一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒和抗肿瘤应用

摘要

本发明公开了一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒和抗肿瘤应用，属于基因工程技术领域。本发明的大鼠Kif11基因干扰shRNA，shRNA正义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA反义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本发明还提供了含有大鼠Kif11基因干扰shRNA序列的重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11，病毒滴度高，每毫升含有1×1013病毒转导颗粒，能显著抑制肿瘤细胞Kif11基因表达，抑制肿瘤细胞增殖反应，在肿瘤治疗方面具有应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大鼠Kif11基因干扰shRNA 及其重组腺相关病毒干扰载体和抗肿瘤应用。

背景技术

Kif11(kinesin family member 11，又称Eg5)是驱动蛋白家族成员之一，通 常认为其在增殖组织细胞中高表达，定位于有丝分裂期的微管，是细胞分裂过 程中染色体的定位、中心体的分离以及双极纺锤体的形成和分离的关键分子。 随着Kif11抑制剂monastrol的发现，能够用于抗肿瘤的Kif11小分子抑制剂已 经成为国际上众多制药公司的研发热点。有研究显示Kif11在非分裂的神经细 胞中也有表达，与调节神经轴突的生长有关，但是否发挥其他功能尚未明确。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双 链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解 的一种生物学现象，能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III 家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-23nt及3’端突出的siRNA， 随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC) 结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结 合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，能特 异性阻断靶基因的表达。

目前人工实现RNAi的主要方法之一是直接将体外合成的siRNA序列导 入细胞，主要缺点在于转染效率低，效果不稳定，作用持续时间短。另一种是 通过转染载体持续稳定表达siRNA，主要优点在于稳定大量的表达短发夹 RNA(shRNA)，shRNA末端在体内被加工、处理成约21bp的类siRNA分子， siRNA将启动RNAi因此可用于长时间干扰靶基因的表达。常用的载体包括腺 相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒、慢病毒。与后两者相 比，腺相关病毒AAV的突出优势在于安全性高，免疫原性低，宿主范围广， 携带的转染基因能长期稳定表达，体外和体内均可应用，具有多种血清型，能 满足针对不同组织的转染要求，具有广阔的应用范围和前景。

目前已经有针对Kif11的小干扰RNA产品，例如圣克鲁斯的生产的 siRNA、shRNA质粒和慢病毒颗粒，但是靶基因针对小鼠Kif11，病毒滴度也 不高，每毫升含有1×10⁶慢病毒转导颗粒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关 病毒干扰载体和抗肿瘤应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种大鼠Kif11基因干扰shRNA，shRNA正义链的核苷酸 序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA反义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了含有大鼠Kif11基因干扰shRNA序列的重组腺相关病毒 rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11。

该重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11为9型重组腺相关病毒。

本发明还公开了重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11在制备抗 肿瘤药物中的应用。

所述的药物为抑制肿瘤细胞Kif11基因表达的药物。

进一步地，所述的药物为抗肾上腺嗜铬细胞瘤的药物。

所述的药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物

进一步地，所述的药物为抗黑色素瘤的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的大鼠Kif11基因干扰shRNA，其正义链和反义链的核苷酸序 列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。大鼠Kif11基因干扰shRNA能够起 到抑制Kif11基因表达的作用。

本发明提供的含有大鼠Kif11基因干扰shRNA序列的重组腺相关病毒 rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11，具有抑制Kif11基因表达及抑制肿瘤细胞增殖 的作用。本发明制备的含有Kif11基因干扰shRNA的重组腺相关病毒滴度高， 每毫升含有1×10¹³病毒转导颗粒，能显著抑制肿瘤细胞Kif11基因表达，抑 制肿瘤细胞增殖反应，在肿瘤治疗方面具有应用前景。

附图说明

图1为干扰质粒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11酶切鉴定结果图；

图2为PCR检测rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒转染肾上 腺嗜铬细胞瘤PC12后Kif11 mRNA相对表达量；

其中，(a)为Kif11，(b)为内参β-actin；

图3为MTT法检测rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒对黑素 瘤细胞增殖的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的进行详细的描述，所用试剂如无特殊说明均 购自Invintrogen，实施例中的实验方法按照常规条件，参考分子克隆实验指南 (第三版，J.萨姆布鲁克等著)和试剂说明书中所述的条件。

1、靶向大鼠Kif11基因shRNA序列的获得

根据NCBI公开的大鼠Kif11基因序列(Genbank:NM_001169112.1)设 计shRNA序列，具体设计参考美国Invintrogen公司网站(其网址 http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/sort.do)提供的RNAi在线设计软 件。

