包含一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合物和含有来自流感嗜血杆菌的蛋白E和/或PilA的蛋白组分的免疫原性组合物

摘要

本发明涉及包含一种或多种肺炎链球菌荚膜糖缀合物和蛋白质组分的免疫原性组合物，所述蛋白质组分包含来自流感嗜血杆菌的蛋白E和/或PilA。

说明书

技术领域

本发明涉及包含一种或多种肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）荚膜糖缀合物和蛋白组分的免疫原性组合物，所述蛋白组分包含来自流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的蛋白E和/或PilA。

背景

不可分型的流感嗜血杆菌（NTHi）是重要且常见的呼吸道病原体，其在婴儿和儿童中引起中耳炎。NTHi是次于肺炎链球菌的在儿童中最常见的急性中耳炎原因（J. Immunology 183: 2593-2601（2009），Pediatrics 113:1451-1465（2004））。它是儿童和成人中重要的鼻窦炎原因（Current Infectious Disease Reports 11:177-182（2009））。它已与成人中的慢性阻塞性肺疾病（COPD）中增加的加重危险相关。（Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115（2006））。另外，不可分型的流感嗜血杆菌引起成人中的社区获得性肺炎，并且可以在发展中国家引起儿童中的肺炎。（Current Infectious Disease Reports 11:177-182（2009））。

肺炎链球菌（肺炎链球菌（S. pneumoniae））也称为肺炎球菌，是革兰氏阳性细菌。肺炎链球菌是遍及全世界的重大公共卫生问题，并且负责相当大的发病率和死亡率，尤其是在婴儿、老年人和无免疫应答的人中。肺炎链球菌引起广泛范围的重要人体病理学，包括社区获得性肺炎、急性鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、败血病、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝织炎和脑脓肿。每年仅在美国肺炎链球菌据估计为3,000例脑膜炎、50,000例菌血症、500,000例肺炎和7,000,000例中耳炎中的致病因子（Reichler，M. R.等人，1992，J. Infect. Dis. 166: 1346；Stool，S. E.和Field，M. J.，1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11）。在来自发达国家和发展中国家的小于5岁的儿童中，由于肺炎球菌疾病的死亡率尤其高。老年人、无免疫应答的人和患有其他潜在状况（糖尿病、哮喘）的患者也对疾病特别敏感。

由肺炎链球菌引起的主要临床综合征在标准医学教科书中是广泛公认且讨论的（Fedson D S，Muscher D M. In: Plotkin S A，Orenstein W A，编辑Vaccines. 第4版Philadelphia WB Saunders Co，2004a: 529-588）。例如，将侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）定义为其中从血液或另一个通常无菌部位中分离到肺炎链球菌的任何感染（Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L，Bennett J E，Dolin R（编辑）. Principles and Practice of Infectious diseases（第5版）. New York，Churchill Livingstone，2001，第2128-2147页）。

慢性阻塞性肺疾病是肺的慢性炎性疾病，并且是全世界的发病率和死亡率的主因。美国在2005年大约20例死亡有一例具有COPD作为潜在原因。（Drugs and Aging 26:985-999（2009））。估计在2020年COPD将上升至伤残调整生命年（disability adjusted life year）、慢性无效性疾病（chronic invalidating diseases）的第五大主因，以及死亡率的第三位最重要的原因（Lancet 349:1498-1504（1997））。

因此，存在针对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的组合疫苗的需要。

蛋白E（PE）是具有粘附特性的外膜脂蛋白。它在不可分型的流感嗜血杆菌（NTHi）对上皮细胞的粘附/侵袭中起作用。（J. Immunology 183: 2593-2601（2009）；The Journal of Infectious Diseases 199:522-531（2009），Microbes and Infection 10:87-96（2008））。它在有包膜的流感嗜血杆菌和不可分型的流感嗜血杆菌两者中是高度保守的，并且具有保守的上皮结合结构域。（The Journal of Infectious Diseases 201:414-419（2010））。当与作为参考菌株的流感嗜血杆菌Rd相比较时，十三个不同的点突变已在不同的嗜血杆菌属（Haemophilus）物种中得到描述。它的表达在对数生长期和稳定期细菌两者中观察到（WO2007/084053）。

蛋白E也涉及通过结合玻连蛋白的人补体抗性。（Immunology 183: 2593-2601（2009））。PE通过结合结构域PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR（SEQ ID NO. 1，对应于SEQ ID NO. 4的氨基酸84-108），结合其为末端补体途径的重要抑制剂的玻连蛋白。（J. Immunology 183:2593-2601（2009））。

Pilin A（PilA）可能是涉及颤动的流感嗜血杆菌IV型菌毛（Tfp）的主要菌毛蛋白亚基（Infection and Immunity，73: 1635-1643（2005））。NTHi PilA是在体内表达的保守黏附素。它已显示涉及NTHi粘附、定殖（colonization）和生物膜形成。（Molecular Microbiology 65: 1288-1299（2007））。

本发明人已发现PilA和PE可以有利地存在于免疫原性组合物中，用于预防流感嗜血杆菌，并且此外，PilA和蛋白E可以加入包含肺炎链球菌荚膜糖的组合物中，以便提供可以预防流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染的免疫原性组合物。技术人员将知道载体诱导的表位抑制的效应，并且已知一般对多重缀合物抗原的同时暴露可以导致增强或缩小的免疫应答（Plotkin等人，Vaccines fourth addition 2003）。

概述

本发明人已发现PilA、PE（或其片段）和来自肺炎链球菌的糖可以有利地组合在免疫原性组合物中，以提供针对流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的有效保护。

相应地，在第一个方面，提供了包含一种或多种（例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种）肺炎链球菌荚膜糖缀合物和蛋白组分的免疫原性组合物，所述蛋白组分包含来自流感嗜血杆菌的蛋白E或蛋白E的免疫原性片段和/或PilA（或PilA的免疫原性片段）。

在第二个方面，提供了包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂的疫苗。

在第三个方面，提供了针对由肺炎链球菌感染引起的疾病免疫主体的方法，其包括给主体施用治疗有效剂量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。

在第四个方面，提供了针对由流感嗜血杆菌感染引起的疾病免疫主体的方法，其包括给主体施用治疗有效剂量的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。

在第五个方面，提供了用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。

在第六个方面，提供了用于治疗或预防由流感嗜血杆菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗。

在第七个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。

在第八个方面，提供了本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗在制造用于治疗或预防由流感嗜血杆菌感染引起的疾病的药物中的用途。

附图简述

图1. 融合蛋白构建体LVL291、LVL268和LVL269的经诱导的细菌提取物的SDS-PAGE。在诱导（ind）前和诱导后，对于LVL291、LVL268和LVL269装载不溶性级分（I）、可溶性级分（S）和培养基级分（M）。

图2. 与融合蛋白构建体LVL291、LVL268和LVL269的纯化提取物相关的SDS-PAGE和蛋白质印迹。对于LVL291、LVL268和LVL269的纯化装载流通物(flow through)级分（Ft）、洗涤级分（W）和洗脱级分（E）。抗his标签用于探测提取物。

图3. 融合蛋白构建体LVL291和LVL315的经诱导的细菌和纯化提取物的SDS-PAGE。对于LVL291和LVL315装载培养基级分（M）、可溶性级分（Sol）、不溶性级分（Ins）、流通物级分（Ft）、洗涤级分#1（W1）、洗涤级分#2（W2）和洗脱级分（E）。

图4. 融合蛋白构建体LVL312的经诱导的细菌和纯化提取物的SDS-PAGE。对于LVL312装载培养基级分（M）、可溶性级分（Sol）、不溶性级分（Ins）、流通物级分（Ft）、洗涤级分#1（W1）、洗涤级分#2（W2）和洗脱级分（E）。

图5. 融合蛋白构建体LVL317的经诱导（1mM和10μM IPTG）的细菌提取物的SDS-PAGE。来自诱导前（NI）和诱导后（In）的提取物、可溶性级分（S）、不溶性级分（I）。

图6. 融合蛋白构建体LVL318的经诱导（1mM和10μM IPTG）的细菌提取物的SDS-PAGE。来自诱导前（NI）和诱导后（In）的提取物、培养基级分（M）、可溶性级分（S）、不溶性级分（I）。

图7. PE、PilA和PE-PilA融合蛋白的CD谱。

图8. PE和PilA CD谱的组合。

图9. PilA热变性曲线。

图10. PE变性曲线。

图11. PE-PilA融合蛋白热变性曲线。

图12. 典型的SP Sepharose^TM快速流动层析图。

图13. 典型的Q Sepharose^TM快速流动层析图。

图14. 来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的SDS-PAGE。

图15. 来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的蛋白质印迹。印迹使用兔多克隆抗PE。

图16. 来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的蛋白质印迹。印迹使用兔多克隆抗大肠杆菌（E.coli）（BLR）。

图17. PE-PilA融合蛋白以及PE和PilA蛋白的热转变。曲线：PilA（1），蛋白E（Prot E，PE）（2），未稀释的PE-PilA纯化批次(bulk)，737μg/ml（3），和以最终容器浓度稀释的PE-PilA纯化批次，60μg/ml（4）。

图18. 在Balb/c小鼠模型中针对LVL291 PE-PilA融合蛋白以及针对单价PE和PilA的抗体应答。

图19. PE-PilA融合蛋白疫苗接种对小鼠鼻咽中的NTHi菌株86-028NP细菌清除的作用。

图20. PE-PilA融合蛋白疫苗接种对小鼠鼻咽中的NTHi菌株3224A细菌清除的作用。

图21. PilA疫苗接种对小鼠鼻咽中的细菌清除的作用。

图22. PE疫苗接种对小鼠鼻咽中的细菌清除的作用。

图23.（a）与玻连蛋白结合的LVL317 PE-PilA融合蛋白，以及（b）与玻连蛋白结合的LVL317和LVL735 PE-PilA融合蛋白。

图24. 通过针对PE-PilA融合蛋白的多克隆抗体的玻连蛋白结合抑制。

图25. 融合蛋白构建体LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740和pET26b载体（阴性对照）的经诱导的细菌提取物的可溶性级分的SDS-PAGE。（a）实验1（b）实验2（c）实验3。PE-PilA融合蛋白由箭头指示。

