基的任意引物均可以扩增出易错PCR产物。

16.6μL的100uM10-17个碱基分别为：

8.3μL 100uM 10个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 12个碱基的随机引物；

6.6μL 100uM 14个碱基的随机引物和10μL 100uM 15个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 13个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 15个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 16个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 17个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 13个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 14个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 15个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 16个碱基的随机引物；

16.6μL 100uM 16个碱基的随机引物；

16.6μL 100uM 15个碱基的随机引物；

8.3μL 100uM 11个碱基的随机引物和8.3μL 100uM 12个碱基的随机引物；

本实施例以上述随机引物为例，是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但 并不对本发明作任何限制。

图1中，

泳道1是使用8.3μL 10个碱基的随机引物1和8.3μL 12个碱基的随机引物2扩增的 易错PCR产物；

泳道2为6.6μL 14个碱基的随机引物1和10μL 15个碱基的随机引物2扩增的易错PCR 产物；

泳道3为8.3μL 13个碱基的随机引物1和8.3μL 15个碱基的随机引物2扩增的易错 PCR产物；

泳道4为8.3μL 16个碱基的随机引物1和8.3μL 17个碱基的随机引物2扩增的易错 PCR产物；

泳道5为8.3μL 13个碱基的随机引物1和8.3μL 14个碱基的随机引物2扩增的易错 PCR产物；

泳道6为8.3μL 15个碱基的随机引物1和8.3μL 16个碱基的随机引物2扩增的易错 PCR产物；

泳道7为16.6μL 16个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；

泳道8为16.6μL 15个碱基的随机引物扩增的易错PCR产物；

泳道9为8.3μL 11个碱基的随机引物1和8.3μL 12个碱基的随机引物2扩增的易错 PCR产物

实施例3全基因组改组：

将实施例2获得的各种PCR产物混匀，通过乙醇沉淀浓缩10倍用于电转化；

将含有pKD46质粒的大肠杆菌BW25113接种到3mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培 养基中，30℃培养过夜；次日按1％的比例转接到含50ug/mL氨苄青霉素的50mL的LB液体 培养基中，30℃培养至OD₆₀₀＝0.15～0.2，加入L-阿拉伯糖至终浓度为20mmol/L，诱导质粒 pKD46表达Red重组蛋白；培养至OD₆₀₀＝0.45～0.5时取出在冰上预冷10～15min，4℃、5000 g离心10min，弃上清，菌体分别用20mL冰冷的无菌水洗涤1次，20mL预冷的10％的甘油 洗涤两次，浓缩100倍即用500uL冰冷的10％甘油重悬混匀，即得感受态细胞。

取4份感受态细胞，每份50μl，分别加入浓缩10倍的PCR产物3μL，4μL，5μL，及 无菌超纯水5μL，分别转移至无菌预冷的1mm电击杯中，1800V电击，加入37℃预热的450ul  LB液体培养基，混匀后转移到1.5ml无菌离心管中，37℃静置1小时(也可以静置2小时)， 将每个电击后的约500μL培养物各取100μL涂布于丁醇浓度为1.0％、1.2％、1.4％和1.6％V/V (也可以是1.0％-1.6％V/V之间的任意浓度)的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱 37℃培养1-3天，观察平板上单克隆菌落的生长状况，若用无菌超纯水5μL电转化后所涂的 平板未长出菌落而浓缩PCR电转化细胞的样品所涂的平板长出菌落，则挑取转化板上的单克 隆用于后续丁醇耐受性评价。

实施例4耐受丁醇转化子的评价

将实施例3中平板长出的单克隆分别命名为1.2(3)-2,1.2(3)-3,1.2(3)-4,1.3(2)-4 和1.4-4接种LB液体培养基中于37℃、180-200rpm培养至对数晚期,保存菌液。为了比较 转化子与出发菌株大肠杆菌BW25113在含0.8％(v/v)丁醇的LB液体培养中的生长差别，从而 选出耐受丁醇能力强的菌株，分别接种上述单克隆的菌液和大肠杆菌BW25113至LB液体培 养基中于37℃静置180rpm转培养至OD₆₀₀为1.5-2.0，5000g/18℃的条件下离心5min，弃上 清，加入LB液体培养基使浓缩后OD₆₀₀为25，再分别转接至50mL丁醇浓度为0.8％(v/v)的LB 液体培养基，初始OD600控制在0.15，置于37℃200rpm的摇床培养、测定各菌株的生长曲 线见图2。