靶基因序列5’-GTGCTGCAAGGATCGATTGAT-3’(SEQ.ID.NO.3)；

shRNA序列由Invinrogen公司合成，具体如下(下划线字体为BamH Ⅰ、 HindIII酶切位点)：

shRNA正义链(SEQ.ID.NO.1)：

5’-GATCCGTGCTGCAAGGATCGATTGATTTCAAGAGAATCAATCGAT CCTTGCAGCACTTTTTTAGATCTA-3’

shRNA反义链(SEQ.ID.NO.2)：

5’-AGCTTAGATCTAAAAAAGTGCTGCAAGGATCGATTGATTCTCTTG AAATCAATCGATCCTTGCAGCACG-3’

对照序列(Scramble)：5’-TCGCTTACCGATTCAGAATGG-3’

scramble正义链：

5’-GATCCTCGCTTACCGATTCAGAATGGTTCAAGAGACCATTCTGAAT CGGTAAGCGATTTTTTAGATCTA-3’

scramble反义链：

5‘-AGCTTAGATCTAAAAAATCGCTTACCGATTCAGAATGGTCTCTTGA ACCATTCTGAATCGGTAAGCGAG-3’。

2、将干扰序列导入rAAV9-ZsGreen-shShRNA质粒载体

将上述干扰序列在95℃条件下解链4分钟，75℃条件下退火10分钟，将 单链序列退火形成带粘性末端的双链序列。质粒载体rAAV9-ZsGreen-shRNA (百恩维生物科技有限公司)用限制性内切酶BamH Ⅰ+HindIII双酶切。DNA 连接酶进行连接，22℃水浴反应过夜。连接体系见表1。

表1质粒载体连接反应体系

3、rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11干扰质粒载体酶切鉴定

转化大肠杆菌JM109感受态细胞，然后涂于Ampicillin抗性的LB平板上， 倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。挑取若干单克隆菌落，接种于Ampicillin抗 性的培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，然后用小量质粒提取试剂盒小提质粒 (具体步骤按试剂盒说明操作)。rAAV9-ZsGreen-ShRNA-rEG5阳性克隆可酶 切得到900bp的条带。如图1所示，1为DNA Marker，从上到下 8000bp,3000bp,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。2-3为阳性克隆。

4、干扰载体rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组9型腺相关病毒包装

1)转染目的质粒到细胞

常规复苏和胰酶消化HEK293细胞，完全培养基稀释细胞至2×10⁶/ml，37℃ 培养箱中孵育24h。转染按试剂盒说明书操作，在420μL灭菌水中加入包装质 粒及含目的基因的质粒DNA共30μl，再加入50μL buffer B，使三者总体积达 到500μl。再将等体积buffer A溶液逐滴加入，混匀后静置2min后，将1ml混 合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻摇混匀。37℃培养箱中孵育 4-6h后换液继续培养。次日早上更换新鲜完全培养基(含1％双抗)。换液48 小时后，用吸管将细胞从培养皿中吹下来收集到离心管中，置于-80℃和37℃ 水浴锅中反复冻融三次，3000rpm离心10min，收集上清，浓缩； rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11第一代毒种(P1)可于-80℃长期保存。2ml P1代 病毒感染一个75cm的细胞培养瓶的细胞，可用于病毒扩增。

2)荧光定量PCR测定病毒滴度

构建的重组腺相关病毒载体中含有hGH polyA(184bp)序列，可用定量 PCR进行病毒滴度检测。

hGH polyA引物正义链：5’-CAAGCGATTCTCCTGCCTCA-3’

hGH polyA引物反义链:5’-ACGCCTGTAATCCCAGCAAT-3’

常规反应条件：1个循环(50℃，2min；95℃，10min)，40个循环(95℃, 30s；60℃,30s)。反应体系见表2：

表2定量PCR检测病毒滴度反应体系

3)将样品cT值依标准曲线进行比对，所得结果即为对应病毒核酸拷贝数。

依公式：

病毒基因组拷贝数/毫升(vg/ml)＝(病毒核酸拷贝数/2μl)×(50μl/2μl) ×1mL/200μl×稀释度，计算每毫升病毒液中病毒基因组拷贝数。

滴度检测结果见表3：

表3病毒滴度检测结果

5、rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒对肾上腺嗜铬细胞瘤 PC12的Kif11基因表达的抑制作用