图26. 来自实验1、2和3的可溶性级分中的融合蛋白的平均条带百分比。

图27. 针对LVL317和LVL735的PE和PilA抗体应答。

图28. LVL735和LVL317疫苗接种对不可分型的流感嗜血杆菌鼻咽定殖的小鼠模型中的细菌清除的作用。

图29. 如使用抗糖ELISA测定在小鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含12种糖缀合物的组合物（12V）和包含10种糖缀合物的组合物（10V）的免疫原性的图表。GMC=几何平均浓度。IC =置信区间。

图30. 如使用调理吞噬测定在小鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含12种糖缀合物的组合物（12V）和包含10种糖缀合物的组合物（10V）的免疫原性的图表。GMT=几何平均滴度。

图31. 如使用抗蛋白ELISA测定在小鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含单独的PhtD、dPly和PE-PilA的组合物（prot）的免疫原性的图表。GMC=几何平均浓度。IC =置信区间。

图32. 如使用调理吞噬测定在豚鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含12种糖缀合物的组合物（12V）和包含10种糖缀合物的组合物（10V）的免疫原性的图表。GMT=几何平均滴度。

图33. 如使用抗糖ELISA在豚鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含12种糖缀合物的组合物（12V）和包含10种糖缀合物的组合物（10V）的免疫原性的图表。GMC=几何平均浓度。IC =置信区间。

图34. 如使用抗蛋白ELISA在豚鼠注射后测量的，比较包含12种糖缀合物、PhtD、dPly和PE-PilA 的组合物（12V + prot）与包含单独的PhtD、dPly和PE-PilA的组合物（prot）的免疫原性的图表。GMC=几何平均浓度。ic =置信区间。

详述

在第一个方面，本发明涉及包含一种或多种（例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种）肺炎链球菌荚膜糖缀合物和蛋白组分的免疫原性组合物，所述蛋白组分包含来自流感嗜血杆菌的蛋白E（或其免疫原性片段）和/或PilA（或其免疫原性片段）。

术语“蛋白组分”指包含蛋白E（或其免疫原性片段）和/或PilA（或其免疫原性片段）的氨基酸序列，所述蛋白组分可以包含单独的蛋白E、单独的PilA、单独的蛋白E的免疫原性片段、单独的PilA的免疫原性片段、蛋白E和PilA、蛋白E和PilA的免疫原性片段、蛋白E的免疫原性片段和PilA的免疫原性片段或蛋白E和PilA的免疫原性片段（例如作为融合蛋白）。蛋白组分可以进一步包含另外的序列。

蛋白E

如本文使用的，“蛋白E（Protein E）”、“蛋白E（protein E）”、“Prot E”和“PE”意指来自流感嗜血杆菌的蛋白E。蛋白E可以由下述组成或包含下述：

的氨基酸序列，以及在整个长度上与SEQ ID NO. 4具有至少或确切75%、77%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%同一性的序列。来自流感嗜血杆菌的53种蛋白E序列的比较（表1，SEQ ID NO. 5 – SEQ ID NO. 57）证实与如SEQ ID NO. 4中所示的蛋白E大约77%至大约100%同一性。例如，在蛋白E的氨基酸序列中，氨基酸#20可以是异亮氨酸（I）或苏氨酸（T）；氨基酸#23可以是丙氨酸（A）或缬氨酸（V）；氨基酸#24可以是赖氨酸（K）或谷氨酸（E）；氨基酸#31可以是丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；氨基酸#32可以是脯氨酸（P）或丙氨酸（A）；氨基酸#34可以是苏氨酸（T）或丙氨酸（A）；氨基酸#37可以是精氨酸（R）或谷氨酰胺（Q）；氨基酸#47可以是缬氨酸（V）或丙氨酸（A）；氨基酸#57可以是色氨酸（W）或可以不存在（-）；氨基酸#70可以是丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；氨基酸#93可以是谷氨酰胺（Q）或不存在（-）；氨基酸#109可以是苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；氨基酸#119可以是甘氨酸（G）或丝氨酸（S）；氨基酸#153可以是谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；氨基酸#156可以是丝氨酸（S）或亮氨酸（L）；氨基酸#160可以是赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）；氨基酸#161可以是赖氨酸（K）、异亮氨酸（I）或不存在（-）；氨基酸#162 - #195可以不存在，或如SEQ ID NO. 15中所示（其中（-）指示氨基酸#166不存在）或如SEQ ID NO. 16中所示；或其任何组合。

蛋白E可以由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自下述的任何一个或多个氨基酸处不同于SEQ ID NO. 4：氨基酸#20、氨基酸#23、氨基酸#24、氨基酸#31、氨基酸#32、氨基酸#34、氨基酸#37、氨基酸#47、氨基酸#57、氨基酸#70、氨基酸#93、氨基酸#109、氨基酸#119、氨基酸#153、氨基酸#156、氨基酸#160、氨基酸#161和氨基酸#162-#195，其中氨基酸#20是苏氨酸（T）；氨基酸#23是缬氨酸（V）；氨基酸#24是赖氨酸（K）；氨基酸#31是苏氨酸（T）；氨基酸#32是丙氨酸（A）；氨基酸#34是丙氨酸（A）；氨基酸#37是谷氨酰胺（Q）；氨基酸#47是丙氨酸（A）；氨基酸#57 不存在（-）；氨基酸#70是苏氨酸（T）；氨基酸#93不存在（-）；氨基酸#109是异亮氨酸（I）；氨基酸#119是丝氨酸（S）；氨基酸#153是赖氨酸（K）；氨基酸#156是亮氨酸（L）；氨基酸#160是天冬酰胺（N）；氨基酸#161是赖氨酸（K）或异亮氨酸（I）；或氨基酸#162 - #195如SEQ ID NO. 15中所示（其中（-）指示氨基酸#166不存在）或如SEQ ID NO. 16中所示。

表1：来自53种流感嗜血杆菌菌株的蛋白E氨基酸序列（SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57）。-指示氨基酸不存在。

蛋白E可以是来自下述流感嗜血杆菌菌株的蛋白E：3224A、RdKW20、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittEE、PittHH、PittII、R3021、22.4-21、3219C、3185、3241A、038144S1、810956、821246、840645、902550Z19、A840177、A860514、A950014、306543X4、A930105、901905U、A920030、3221B、27W116791N、N218、N163、N162、N107、N91、D211PG、D211PD、D201PG、D201PD、D198PG、D198PD、D195PD、D189PG、D189PD、D129CG、D124PG、D124PD、D58PG、D33OD、BS433、BS432、1714、1128或BS430。蛋白E可以是如SEQ ID NO. 5 – SEQ ID NO. 57中任一个所示的蛋白E。

蛋白E可以是在整个长度上与SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个具有至少95%或98%、99%同一性的序列。蛋白E可以是在整个长度上与表1中所示的任何序列（SEQ ID NO. 5 – SEQ ID NO. 57）具有至少95%同一性的序列。

蛋白E的免疫原性片段包含SEQ ID NO. 4的至少7、10、15、20、25、30或50个邻接氨基酸的免疫原性片段。在一个实施方案中，该片段是蛋白E的小于150、125、100、75或60个氨基酸，例如在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含蛋白E的小于150、125、100、75或60个氨基酸。免疫原性片段可以引发可以结合SEQ ID NO. 4的抗体。免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:4的B和/或T细胞表位。

蛋白E的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个的至少7、10、15、20、25、30或50个邻接氨基酸的免疫原性片段。免疫原性片段可以引发抗体，所述抗体可以结合片段由其衍生的全长序列。免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:4 – SEQ ID NO. 57的B和/或T细胞表位。在一个实施方案中，蛋白E的免疫原性片段选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）和SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）。在另一个实施方案中，蛋白E的免疫原性片段选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）、SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）、SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。在进一步的实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）、SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）、SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。更具体而言，在一个实施方案中，免疫原性片段是SEQ ID NO. 124，SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160。在另外的实施方案中，免疫原性片段是SEQ ID NO. 125，SEQ ID NO. 5的氨基酸20-160。在另一个实施方案中，免疫原性片段是选自下述的来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段：SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。

蛋白E含有上皮细胞结合区，据报道其在超过100种临床NTHi分离物、有包膜的流感嗜血杆菌和分析的培养物保藏菌株中是保守的（Singh等人，J. Infect. Dis. 201（3）:414-9（2010））。Singh等人报道蛋白E在NTHi和有包膜的流感嗜血杆菌两者中是高度保守的（不含信号肽96.9% – 100%同一性）。在一个实施方案中，蛋白E的片段包含SEQ ID NO. 128的结合区。

在一个实施方案中，蛋白E或其免疫原性片段能够引发识别SEQ ID NO:4的免疫应答。使用ELISA测定（例如实施例22中所述的ELISA），可以确定第一蛋白是否能够引发识别第二蛋白的免疫应答。

PilA

如本文使用的，“PilA”意指来自流感嗜血杆菌的菌毛蛋白A。PilA可以由下述组成或包含下述：

的蛋白序列，以及与SEQ ID NO. 58具有80% - 100%同一性的序列。例如，PilA可以与SEQ ID NO. 58至少80%、85%、90%、95%、97%或100%相同。来自流感嗜血杆菌的64种PilA序列（表2，SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121）的全长比较证实与如SEQ ID NO. 58中所示的PilA大约80% - 100%同一性。例如，在PilA的氨基酸序列中，氨基酸#6可以是谷氨酰胺（Q）或亮氨酸（L）；氨基酸#7可以是谷氨酰胺（Q）或苏氨酸（T）；氨基酸#37可以是谷氨酰胺（Q）或赖氨酸（K）；氨基酸#44可以是丙氨酸（A）或丝氨酸（S）；氨基酸#57可以是丙氨酸（A）或丝氨酸（S）；氨基酸#67可以是天冬酰胺（N）或甘氨酸（G）；氨基酸#68可以是谷氨酸（E）或赖氨酸（K）；氨基酸#69可以是苏氨酸（T）或脯氨酸（P）；氨基酸#71可以是赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；氨基酸#73可以是苏氨酸（T）、丝氨酸（S）或甲硫氨酸（M）；氨基酸#76可以是赖氨酸（K）、丝氨酸（S）或天冬酰胺（N）；氨基酸#84可以是苏氨酸（T）或赖氨酸（K）；氨基酸#86可以是丙氨酸（A）或缬氨酸（V）；氨基酸#91可以是赖氨酸（K）或丙氨酸（A）；氨基酸#94可以是苏氨酸（T）、异亮氨酸（I）或赖氨酸（K）；氨基酸#96可以是丝氨酸（S）或谷氨酰胺（Q）；氨基酸#97可以是天冬酰胺（N）或丝氨酸（S）；氨基酸#99可以是丙氨酸（A）或甘氨酸（G）；氨基酸#103可以是丙氨酸（A）或赖氨酸（K）；氨基酸#109可以是天冬氨酸（D）、丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；氨基酸#110可以是甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、或精氨酸（R）；氨基酸#112可以是丝氨酸（S）或谷氨酸（E）；氨基酸#114可以是苏氨酸（T）或异亮氨酸（I）；氨基酸#116可以是苏氨酸（T）或谷氨酰胺（Q）；氨基酸#118可以是谷氨酸（E）、苏氨酸（T）、丙氨酸（A）、赖氨酸（K）或丝氨酸（S）；氨基酸#121可以是丝氨酸（S）或丙氨酸（A）；氨基酸#122可以是丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；氨基酸#123可以是赖氨酸（K）、苏氨酸（T）或丙氨酸（A）；氨基酸#128可以是赖氨酸（K）或苏氨酸（T）；氨基酸#135可以是天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）；氨基酸#136可以是丙氨酸（A）或苏氨酸（T）；氨基酸#145可以是甘氨酸（G）或精氨酸（R）；氨基酸#149可以是谷氨酰胺（Q）或赖氨酸（K）；或其任何组合。