在0.8％(v/v)丁醇的LB培养基中、菌1.2(3)-2,1.2(3)-3,1.2(3)-4,1.3(2)-4和1.4-4 对于丁醇的抗性都要明显好于大肠杆菌BW25113，在6h时候OD600均高于出发菌大肠杆菌， 说明用该技术进行的全基因组改组有效，即运用全基因改组技术成功获得了转化子。菌株 1.3(2)‐4的丁醇耐受性最强，最高OD₆₀₀达到0.5，为各菌株中最高值，可以用BW1.3(2)‐4作 为出发菌株进行下一轮的基因组改组。

实施例5转化子Bw1.3(2)‐4的改组及丁醇耐受评价

BW25113中含的pKD46质粒是温敏型复制子,30℃培养可正常复制，在37℃环境下培养 pKD46会丢失。在获得转化子Bw1.3(2)‐4的筛选和培养过程均在37℃培养，因而质粒pKD46 自动去除，为提高转化子Bw1.3(2)‐4的重组效率，因此将pKD46质粒转入转化子Bw1.3(2)‐4， 使转化子Bw1.3(2)‐4能够产生Gam、Beta、Exo三种蛋白，从而提高重组效率。

用天根质粒小量提取试剂盒从大肠杆菌BW25113提取pKD46质粒，按照实施例3所述的 方法制备Bw1.3(2)‐4的感受态细胞，取10ng的pKD46质粒至50ul的感受态细胞中混合均匀， 混合后移至无菌预冷的1mm电击杯中，1800V电击，电击后立刻加入30℃预热的450ul LB液 体培养基于30℃静置1小时，在25μg/ml的氯霉素平板上筛选出转化的单克隆。挑取单克 隆至LB液体培养基中培养，提取出质粒进行酶切电泳鉴定，如图3所示，pKD46质粒经BamHI 和NcoI酶切，产生2235bp和3390bp片段，与预期结果一致，即获得含有pKD46质粒的 BW1.3(2)‐4的菌株，该菌株用于后期电转化。

按照实施例3中的所述的方法进行电转化，将每个电击后的500μL培养物各取100μL 涂布于2个含1.6％、2个含1.8％和一个含2.0％丁醇的LB固体平板，倒置放于培养箱30℃ 培养1-3天，观察平板上单克隆菌落的生长状况，若用无菌超纯水5μL电转化后所涂的平板 未长出菌落而浓缩PCR电转化细胞的样品所涂的平板长出菌落，则挑取转化板上的单克隆用 于后续的丁醇耐受性评价。

实施例6第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价：

将实施例5中平板长出的单克隆接种LB液体培养基中于37℃、180-200rpm培养至对数 晚期,保存菌液。将上述单克隆、出发菌株BW25113和转化子Bw1.3(2)‐4分别接种至LB液 体培养基，于37℃静置预培养至OD₆₀₀＝1时转至4mL 0.8％丁醇的LB液体培养基，使菌的初 始浓度控制在OD600＝0.15。菌株长至6h，Bw1.8‐4与BW2.0‐1的OD₆₀₀达到最高值，分别为 0.64和0.62，而出发菌株BW25113和Bw1.3(2)‐4的最高OD₆₀₀分别为0.51和0.57，所以选取 Bw1.8‐4和Bw2.0‐1用于后续摇瓶评价。

摇瓶评价用的液体LB培养基的丁醇浓度提高到0.85％V/V。

将大肠杆菌BW25113，第二轮的全基因改组的出发菌株Bw1.3(2)‐4与转化子Bw1.8‐4和 Bw2.0‐1分别按种至LB液体培养基于37℃、180-200rpm培养至对数晚期,5000g/18℃的条 件下离心5min，弃上清，加入LB液体培养基重悬菌体，使菌液浓缩后的OD₆₀₀为25，再分别 将上述浓缩的菌液转接至50mL丁醇浓度为0.85％V/V的LB液体培养基，初始OD600控制在 0.1，测定各菌株的生长曲线见图4。

0.85％丁醇浓度的50ml LB液体培养基内进行培养，测得生长曲线如图4。由图可知，在 0.85％丁醇的LB培养基中，大肠杆菌BW25113的生长受到了抑制，最高OD₆₀₀为0.25,本轮 的出发菌株Bw1.3(2)‐4最高OD₆₀₀为0.31，Bw1.8‐4、Bw2.0‐1的OD₆₀₀的最高值分别为0.35 和0.31，BW25113，出发菌株Bw1.3(2)‐4、Bw1.8‐4和Bw2.0‐1的最大比生长速率分别为 0.248/h、0.339/h、0.379/h和0.355/h，其中，Bw1.8‐4的比生长速率最高。本轮改组得到的转 化子中，细胞密度最高值和比生长速率最大的菌株为Bw1.8‐4。保藏该菌株，见“生物材料样 品保藏”。