1)PC12细胞培养

常规将肾上腺嗜铬细胞瘤PC12接种于25cm²培养瓶中，加入1640培养基(含 10％胎牛血清)，37℃，培养箱内培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90％以 上聚集度时传代。以含10％胎牛血清的1640调整细胞密度后重新接种于6孔板中， 密度为8×105/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。

2)重组腺相关病毒感染PC12细胞

将培养细胞分成两组:对照组用rAAV9-ZsGreen-shRNA-Scramble转染PC12 细胞；shRNA干扰组rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11转染PC12细胞，每组设3个 重复。逐滴加入到含有细胞和完全培养基的6孔板中，轻柔混匀。37℃培养箱中 孵育48h。

3)样品制备

提取总RNA(具体实验方法参见试剂说明)。腺相关感染48h后，吸尽培 养基，PBS洗涤，每孔(直径3.5cm)加入1mL Trizol后，静置2分钟，吹打 裂解细胞。裂解液转入EP管中,在室温放置5分钟；加入0.2mL氯仿，颠倒混 匀15秒，低温离心15分钟。上清置于新EP管中，加异丙醇(1mL TRIZOL 加0.5mL)入，在室温下(15℃～30℃)放置10分钟，12000转(2℃～8℃) 离心10分钟；弃上清，75％乙醇洗涤，低温离心5分钟，弃上清；RNA沉淀 物在室温干燥；用Rnase-free water溶解RNA沉淀，定量后-80℃超低温冰箱 保存备用。

4)cDNA模板的合成

反应体系见表4，在离心管中轻轻将各种成分混合，37℃下孵育2分钟。 在室温下加入1μl(200单位)M-MLV逆转录酶，轻吹打混匀。37℃孵育50 分钟。在70℃加热15分钟以终止反应。cDNA产物直接作为q-PCR的模板。

表4 cDNA模板反应体系

5)PCR反应

引物设计：大鼠Kif11(166bp)，

正义链(f)：5’-TGGACGTTCACAAAGCACTG-3’

反义链(r):5’-GCTGCTAACGACTGCTCTTC-3’

内参：b-actin(240bp)

正义链(f)5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’

反义链(r)：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

常规反应条件：1个循环(50℃，2min；95℃，10min)，40个循环(95℃, 30s；60℃,30s)，反应体系见表5：

表5 Kif11基因表达PCR检测体系

rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒转染对Kif11基因表达的抑 制作用，与scramble对照组相比，抑制率达68％，参见图2，PCR检测 rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒转染肿瘤细胞PC12后Kif11  mRNA相对表达量。图中，1为Marker，从上到下2000bp,1000bp,750bp,500bp, 250bp,100bp。其中，(a)为Kif11，(b)为内参β-actin。

6、MTT法检测干扰病毒对肿瘤细胞增殖的影响

常规培养A2058细胞(ATCC)，以0.125％胰蛋白酶消化A2058细胞成单 细胞悬液，分于96孔板，每孔100μl。37℃、5％CO₂培养箱中培养6h后， 弃上清，每孔加入200μl无血清培养基，病毒液转染24h(分为对照scramble 组和shRNA组)。弃上清，加胎牛血清培养液，继续培养24h加入20ul MTT 溶液(5mg/mL)，培养4h。弃上清，每孔150μl二甲基亚砜，摇床10min， 使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值。

计算细胞生长抑制率％＝[1-A(实验组)/A(对照组)]×100％

shRNA处理组对黑素瘤细胞生长抑制率显著提高，参见图3，结果表明： shRNA处理组对黑素瘤细胞生长抑制率显著高于scramble对照组，提示Kif11 干扰shRNA具有抗肿瘤增殖的作用。

综上所述，本发明提供的大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病 毒，其正义链和反义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。

含有Kif11基因干扰shRNA的重组腺相关病毒的制备，包括以下步骤：

(1)根据大鼠Kif11基因设计合成shRNA序列；

(2)将干扰序列导入rAAV9-ZsGreen-ShRNA质粒载体；

(3)将目的片段rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11构建入9型重组腺相关病 毒。

本发明提供的rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11重组腺相关病毒滴度高，每 毫升含有1×10¹³慢病毒转导颗粒，能抑制肾上腺嗜铬细胞瘤Kif11基因的表 达，该干扰重组病毒能显著降低肿瘤细胞PC12细胞Kif11基因表达，抑制率 达68％，能抑制恶性肿瘤细胞的增殖反应，因此在肿瘤治疗方面具有应用前景。