PilA可以由氨基酸序列组成或包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在选自下述的任何一个或多个氨基酸处不同于SEQ ID NO. 58：

氨基酸#6、氨基酸#7、氨基酸#37、氨基酸#44、氨基酸#57、氨基酸#67、氨基酸#68、氨基酸#69、氨基酸#71、氨基酸#73、氨基酸#76、氨基酸#84、氨基酸#86、氨基酸#91、氨基酸#94、氨基酸#96、氨基酸#97、氨基酸#99、氨基酸#103、氨基酸#109、氨基酸#110、氨基酸#112、氨基酸#114、氨基酸#116、氨基酸#118、氨基酸#121、氨基酸#122、氨基酸#123、氨基酸#128、氨基酸#135、氨基酸#136、氨基酸#145和氨基酸#149，其中氨基酸#6是亮氨酸（L）；氨基酸#7是苏氨酸（T）；氨基酸#37是赖氨酸（K）；氨基酸#44是丝氨酸（S）；氨基酸#57是丝氨酸（S）；氨基酸#67是甘氨酸（G）；氨基酸#68是赖氨酸（K）；氨基酸#69是脯氨酸（P）；氨基酸#71是赖氨酸（K）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；氨基酸#73是丝氨酸（S）或甲硫氨酸（M）；氨基酸#76是丝氨酸（S）或天冬酰胺（N）；氨基酸#84是赖氨酸（K）；氨基酸#86是缬氨酸（V）；氨基酸#91是丙氨酸（A）；氨基酸#94是异亮氨酸（I）或赖氨酸（K）；氨基酸#96是谷氨酰胺（Q）；氨基酸#97是丝氨酸（S）；氨基酸#99是甘氨酸（G）；氨基酸#103是丙氨酸（A）；氨基酸#109是天冬氨酸（D）或苏氨酸（T）；氨基酸#110是甘氨酸（G）或精氨酸（R）；氨基酸#112是丝氨酸（S）；氨基酸#114是苏氨酸（T）；氨基酸#116是苏氨酸（T）；氨基酸#118是谷氨酸（E）、丙氨酸（A）、赖氨酸（K）或丝氨酸（S）；氨基酸#121是丝氨酸（S）；氨基酸#122是苏氨酸（T）；氨基酸#123是赖氨酸（K）或丙氨酸（A）；氨基酸#128是赖氨酸（K）；氨基酸#135是谷氨酸（E）；氨基酸#136是苏氨酸（T）；氨基酸#145是精氨酸（R）；氨基酸#149是赖氨酸（K）。

表2：来自64种流感嗜血杆菌菌株的菌毛蛋白A氨基酸序列（SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121）

PilA可以是来自下述流感嗜血杆菌菌株的PilA：NTHi3219C、NTHi3224A、NTHi12、NTHi44、NTHi67、1054MEE、1729MEE、1728MEE、1885MEE、1060MEE、RdKW20、214NP、1236MEE、1714MEE、1128MEE、86-028NP、R2846、R2866、3655、PittAA、PittGG、PittII、R3021、22.4-21、3185A、3221B、3241A、038144S1、821246、840645、902550Z19、A840177、A920030、A950014、901905U、A920029、A930105、306543X4、N218、N163、N162、N120、N107、N92、N91、D219PG、D211PG、D211PD、D204CD、D198PG、D198PD、D195PD、D195CD、D189PG、D189PD、D124PG、D124PD、D124CG、D58PG、BS433、BS432、BS430、1714或1128。来自流感嗜血杆菌菌株D204CD的PilA的氨基酸序列在SEQ ID NO. 106中显示，其中在位置#116处的X是谷氨酰胺（Q）或亮氨酸（L）；关于在位置#116处的氨基酸的不明确可以通过编码氨基酸#116的第二个核苷酸的技术分辨得到澄清，明确了菌株D204CD的PilA序列。PilA可以是如SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个所示的PilA。

PilA可以是在整个长度上与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个（如表2中所示）具有至少95%、98%、99%同一性的序列。

PilA的免疫原性片段包含SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121的至少7、10、15、20、25、30或50个邻接氨基酸的免疫原性片段。免疫原性片段可以引发抗体，所述抗体可以结合片段由其衍生的全长序列。免疫原性片段可以包含SEQ ID NO. 58-SEQ ID NO:121的B和/或T细胞表位。

例如，PilA的免疫原性片段包含SEQ ID NO. 58的至少7、10、15、20、25、30或50个邻接氨基酸的免疫原性片段。在一个实施方案中，PilA的免疫原性片段包含PilA的小于150、125、100、75或60个氨基酸，在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含PilA的小于150、125、100、75或60个氨基酸。免疫原性片段可以引发抗体，所述抗体可以结合SEQ ID NO. 58。免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:58的B和/或T细胞表位。

在一个实施方案中，PilA的免疫原性片段是来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的片段，其中PilA是SEQ ID NO. 58。

在另一个实施方案中，PilA的免疫原性片段与SEQ ID NO. 127大约至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。更具体而言，在一个实施方案中，PilA的免疫原性片段是SEQ ID NO. 127，由SEQ ID NO. 58的氨基酸40-149组成的片段。

在另一个实施方案中，PilA的免疫原性片段由来自SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149组成。在另外的实施方案中，免疫原性片段与来自SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149至少95%相同。

多肽之间的同一性可以通过多种算法进行计算。例如，可以使用来自EMBOSS包（免费软件；EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite（2000）. Trends in Genetics 16（6）: 276—277）的Needle程序，以及来自GCG^?包（Accelrys Inc.）的Gap程序。该Gap程序是Needleman，S. B.和Wunsch，C. D.（1970）J. Mol. Biol. 48，443-453中所述的Needleman-Wunsch算法的实现。已使用BLOSUM62评分矩阵，并且缺口开放和延伸罚分分别为8和2。

察看计算的比对，可以观察到在两个比较序列之间的相同残基。同一性百分比可以通过下述进行计算：（1）计算同一性数目除以比对长度，乘以100（例如对于Needle程序分析），（2）计算同一性数目除以最长序列的长度，乘以100，（3）计算同一性数目除以最短序列的长度，乘以100，或（4）计算同一性数目除以比对残基数目，乘以100（如果残基在另一个之前，则比对残基）（例如对于Gap程序分析）。

在一个实施方案中，PilA能够引发识别SEQ ID NO. 58的免疫应答。

蛋白E/PilA融合蛋白

在一个实施方案中，蛋白E和PilA存在于融合蛋白中。在进一步的实施方案中，融合蛋白具有式（I）：

其中：

X是信号肽或MHHHHHH（SEQ ID NO. 2）；

m是0或1；

R₁是氨基酸；

n是0、1、2、3、4、5或6；

A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段，或者来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段；

Y选自GG、SG、SS和（G）_h，其中h是4、5、6、7、8、9或10；

o是0或1；

B是来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段，或者来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段；

Z是GGHHHHHH（SEQ ID NO: 3）；和

p是0或1。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中X选自来自下述的信号序列：CcmH（细胞色素c膜蛋白H）、DsbA（周质蛋白二硫化物异构化I）、DsbB（二硫键膜蛋白B）、FlgI（鞭毛肽聚糖环蛋白）、FocC（F1c伴侣蛋白）、MalE（麦芽糖转运蛋白亚基E）、NadA（喹啉酸合酶亚基A）、NikA（镍ABC转运蛋白组分A）、NspA（奈瑟球菌属（Neisserial）表面蛋白A）、Omp26（外膜蛋白26）、OmpA（外膜蛋白A）、OspA（外表面蛋白A）、pelB（果胶酸裂解酶B）、PhoA（细菌碱性磷酸酶）、PhtD（聚三联组氨酸蛋白D）、PhtE（聚三联组氨酸蛋白E）、SfmC（周质菌毛蛋白伴侣）、Sip1（表面免疫原性蛋白）、TolB（Tol-Pal细胞被膜复合物组分B）、TorA（三甲胺N-氧化物还原酶系统亚基A）、TorT（三甲胺N-氧化物还原酶系统周质蛋白T）和Yral（假定的周质菌毛蛋白伴侣）；或其任何亚组。在一个实施方案中，X是共翻译信号肽或翻译后信号肽。在一个实施方案中，X是来自FlgI的信号序列（flgI sp）。在另一个特定实施方案中，X是来自pelB的信号序列（pelB sp）。在另一个实施方案中，X是翻译后信号肽。在另一个实施方案中，X选自来自FlgI、NadA和pelB的信号序列。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中m是1。在另一个实施方案中，m是0。

在一个特定实施方案中，限定了R₁和n，其中（R₁）_n是富含小型通常为亲水性的氨基酸的1 - 6个氨基酸。亲水性氨基酸包括谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）和天冬酰胺（N）。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中n选自0、1、2和6。在一个特定实施方案中，限定了R₁和n，其中（R₁）_n选自D、E、ATNDDD（SEQ ID NO. 178）和MD或其任何子集。

在一个特定实施方案中，n选自1、2和6。在一个特定实施方案中，n是0。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是如由选自下述的氨基酸序列编码的蛋白E：SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56和SEQ ID NO. 57；或SEQ ID NO. 5直到SEQ ID NO. 57的任何子集。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，A是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约90% - 100%相同。在另一个实施方案中，A是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列至少95%相同。在另外的实施方案，A是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4 – SEQ ID NO. 57中任一个所示的蛋白E至少95%相同。在一个特定实施方案中，A是具有SEQ ID NO. 4中所示的氨基酸序列的蛋白E。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段。在另一个实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56和SEQ ID NO. 57；或SEQ ID NO. 4直到SEQ ID NO. 57的任何子集。在另一个实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列大约75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4大约90% - 100%相同。在另外的实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4 – SEQ ID NO. 57中任一个至少95%相同。更具体而言，在一个实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO. 124至少93%、95%、98%、99%或100%相同。在一个特定实施方案中，A是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E是SEQ ID NO. 4。

在另一个实施方案中，A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）和SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）。在另一个实施方案中，A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）、SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）、SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。在进一步的实施方案中，A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）、SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）、SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。更具体而言，在一个实施方案中，A是SEQ ID NO. 124，SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160。在另外的实施方案中，A是SEQ ID NO. 125，SEQ ID NO. 5的氨基酸20-160。在另一个实施方案中，A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是来自流感嗜血杆菌的PilA。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是具有选自下述的氨基酸序列的来自流感嗜血杆菌的PilA：SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 60、SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO. 66、SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68、SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70、SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77、SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83、SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO. 88、SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91、SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95、SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99、SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101、SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103、SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107、SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109、SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. 111、SEQ ID NO. 112、SEQ ID NO. 113、SEQ ID NO. 114、SEQ ID NO. 115、SEQ ID NO. 116、SEQ ID NO. 117、SEQ ID NO. 118、SEQ ID NO. 119、SEQ ID NO. 120和SEQ ID NO. 121；或SEQ ID NO. 58直到SEQ ID NO. 121的任何子集。在另一个实施方案中，A是PilA，其中PilA与SEQ ID NO. 58大约至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，A是PilA，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%相同。在一个特定实施方案中，A是SEQ ID NO. 58的PilA。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中A是来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段。在另一个实施方案中，A是PilA的免疫原性片段，其中PilA与SEQ ID NO. 58大约至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。例如，A是PilA的免疫原性片段，其中PilA具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 60、SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO. 66、SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68、SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70、SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77、SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83、SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO. 88、SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91、SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95、SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99、SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101、SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103、SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107、SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109、SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. 111、SEQ ID NO. 112、SEQ ID NO. 113、SEQ ID NO. 114、SEQ ID NO. 115、SEQ ID NO. 116、SEQ ID NO. 117、SEQ ID NO. 118、SEQ ID NO. 119、SEQ ID NO. 120和SEQ ID NO. 121；或SEQ ID NO. 58直到SEQ ID NO. 121的任何子集。在另外的实施方案中，A是PilA的免疫原性片段，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%相同。在一个特定实施方案中，A是来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的免疫原性片段，其中PilA是SEQ ID NO. 58。

在另一个实施方案中，A是PilA的免疫原性片段，其与SEQ ID NO. 127大约至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。更具体而言，在一个实施方案中，A是SEQ ID NO. 127，由SEQ ID NO. 58的氨基酸40-149组成的片段。

在另一个实施方案中，A是PilA的免疫原性片段，其由来自SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149组成。在另外的实施方案中，A是与来自SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149至少95%相同的免疫原性片段。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中Y选自GG、SG和SS。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中Y 为GG或SG。在一个特定实施方案中，Y是GG。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中o是1。在另一个实施方案中，o是0。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中当A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E或来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段时，B是来自流感嗜血杆菌的PilA或来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段。例如，B是来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的PilA。在另一个实施方案中，B是具有选自下述的氨基酸序列的来自流感嗜血杆菌的PilA：SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 60、SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO. 66、SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68、SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70、SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77、SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83、SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO. 88、SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91、SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95、SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99、SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101、SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103、SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107、SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109、SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. 111、SEQ ID NO. 112、SEQ ID NO. 113、SEQ ID NO. 114、SEQ ID NO. 115、SEQ ID NO. 116、SEQ ID NO. 117、SEQ ID NO. 118、SEQ ID NO. 119、SEQ ID NO. 120和SEQ ID NO. 121；或SEQ ID NO. 58直到SEQ ID NO. 121的任何子集。在另一个实施方案中，B是PilA，其中PilA与SEQ ID NO. 58大约至少75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，B是PilA，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%、98%或99%相同。在一个特定实施方案中，B是SEQ ID NO. 58的PilA。

在另一个实施方案中，B是PilA，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%、98%或99%相同，并且A是PE，其中PE与SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个至少95%、98%或99%相同。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中当A是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段时，B是来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段。例如，B是来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的PilA的免疫原性片段。在另一个实施方案中，B是PilA的免疫原性片段，其中PilA与SEQ ID NO. 58大约至少80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，B是PilA的免疫原性片段，其中PilA具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 60、SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO. 66、SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68、SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70、SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO.72、SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77、SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83、SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO. 88、SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91、SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93、SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95、SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99、SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101、SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103、SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107、SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109、SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. 111、SEQ ID NO. 112、SEQ ID NO. 113、SEQ ID NO. 114、SEQ ID NO. 115、SEQ ID NO. 116、SEQ ID NO. 117、SEQ ID NO. 118、SEQ ID NO. 119、SEQ ID NO. 120和SEQ ID NO. 121；或SEQ ID NO. 58直到SEQ ID NO. 121的任何子集。在另一个实施方案中，B是PilA的免疫原性片段，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%、98%或99%相同。在一个特定实施方案中，B是来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段，其中PilA具有SEQ ID NO. 58中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，B是PilA的免疫原性片段，其由来自SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149组成。更具体而言，在一个实施方案中，B是如SEQ ID NO. 127中所示的PilA的片段。在另外的实施方案中，B是与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个的氨基酸40-149至少95%、98%或99%相同的免疫原性片段。

在一个特定实施方案中，B是如SEQ ID NO. 127中所示的PilA的片段，并且A是选自SEQ ID NO. 122、SEQ ID NO. 124、SEQ ID NO. 125和SEQ ID NO. 126的蛋白E的免疫原性片段。更具体而言，B是如SEQ ID NO. 127中所示的PilA的片段，并且A是如SEQ ID NO. 124中所示的蛋白E的片段，来自SEQ ID NO. 4的蛋白E的氨基酸19-160。在另一个实施方案中，B是如SEQ ID NO. 127中所示的PilA的片段，并且A是如SEQ ID NO. 125中所示的蛋白E的片段。

在另一个实施方案中，B是PilA的免疫原性片段，其中PilA与SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中任一个至少95%相同，并且A是PE的免疫原性片段，其中PE与SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个至少95%相同。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中当A是来自流感嗜血杆菌的PilA时，B是来自流感嗜血杆菌的蛋白E。例如，B是具有选自下述的氨基酸序列的蛋白E：SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56和SEQ ID NO. 57；或SEQ ID NO. 4直到SEQ ID NO. 57的任何子集。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中B是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，B是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约90%、95%、98%或99%相同。例如，B是蛋白E，其中蛋白E与如SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E至少95%相同。在另一个实施方案中，B是蛋白E，其中蛋白E与SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个至少95%相同。在一个特定实施方案中，B是具有SEQ ID NO. 4中所示的氨基酸序列的蛋白E。

在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中当A是来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段时，B是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段。例如，B是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56和SEQ ID NO. 57；或SEQ ID NO. 4直到SEQ ID NO. 57的任何子集。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中B是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO. 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。在另一个实施方案中，B是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO: 4中所示的蛋白E氨基酸序列大约90% - 100%相同。在一个特定实施方案中，B是蛋白E的免疫原性片段，其具有SEQ ID NO. 4中所示的氨基酸序列。在另外的实施方案中，B是蛋白E的免疫原性片段，其中蛋白E与SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中任一个至少95%相同。

在另一个实施方案中，B是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）和SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）。在另一个实施方案中，B是来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段，其选自SEQ ID NO. 4的氨基酸17-160 （SEQ ID NO. 122）、SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160（SEQ ID NO. 123）、SEQ ID NO. 4的氨基酸19-160（SEQ ID NO. 124）、SEQ ID NO. 4的氨基酸20-160（SEQ ID NO. 125）、SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160（SEQ ID NO. 126）、SEQ ID NO. 4的氨基酸23-160（SEQ ID NO. 179）和SEQ ID NO. 4的氨基酸24-160（SEQ ID NO. 180）。更具体而言，在一个实施方案中，B是如SEQ ID NO. 123中所示的蛋白E的片段，SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160。

在一个特定实施方案中，当A是如SEQ ID NO. 127中所示的PilA的免疫原性片段时，B是如SEQ ID NO. 123中所示的蛋白E的免疫原性片段，SEQ ID NO. 4的氨基酸18-160。

在一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中p是0。在另一个实施方案中，限定了式（I）的融合蛋白，其中p是1。

在一个实施方案中，式（I）的融合蛋白选自SEQ ID NO. 136、SEQ ID NO. 138、SEQ ID NO. 140、SEQ ID NO. 142、SEQ ID NO. 144、SEQ ID NO. 146、SEQ ID NO. 148、SEQ ID NO. 150、SEQ ID NO. 182、SEQ ID NO. 184、SEQ ID NO. 186、SEQ ID NO. 188、SEQ ID NO. 190、SEQ ID NO. 192、SEQ ID NO. 194、SEQ ID NO. 196、SEQ ID NO. 198、SEQ ID NO. 200、SEQ ID NO. 202和SEQ ID NO. 204；或其任何子集。在另一个实施方案中，式（I）的融合蛋白与SEQ ID NO. 136、SEQ ID NO. 138、SEQ ID NO. 140、SEQ ID NO. 142、SEQ ID NO. 144、SEQ ID NO. 146、SEQ ID NO. 148、SEQ ID NO. 150、SEQ ID NO. 182、SEQ ID NO. 184、SEQ ID NO. 186、SEQ ID NO. 188、SEQ ID NO. 190、SEQ ID NO. 192、SEQ ID NO. 194、SEQ ID NO. 196、SEQ ID NO. 198、SEQ ID NO. 200、SEQ ID NO. 202或SEQ ID NO. 204中任一个大约85%、88%、90%、92%、95%或98%相同。

在一个实施方案中，式（I）的融合蛋白是SEQ ID NO.148的融合蛋白，其中信号肽已被去除，

。

在一个实施方案中，式（I）的融合蛋白是SEQ ID NO.194的融合蛋白，其中信号肽已去除，

。

肺炎链球菌荚膜糖缀合物

术语荚膜糖包括荚膜多糖和可来源于荚膜多糖的寡糖。寡糖含有至少4个糖残基。术语缀合物和缀合的涉及与载体蛋白共价键合的荚膜糖。

在免疫原性组合物中，糖血清型的总数目任选小于或等于23。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含小于23、22、21、20、19、18、17、16、15、14或13种肺炎链球菌糖，任选地，免疫原性组合物包含10-23个血清型、10-16个血清型、10-15个血清型、10-14个血清型、10-13个血清型或10-12个血清型。

在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖缀合物来源于下述血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尽管应当理解取决于接受疫苗的接受者的年龄和在其中将施用免疫原性组合物的地理位置，可以置换一个或两个其他血清型。例如，7价免疫原性组合物可以包含来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖。10价免疫原性组合物可以进一步包含来源于血清型1、5和7F的糖。12价免疫原性组合物可以进一步包含来源于血清型6A、19A的糖。15价免疫原性组合物可以进一步包含来源于血清型22F和33F的糖。

进一步的糖抗原例如23价（例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F）也由本发明考虑。

术语“载体蛋白”意欲涵盖小肽和大多肽（>10 kDa）两者。载体蛋白可以是任何肽或蛋白。它可以包含一个或多个T辅助表位。载体蛋白可以是破伤风类毒素（TT）、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素的无毒突变体[注：为了本发明的目的，所有此类TT变体均视为相同类型的载体蛋白]、包含破伤风毒素T细胞表位例如N19的多肽（WO2006/067632）、白喉类毒素（DT）、CRM197（交叉反应物质197）、白喉毒素的其他无毒突变体[例如CRM176、CRM 197、CRM228、CRM 45（Uchida等人J. Biol. Chem. 218；3838-3844，1973）；CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107（其中CRM代表交叉反应物质）及其他由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed: Frankel，Maecel Dekker Inc，1992中描述的突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变及其他公开于US 4709017或US 4950740中的突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变及其他公开于US 5917017或US 6455673中的突变；或公开于US 5843711中的片段]（注：为了本发明的目的，所有此类DT变体均视为相同类型的载体蛋白）、肺炎球菌肺炎球菌溶血素（Kuo等人（1995）Infect Immun 63；2706-13）、OMPC（来自脑膜炎球菌的外膜蛋白C，通常取自脑膜炎奈瑟氏球菌（N. meningitidis）血清群B – EP0372501）、合成肽（EP0378881、EP0427347）、热休克蛋白（WO 93/17712、WO 94/03208）、百日咳蛋白（WO 98/58668、EP0471177）、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素（WO 91/01146）、包含来自多种病原体衍生抗原的多重人CD4+ T细胞表位的人工蛋白（Falugi等人（2001）Eur J Immunol 31；3816-3824），例如N19蛋白（Baraldoi等人（2004）Infect Immun 72；4884-7）、肺炎球菌表面蛋白PspA（WO 02/091998）、铁摄取蛋白（WO 01/72337）、艰难梭菌（Clostridium difficile）的毒素A或毒素B（WO 00/61761）、流感嗜血杆菌（H. influenzae）蛋白D（EP594610和WO 00/56360）、肺炎球菌PhtA（WO 98/18930，也称为Sp36）、肺炎球菌PhtD（公开于WO 00/37105中的聚三联组氨酸D，并且也称为Sp036D）、肺炎球菌PhtB（公开于WO 00/37105中的聚三联组氨酸B，并且也称为Sp036B）、或PhtE（公开于WO00/30299中的聚三联组氨酸E，并且也称为BVH-3）。

在一个实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖缀合物缀合至独立地选自下述的载体蛋白：破伤风类毒素（TT）、TT的片段C、白喉类毒素、CRM197（交叉反应物质197）、脱毒的肺炎球菌溶血素、蛋白D（来自流感嗜血杆菌）、PhtD、PhtDE（含有具有聚三联组氨酸蛋白D和聚三联组氨酸蛋白E的蛋白）和N19。在进一步的实施方案中，肺炎链球菌荚膜糖缀合物均独立地缀合至CRM197。

在该上下文中，术语‘缀合至’意指该蛋白与糖共价键合；在这种情况下，该蛋白充当载体蛋白。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种缀合至蛋白D的肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，缀合的肺炎链球菌糖中的少数缀合至蛋白D，其中术语‘少数(minority)’指待缀合至蛋白D的组合物中的糖总数的小于一半。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含1-20、1-18、1-16、1-14、1-12、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-4或1-2种缀合至蛋白D的肺炎链球菌荚膜糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种缀合至白喉类毒素的肺炎链球菌荚膜糖。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至白喉类毒素的19F。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种缀合至破伤风类毒素的肺炎链球菌荚膜糖。在进一步的实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至破伤风类毒素的18C。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至蛋白D或CRM197的缀合的血清型1糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至蛋白D或CRM197的缀合的血清型4糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型5糖，其中所述血清型5糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型6B糖，其中所述血清型6B糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型7F糖，其中所述血清型7F糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型9V糖，其中所述血清型9V糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型14糖，其中所述血清型14糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的血清型18C糖，其中所述血清型18C糖缀合至破伤风类毒素或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的19F糖，其中所述血清型19F糖缀合至白喉类毒素或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合的23F糖，其中所述血清型23F糖缀合至蛋白D或CRM197。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至CRM197的缀合的6A糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至CRM197的缀合的19A糖。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型1糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型4糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型5糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型6B糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型7F  糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型9V糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型14糖、缀合至蛋白D的肺炎链球菌血清型23F糖、缀合至破伤风类毒素的肺炎链球菌血清型18C糖和缀合至白喉类毒素的肺炎链球菌19F糖。在一个实施方案中，免疫原性组合物进一步包含缀合至CRM197的肺炎链球菌血清型6A和缀合至CRM197的肺炎链球菌血清型19A。

任选地，载体蛋白与肺炎链球菌糖的比为1:5 - 5:1；1:2 - 2.5:1；1:1 - 2:1（w/w）。在一个实施方案中，缀合物中的大多数，例如缀合物中的6、7、8、9种或更多种具有大于1:1，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1或1.6:1的载体蛋白与糖的比。

一般而言，本发明的免疫原性组合物可以包含0.1 - 20μg、1 - 5μg、1 - 10μg或1 - 3μg糖的每种糖缀合物的剂量。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有以0.1-20μg；0.5-10μg；0,5- 5μg 或1-3μg糖剂量的每种肺炎链球菌荚膜糖缀合物。在一个实施方案中，荚膜糖可以以不同剂量存在，例如一些荚膜糖可以以确切地1μg的剂量存在，或一些荚膜糖可以以确切地3μg的剂量存在。在一个实施方案中，来自血清型3、18C和19F（或4、18C和19F）的糖以高于其他糖的剂量存在。在该实施方案的一个方面，血清型3、18C和19F（或4、18C和19F）以约或确切地3μg的剂量存在，而免疫原性组合物中的其他糖以约或确切地1μg的剂量存在。在一个实施方案中，血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F以约或确切地1μg的剂量存在。

在本说明书自始至终，术语“糖”可以指示多糖或寡糖并且包括两者。多糖分离自细菌，并且可以通过已知方法（参见例如EP497524和EP497525）且任选通过微流化，将尺寸设定为一定程度。多糖可以具有一定的尺寸，以便降低多糖样品中的粘度和/或改善缀合产物的可过滤性。寡糖具有低数目的重复单位（通常为5-30个重复单位），并且通常为水解的多糖。

肺炎链球菌的荚膜多糖包含可以含有最高达8个糖残基的重复寡糖单位。关于关键肺炎链球菌血清型的寡糖单位的综述，参见JONES，Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Ciênc.，June 2005，第77卷，no.2，第293-324页。ISSN 0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可以是全长多糖，然而，在其他实施方案中，它可以是一个寡糖单位，或短于重复寡糖单位的天然长度糖链。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖均为多糖。全长多糖可以“具有一定大小”，即它们的大小可以通过多种方法降低，所述方法例如酸水解处理、过氧化氢处理、通过emulsiflex?筛分随后为过氧化氢处理以生成寡糖片段或微流化。

在一个实施方案中，免疫原性组合物进一步包含不同于缀合那些的未缀合的肺炎链球菌的糖血清型，使得缀合和未缀合的糖血清型的数目小于或等于23。

缀合

使用任何缀合技术，可以将本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物缀合至载体蛋白。

在一个实施方案中，肺炎链球菌糖经由接头例如双功能接头缀合至载体蛋白。接头任选是异双功能的或同双功能的，具有例如反应性氨基和反应性羧酸基团、两个反应性氨基或两个反应性羧酸基团。接头具有例如4 - 20、4 - 12、5 - 10个碳原子。可能的接头是己二酸二酰肼（ADH）。其他接头包括B-丙酰胺基(propionamido)（WO 00/10599）、硝基苯基-乙胺（Gever等人（1979）Med. Microbiol. Immunol. 165；171-288）、卤代烷基卤化物（US4057685）、糖苷键（US4673574、US4808700）、己二胺和6-氨基己酸（US4459286）。在一个实施方案中，ADH用作接头用于缀合来自血清型18C的糖。

本发明的免疫原性组合物中存在的糖缀合物可以通过任何已知的偶联技术进行制备。缀合方法可以依赖糖由1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐（CDAP）的活化，以形成氰酸酯。活化的糖因此可以与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔物（接头）基团偶联。例如，间隔物可以是胱胺或半胱胺，以获得硫醇化多糖，其可以经由硫醚键偶联至载体，所述硫醚键在与马来酰亚胺活化的载体蛋白（例如使用GMBS）或卤代乙酰化载体蛋白（例如使用碘乙酰胺[例如乙基碘乙酰胺HCl]或N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯或SIAB或SIA或SBAP）反应后获得。任选地，氰酸酯（任选通过CDAP化学作用制备）由己二胺或ADH偶联，并且经由在蛋白载体上的羧基，使用碳二亚胺（例如EDAC或EDC）化学作用，使氨基衍生的糖缀合至载体蛋白。此类缀合物在PCT公开申请WO 93/15760 Uniformed Services University以及WO 95/08348和WO 96/29094中描述。

其他合适的技术使用碳二亚胺、carbiinides、酰肼、活性酯、降冰片烷（norborane）、对-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。许多在WO 98/42721中描述。缀合可以涉及羰基接头，其可以通过糖的游离羟基与CDI的反应形成（Bethell等人J. Biol. Chem. 1979，254；2572-4，Hearn等人J. Chromatogr. 1981. 218；509-18），随后为与蛋白的反应，以形成氨基甲酸酯连接。这可以涉及异头末端还原至伯羟基，伯羟基与CDI的伯羟基反应的任选保护/脱保护，以形成CDI氨基甲酸酯中间产物，并且使CDI氨基甲酸酯中间产物与蛋白上的氨基偶联。

缀合物还可以通过直接还原胺化方法进行制备，如US 4365170（Jennings）和US 4673574（Anderson）中描述的。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。

进一步方法涉及通过碳二亚胺缩合（Chu C.等人Infect. Immunity，1983 245 256），例如使用EDAC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），由己二酸二酰肼（ADH）衍生的溴化氰（或CDAP）活化的糖与蛋白载体的偶联。

在一个实施方案中，在糖上的羟基（任选活化羟基例如活化为制备氰酸酯的羟基[例如使用CDAP]）直接或间接（通过接头）连接至蛋白上的氨基或羧基。当存在接头时，例如通过使用CDAP缀合，糖上的羟基任选连接至接头上的氨基。例如通过使用碳二亚胺化学作用，例如通过使用EDAC，接头例如ADH中的进一步氨基可以缀合至蛋白上的羧酸基团。在一个实施方案中，在接头缀合至载体蛋白之前，一种或多种肺炎球菌荚膜糖首先缀合至接头。可替代地，接头可以在缀合至糖之前缀合至载体。

还可以使用技术的组合，其中一些糖-蛋白缀合物通过CDAP制备，并且一些通过还原胺化制备。

一般而言，在蛋白载体上的下述类型的化学基团可以用于偶联/缀合：

A）羧基（例如经由天冬氨酸或谷氨酸）。在一个实施方案中，该基团直接连接至糖上的氨基或用碳二亚胺化学作用例如EDAC连接至接头上的氨基。

B）氨基（例如经由赖氨酸）。在一个实施方案中，该基团直接连接至糖上的羧基或用碳二亚胺化学作用例如EDAC连接至接头上的羧基。在另一个实施方案中，该基团直接连接至糖上由CDAP或CNBr活化的羟基或者连接至接头上的此类基团；连接至具有醛基的糖或接头；连接至具有琥珀酰亚胺酯基团的糖或接头。

C）巯基（例如经由半胱氨酸）。在一个实施方案中，该基团连接至溴或氯乙酰化的糖或者具有马来酰亚胺化学作用的接头。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

D）羟基（例如经由酪氨酸）。在一个实施方案中，该基团由用双重氮联苯胺活化/修饰。

E）咪唑基（例如经由组氨酸）。在一个实施方案中，该基团由双重氮联苯胺活化/修饰。

F）胍基（例如经由精氨酸）。

G）吲哚基（例如经由色氨酸）。

在糖上，一般地，下述基团能够用于偶联：OH、COOH或NH2。醛基能够在本领域已知的不同处理后生成，所述处理例如：高碘酸盐、酸水解、过氧化氢等。

直接偶联方法：

糖-OH  + CNBr或CDAP  -----> 氰酸酯  + NH2-Prot   ----> 缀合物

糖-醛 + NH2-Prot ----> 希夫碱+ NaCNBH3 ----> 缀合物

糖-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> 缀合物

糖-NH2  + COOH-Prot + EDAC ----> 缀合物

经由间隔物（接头）的间接偶联方法：

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯  + NH2----NH2 ----> 糖----NH2 + COOH-Prot  + EDAC  -----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP ---->氰酸酯  + NH2-----SH -----> 糖----SH   + SH-Prot（具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得）-----> 糖-S-S-Prot

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯  + NH2----SH -------> 糖----SH + 马来酰亚胺-Prot（氨基的修饰）----> 缀合物

糖-OH + CNBr或CDAP --->氰酸酯  + NH2-----SH ---> 糖-SH + 卤代乙酰化-Prot ----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> 糖------NH2 + EDAC +  COOH-Prot ----> 缀合物

糖-COOH + EDAC+ NH2----SH    -----> 糖----SH  + SH-Prot（具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或通过例如SPDP修饰蛋白的氨基后获得）-----> 糖-S-S-Prot

糖-COOH + EDAC+ NH2----SH    -----> 糖----SH +马来酰亚胺-Prot（氨基的修饰）----> 缀合物

糖-COOH + EDAC + NH2----SH ---> 糖-SH +卤代乙酰化-Prot ----> 缀合物

糖-醛 + NH2-----NH2 ----> 糖---NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> 缀合物

注：除上述EDAC之外，还可以使用任何合适的碳二亚胺。

总之，一般可以用于与糖偶联的蛋白载体化学基团的类型是氨基（例如在赖氨酸残基上）、COOH基团（例如在天冬氨酸和谷氨酸残基上）和SH基团（如果可接近的话）（例如在半胱氨酸残基上）。

在一个实施方案中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种肺炎链球菌糖通过还原胺化缀合至载体蛋白。在一个实施方案中，小于23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种肺炎链球菌糖通过还原胺化缀合至载体蛋白。在一个实施方案中，1 - 23、2 - 22、3 - 21、4 - 20、5 - 19、6 - 18、7 - 17、8 - 16、9 - 15、10 - 14、11 - 13、1 - 23、- 22、1 - 21、1 - 20、1 - 19、1 - 18、1 - 17、1 - 16、1 - 15、1 - 14、1 - 13、1 - 12、1 - 11、1 - 10、1 - 9、1 - 8、1 - 7、1 - 6、1 - 5、1 - 4、1 - 3、或者1或2种肺炎链球菌糖通过还原胺化缀合至载体蛋白。在进一步的实施方案中，所有肺炎链球菌荚膜糖通过还原胺化缀合至载体蛋白。

在一个实施方案中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种肺炎链球菌糖通过CDAP化学作用缀合至载体蛋白。在一个实施方案中，小于23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种肺炎链球菌糖通过CDAP化学作用缀合至载体蛋白。在一个实施方案中，1 - 23、2 - 22、3 - 21、4 - 20、5 - 19、6 - 18、7 - 17、8 - 16、9 - 15、10 - 14、11 - 13、1 - 23、- 22、1 - 21、10 - 23、10 - 22、10 - 21、10 - 20、10 - 19、10 - 18、10 - 17、10 - 16、10 - 15、10 - 14、10 - 13、10 - 12、10 - 11、1 - 20、1 - 19、1 - 18、1 - 17、1 - 16、1 - 15、1 - 14、1 - 13、1 - 12、1 - 11、1 - 10、1 - 9、1 - 8、1 - 7、1 - 6、1 - 5、1 - 4、1 - 3、或者1或2种肺炎链球菌糖通过CDAP化学作用缀合至载体蛋白。在进一步的实施方案中，所有肺炎链球菌荚膜糖通过CDAP化学作用缀合至载体蛋白。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过还原胺化缀合至载体蛋白的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22种糖，并且包含通过除还原胺化外的化学作用例如CDAP化学作用缀合至载体蛋白的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22种糖。

在一个实施方案中，来自选自血清型1、3、19A和19F的至少一种血清型的荚膜糖通过除还原胺化外的化学作用缀合，并且选自血清型4、5、6A、6B、6C、7F、9V、14、18C和23F的至少一种血清型通过还原胺化缀合。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过除还原胺化外的化学作用缀合至蛋白载体的来自下述血清型的一种或多种肺炎链球菌荚膜糖：1或3或19A或19F；1和3；1和19A；1和19F；3和19A；3和19F；19A和19F；1、3和19A；1、3和19F，1、19A和19F；3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过除还原胺化外的化学作用缀合至载体蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含通过氰化化学作用例如CDAP化学作用缀合至蛋白载体的来自下述血清型的肺炎链球菌荚膜糖：1或3或19A或19F；1和3；1和19A；1和19F；3和19A；3和19F；19A和19F；1、3和19A；1、3和19F，1、19A和19F；3、19A和19F或1、3、19A和19F。在一个实施方案中，19F通过CDAP化学作用缀合至载体蛋白。在本发明的一个实施方案中，下述一种或多种肺炎链球菌荚膜糖通过还原胺化缀合至载体蛋白；血清型4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C或23F、4和5、4和6A、4和6B、4和7F、4和9V、4和14、4和18C、4和23F、 5和6A、5和6B、5和7F、5和9V、5和14、5和18C、5和23F、6A和6B、6A和7F、6A和9V、6A和14、6A和18C、6A和23F、6B和7F、6B和9V、6B和14、6B和18C、6B和23F、7F和9V、7F和14、7F和18C、7F和23F、9V和14、9V和18C、9V和23F、14和18C、14和23F或18C和23F。在一个实施方案中，血清型23F通过还原胺化化学作用缀合至载体蛋白。

未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白

本发明的免疫原性组合物可以包含至少一种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白。在一个实施方案中，至少一种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白选自聚三联组氨酸家族（PhtX）、脱毒肺炎球菌溶血素（dPly）、胆碱结合蛋白家族（CbpX）、CbpX截短物、LytX（自溶酶）家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、PcpA（肺炎球菌胆碱结合蛋白A）、PspA（肺炎球菌表面蛋白A）、PsaA（肺炎球菌表面粘附蛋白A）、Sp128、Sp101（肺炎链球菌101）、Sp130（肺炎链球菌130）、SP125（肺炎链球菌125）和SP133（肺炎链球菌133）。

Pht（聚三联组氨酸）家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。应当指出Pht家族可以被称为聚三联组氨酸家族或肺炎球菌三联组氨酸家族，因此术语‘聚三联组氨酸’和‘肺炎球菌三联组氨酸’可以视为可互换的。该家族的特征在于脂质化序列；由富含脯氨酸区和几个三联组氨酸分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶促活性；（3-5）个卷曲螺旋区；保守的N末端和异源的C末端。它存在于已测试的所有肺炎链球菌菌株中。同源蛋白也已在其他链球菌和奈瑟氏球菌属（Neisseria）中发现。在本发明的一个实施方案中，本发明的Pht蛋白为PhtD。然而，应当理解术语PhtA、PhtB、PhtD和PhtE指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然存在的（和人工制备的）变体，所述变体与参考蛋白具有至少90%相同的序列同源性。任选地，它是至少95%相同或至少97%相同。

对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公开，并且也称为Sp36。如上所述，它是来自Pht家族的蛋白，并且具有LXXC的II型信号基序。PhtD在WO 00/37105中公开，并且也称为Sp036D。如上所述，它也是来自Pht家族的蛋白，并且具有II型LXXC信号基序。在一个实施方案中，术语‘PhtD’指SEQ ID NO:220。PhtB在WO 00/37105中公开，并且也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是如WO 00/17370中公开的C3-降解多肽。该蛋白也来自Pht家族，并且具有II型LXXC信号基序。例如，免疫功能等价物为在WO 98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物（约79 kD）在WO 99/15675中公开，其也被认为是Pht家族的成员。PhtE在WO 00/39299中公开，并且被称为BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意指可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提及PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提及PhtD或PhtB不排除分别如例如WO0198334中可见的PhtDE（包含PhtD和PhtE的融合蛋白）或PhtBE（包含PhtB和PhtE的融合蛋白）。

在一个实施方案中，至少一种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白包含来自聚三联组氨酸家族的至少一种蛋白（例如蛋白可以选自PhtD 、PhtBD和PhtDE融合蛋白）。在进一步的实施方案中，至少一种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白是PhtD蛋白。在进一步的实施方案中，PhtD蛋白包含氨基酸序列，其与WO00/37105的序列ID No.4的氨基酸21-838处的序列至少85%、90%、95%、98%、 99%或100%相同。

在一个实施方案中，至少一种未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白是脱毒肺炎球菌溶血素（dPly）。在一个实施方案中，肺炎球菌溶血素已进行化学脱毒。在进一步的实施方案中，肺炎球菌溶血素已进行化学脱毒。在再进一步的实施方案中，肺炎球菌溶血素已进行化学脱毒和遗传脱毒两者。

在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含脱毒肺炎球菌溶血素（dPly）和PhtD。在进一步的实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含未缀合的脱毒肺炎球菌溶血素（dPly）和未缀合的PhtD。

关于胆碱结合蛋白家族（CbpX），该家族的成员最初被鉴定为能用胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。胆碱结合蛋白非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。虽然蛋白的确切性质（氨基酸序列、长度等）可以不同，但在整个家族它们具有数个在结构上共同的区域。一般而言，胆碱结合蛋白包含N末端区（N）、保守重复区（R1和/或R2）、富含脯氨酸区（P）和保守的胆碱结合区（C），该胆碱结合区由多个重复序列组成，约占该蛋白的一半。如本申请中使用的，术语“胆碱结合蛋白家族（CbpX）”包括来自下述的蛋白：如WO97/41151中所鉴定的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开于WO97/41151。CbpD和CbpG公开于WO00/29434。PspC公开于WO97/09994。PbcA公开于WO98/21337。SpsA为WO 98/39450中公开的胆碱结合蛋白。任选地，该胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。

本发明的一个实施方案包含CbpX截短物，其中“CbpX”在上文定义，并且“截短物”指缺乏50%或更多的胆碱结合区（C）的CbpX蛋白。任选地，此类蛋白缺乏整个胆碱结合区。任选地，此类蛋白截短物缺乏（i）胆碱结合区和（ii）该蛋白的N末端一半的一部分，但至少保留一个重复区（R1或R2）。任选地，该截短物保留2个重复区（R1和R2）。此类实施方案的实例是如WO99/51266或WO99/51188中举例说明的NR1xR2和R1xR2，但是，其他缺乏相似的胆碱结合区的胆碱结合蛋白也考虑在本发明的范围内。

LytX家族是与细胞裂解有关的膜结合蛋白。N末端结构域包含胆碱结合结构域。然而，LytX家族并不具有在上述CbpX家族中发现的所有特征。对于本发明而言，LytX家族被认为不同于CbpX家族。与CbpX家族相比，LytX家族C末端结构域含有LytX蛋白的催化结构域。该家族包含LytA、LytB和LytC。对于LytX家族而言，LytA公开于Ronda等，Eur J Biochem，164:621-624（1987）。LytB公开于WO 98/18930，并且也被称为Sp46。LytC也公开于WO 98/18930，并且也被称为Sp91。本发明的实施方案包含LytC。

另一个实施方案包含LytX截短物，其中“LytX”在上文定义，并且“截短物”指缺乏50%或更多胆碱结合区的LytX蛋白。任选地，此类蛋白缺乏整个胆碱结合区。本发明的又一个实施方案包含CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白或融合蛋白。任选地，融合蛋白包含CbpX的NR1xR2（或R1xR2）和LytX的C末端部分（Cterm，即，该蛋白不含胆碱结合结构域）（例如LytCCterm或Sp91Cterm）。任选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。任选地，其为CbpA。任选地，Lytx为LytC（也被称为Sp91）。本发明的另一个实施方案为PspA或PsaA截短物，其缺乏胆碱结合结构域（C），并且与LytX一起表达为融合蛋白。任选地，LytX为LytC。

PsaA和PspA这二者在本领域都已被讨论。例如，Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64（12）:5255-62已描述了PsaA及其跨膜缺失变体。例如US5804193、WO 92/14488和WO 99/53940已描述了PspA及其跨膜缺失变体。

对于PcpA而言，该蛋白已在本领域中得到描述，例如PcpA已在WO2011/075823中得到描述。术语‘PcpA’指包含与来自WO2011/075823的SEQ ID NO:2或7至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%相同的蛋白，或者来自WO2011/075823的SEQ ID NO:2或7的至少100、150、200、25个或更多个邻接氨基酸的片段。

Sp128和Sp130公开于WO00/76540。Sp125是带有细胞壁锚定基序LPXTG（其中X为任何氨基酸）的肺炎球菌表面蛋白的实例。具有此基序的这类肺炎球菌表面蛋白内的蛋白在本发明的背景下已被发现是有用的，因此将其视为本发明的另一种蛋白。Sp125本身公开于WO 98/18930，并且也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO 98/06734（在其中它具有参考# y85993）。它的特征在于I型信号序列。Sp133公开于WO 98/06734（在其中它具有参考# y85992）。它的特征也在于I型信号序列。

任何这些进一步的肺炎链球菌蛋白均可以未缀合或缀合的形式存在。一种或多种肺炎链球菌蛋白任选缀合至肺炎链球菌糖（在上文名称为肺炎链球菌荚膜糖缀合物的部分中描述）。任选地，一种或多种肺炎链球菌蛋白缀合至来自不同细菌的糖。

在该上下文中，术语‘缀合至’意指该蛋白与糖共价键合，在这种情况下，该蛋白充当载体蛋白。

在一个实施方案中，至少一种进一步的未缀合或缀合的肺炎链球菌蛋白包含选自PhtB、PhtE、PhtA、PhtBD和PhtDE的聚组氨酸家族（PhtX）蛋白。

佐剂

在一个实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。

合适的佐剂包括但不限于铝盐（例如，磷酸铝或氢氧化铝），单磷酰脂质A（例如3D-MPL），皂苷（例如QS21），水包油乳剂，来自革兰氏阴性细菌菌株的泡(blebs)或外膜囊泡制剂（例如由WO02/09746教导的那些），脂质A或其衍生物，烷基糖苷磷酸酯或者这些佐剂中的两种或更多种的组合。在一个实施方案中，佐剂是磷酸铝。在进一步的实施方案中，佐剂包含作为磷酸铝的100-750、150-600、 200-500、250-450、 300-400或约350μg铝/人剂量。

疫苗

本发明提供了包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。本文涉及本发明的“免疫原性组合物”的实施方案还可应用于涉及本发明的“疫苗”的实施方案，并且反之亦然。在一个实施方案中，疫苗包含本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的赋形剂。

本发明的疫苗可以通过任何合适的递送途径进行施用，所述递送途径例如皮内、粘膜例如鼻内、口服、肌内或皮下。其他递送途径是本领域众所周知的。疫苗制剂一般在Vaccine Design（“The subunit and adjuvant approach”（编辑Powell M.F. & Newman M.J.）（1995）Plenum Press New York）中描述。

在一个方面，本发明的免疫原性组合物通过肌内递送途径进行施用。肌内施用可以是对于大腿或上臂。注射通常经由针（例如皮下注射针），但可替代地可以使用无针注射。典型肌内剂量为0.5 ml。

本发明的进一步方面是制备本发明的疫苗的方法，其包括将未缀合的肺炎链球菌蛋白与佐剂组合物混合的步骤。

在本发明的一个方面，提供了针对由肺炎链球菌感染引起的疾病免疫主体的方法，其包括给主体施用治疗有效剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在本发明的进一步方面，提供了针对由流感嗜血杆菌感染引起的疾病免疫主体的方法，其包括给主体施用治疗有效剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在进一步的实施方案中，提供了针对由肺炎链球菌和流感嗜血杆菌感染引起的疾病免疫主体的方法，其包括给主体施用治疗有效剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在一个实施方案中，疾病包括选自下述的至少一种疾病：肺炎、侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）的加重、中耳炎、脑膜炎、菌血症和结膜炎。在一个实施方案中，主体是哺乳动物主体。在进一步的实施方案中，哺乳动物主体选自小鼠、豚鼠和人。在一个实施方案中，主体是成年人，任选老年人。在进一步的实施方案中，主体是婴儿。

在本发明的进一步方面，提供了用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在本发明的进一步方面，提供了用于治疗或预防由流感嗜血杆菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在进一步的实施方案中，提供了用于治疗或预防由肺炎链球菌和流感嗜血杆菌感染引起的疾病的本发明的免疫原性组合物或疫苗。在一个实施方案中，该使用包括给成年人宿主任选老年人宿主施用免疫原性组合物。在进一步的实施方案中，该使用包括给婴儿宿主施用免疫原性组合物。在进一步的实施方案中，疾病包括选自下述的至少一种疾病：肺炎、侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）的加重、中耳炎、脑膜炎、菌血症和结膜炎。

在本发明的进一步方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗在制造用于治疗或预防由肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。在本发明的进一步方面，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗在制造用于治疗或预防由流感嗜血杆菌感染引起的疾病的药物中的用途。在进一步的实施方案中，提供了本发明的免疫原性组合物或疫苗在制造用于治疗或预防由流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，疾病包括选自下述的至少一种疾病：肺炎、侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）的加重、中耳炎、脑膜炎、菌血症和结膜炎。

在一个实施方案中，该使用包括给选自下述的宿主施用本发明的免疫原性组合物或疫苗：成年人宿主、老年人宿主和婴儿宿主。

式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物用作主体例如哺乳动物特别是人中的免疫原。特别地，式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物用于在主体特别是人中诱导针对流感嗜血杆菌的免疫应答。另外，式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物用于在主体特别是人中诱导针对肺炎链球菌的免疫应答。更具体而言，式（I）的融合蛋白用于治疗或预防中耳炎和/或AECOPD和/或肺炎。

在一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防有此需要的主体中的中耳炎的方法，其包括给所述主体施用治疗有效量的如本文描述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有此需要的主体中的慢性阻塞性肺疾病的急性加重（AECOPD）的方法，其包括给所述主体施用治疗有效量的如本文描述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有此需要的主体中的肺炎的方法，其包括给所述主体施用治疗有效量的如本文描述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有此需要的主体中的流感嗜血杆菌感染或疾病的方法，所述方法包括给所述主体施用治疗有效量的如本文描述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防有此需要的主体中的肺炎链球菌感染或疾病的方法，所述方法包括给所述主体施用治疗有效量的如本文描述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含式（I）的融合蛋白和肺炎链球菌荚膜糖缀合物。

进一步的定义

除非本文另有说明或定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。例如，分子生物学中的常见术语的定义可以在下述中找到：Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press，1994（ISBN 0-19-854287-9）出版；Kendrew等人（编辑），The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.，1994（ISBN 0-632-02182-9）出版；以及Robert A. Meyers（编辑），Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.，1995（ISBN 1-56081-569-8）出版。

除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考。类似地，除非上下文另有明确说明，否则单词“或”意欲包括“和”。应进一步理解对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、以及所有分子量或分子质量值是近似值，并且为了描述而提供。另外，就物质例如抗原的浓度或水平而言给出的数字限制可以是近似的。因此，当浓度指示为（例如）大约200 pg时，预期该浓度包括略微多于或略微少于（“或”或“~”）200 pg的值。

尽管与本文描述的那些相似或等价的方法和材料可以用于本公开内容的实践或测试中，但下文描述了合适方法和材料。

术语“包含”意指“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则单词“包含（comprises）”及其变化例如“包含（comprise）”和“包含（comprising）”应理解为暗示包括所述化合物或组合物（例如核酸、多肽、抗原）或步骤，或者化合物或步骤的组，但不排除任何其他化合物、组合物、步骤或其组。缩写“例如（e.g.）”来源于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如”与术语“例如（for example）”同义。

如本文使用的“主体”是哺乳动物，包括人、非人灵长类动物、以及非灵长类哺乳动物例如啮齿动物属的成员（包括但不限于小鼠和大鼠）和兔形目的成员（包括但不限于兔）。

如本文使用的，“佐剂”意指化合物或物质，当与疫苗、免疫治疗剂、或者其他含抗原或免疫原的组合物结合施用于主体时，所述化合物或物质增加或增强主体对所施用抗原或免疫原的免疫应答（与在不存在佐剂的情况下获得的免疫应答相比较）。这区别于“佐剂疗法”，其由美国国立卫生研究院国家癌症研究所（National Cancer Institute of the United States Institutes of Health）在癌症治疗的背景下定义为在初步治疗后给予的另外治疗，以降低癌症复发的危险。

保守取代是众所周知的，并且一般设置为序列比对计算机程序中的缺省评分矩阵。这些程序包括PAM250（Dayhoft M.O.等人，（1978），“A model of evolutionary changes in proteins”， In “Atlas of Protein sequence and structure” 5（3）M.O. Dayhoft（编辑），345-352），National Biomedical Research Foundation，Washington，and Blosum 62（Steven Henikoft和Jorja G. Henikoft（1992），“Amino acid substitution matrices from protein blocks”），Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（Biochemistry）: 10915-10919。本发明进一步提供了含有保守性氨基酸取代的式（I）的融合蛋白。例如，式（I）的融合蛋白可以含有来自流感嗜血杆菌的PE或PilA的任何氨基酸的保守取代，如本文所示的任何序列中所述（例如SEQ ID NO. 4 – SEQ ID NO. 57中所示的任何PE序列和/或SEQ ID NO. 58 – SEQ ID NO. 121中所示的任何PilA序列）。

如本文使用的，“信号肽”指存在于前体蛋白上（通常在N末端处），并且通常不存在于成熟蛋白中的短（小于60个氨基酸，例如3 - 60个氨基酸）多肽。信号肽（sp）通常富含疏水性氨基酸。信号肽指导所翻译的蛋白通过膜的转运和/或分泌。信号肽还可以被称为靶向信号、转运肽、定位信号或信号序列。例如，信号序列可以是共翻译或翻译后信号肽。

在蛋白转运或分泌过程中或者蛋白转运或分泌后，异源信号肽可以通过信号肽肽酶从融合蛋白构建体中切割。例如，信号肽肽酶是信号肽肽酶I。“异源”信号肽是不与蛋白结合的信号肽，如它在自然界中存在的。

如本文使用的，“治疗”意指预防主体中的状况或疾病症状的发生，预防主体中的状况或疾病症状的复发，延迟主体中的状况或疾病症状的复发，减少主体中的状况或疾病症状的严重性或频率，减慢或消除状况进展和主体中的疾病或状况症状的部分或完全消除。

如本文使用的，“任选地”意指随后描述的一种或多种事件可能发生或不发生，并且包括发生的一种或多种事件和不发生的事件两者。

在本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请都通过引用并入本文。

如本文使用的，‘婴儿’指0-2岁的人。

如本文使用的，‘成人’指超过18岁的人。

如本文使用的，‘老年人’指超过60岁，任选超过65岁的人。

实施例

在实施例中，下述术语具有指定的含义：

6xhis = 六个组氨酸；

xg = 离心力（重力数）

ATP = 三磷酸腺苷；

BCA =二辛可宁酸；

BSA = 牛血清白蛋白；

℃ = 摄氏度；

CaCl₂ = 氯化钙；

CV = 柱体积；

DNA = 脱氧核糖核酸；

DSC =差示扫描量热法；

DTT = 二硫苏糖醇；

dNTP = 脱氧核苷三磷酸；

EDTA = 乙二胺四乙酸；

FT = 流通物；

HCl = 氯化氢；

His = his = 组氨酸；

HEPES = 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸；

IMAC = 固定化金属亲和层析；

IPTG = 异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷；

KCl = 氯化钾；

K₂HPO₄ = 磷酸氢二钾；

KH₂PO₄ = 磷酸二氢钾；

LDS = 十二烷基硫酸锂；

L = 升；

MES = 2-（N-吗啉代）乙磺酸；

MgCl₂ = 氯化镁；

ml = 毫升；

RPM = 每分钟转数；

min = 分钟；

mM = 毫摩尔；

μL = 微升；

NaCl = 氯化钠；

Na₂HPO₄ = 磷酸氢二钠；

NaH₂PO₄ = 磷酸二氢钠；

ng = 纳克；

nm = 纳米；

O/N = 过夜；

PBS = 磷酸盐缓冲盐水；

PCR = 聚合酶链反应；

SB = 样品缓冲液；

sec = 秒；

w/v = 重量/体积

PS=多糖，并且可以与术语‘糖’互换使用。

1. 实施例

实施例1：融合蛋白

用不同的信号肽和氨基酸接头序列产生融合蛋白。这些融合蛋白允许蛋白E和PilA（或其片段）的分泌，而不局限于单一细菌菌株。在通过信号肽肽酶去除异源信号肽之后，融合蛋白释放到周质内。由细菌纯化的融合蛋白不含异源信号肽。“纯化的”蛋白从细菌中取出且缺乏信号肽。

下表描述了制备的融合蛋白构建体。

表3：含有PilA和蛋白E的融合蛋白构建体

sp = 信号肽；A.A. = 氨基酸

表3中列出的信号肽和质粒各自的DNA和氨基酸序列在下文阐述。

信号序列：

融合蛋白构建体序列：

氨基酸序列的单个有下划线的部分来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的PilA。氨基酸序列的粗体有下划线的部分来源于来自流感嗜血杆菌菌株772的蛋白E。

上述序列由其获得的PE和PilA的全长序列分别在SEQ ID NO. 4（PE）和SEQ ID NO. 58（PilA）中阐述。

实施例2：载体构建和转化

用于扩增来自流感嗜血杆菌菌株772的PE的引物基于流感嗜血杆菌菌株Hi Rd的序列进行设计。当与目前报告的NTHi 772基因组序列相比较时， 5’引物序列含有与NTHi 772序列相比较的一个核苷酸差异，引入在位置24处的氨基酸差异。融合蛋白构建体中的氨基酸#24是E（谷氨酸），代替如NTHi 772中发现的K（赖氨酸）。

来自流感嗜血杆菌菌株772的PE的DNA序列（如下述中所示：Microbes & Infection，Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10（2008）87-97]，2010年7月6日可在线获得，“出版中的文章”））- SEQ ID NO. 153

来自流感嗜血杆菌菌株772的PE的蛋白序列（如下述中所示：Microbes & Infection，Corrigendum to “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10（2008）87-97]，2010年7月6日可在线获得，“出版中的文章”））- SEQ ID NO. 154

载体构建：

为了生成LVL312、LVL291、LVL268、LVL269、LVL270、LVL702、LVL735、LVL778、LVL779、LVL780、LVL781和LVL782，制备具有下述组分的聚合酶链反应（PCR）制剂（具体组分随后例举）：配制36.6 μl去离子水、5 μl缓冲液#1 10X、5 μl dNTPs 2mM、2 μl MgCl₂ 25 mM、0.4 μl引物#1（50 μM）、0.4 μl引物#2（50 μM）、0.5 μl模板（100 ng/μl）和0.4 μl KOD HiFi DNA聚合酶2.5单位/μl（NOVAGEN^?）。聚合酶链反应涉及在98℃下15秒变性、在55℃下2秒退火和在72℃下20秒引物延伸的25个循环。PCR产物使用QIAQUICK^? PCR纯化试剂盒（QIAGEN^?）进行纯化。该产物在由供应商推荐的条件下使用，所述条件为：将QIAQUICK^? PCR纯化试剂盒中提供的5体积缓冲液PB加入1体积的PCR制剂中。具有缓冲液PB的PCR制剂随后通过涡旋混合。将QIAQUICK^?柱置于2 ml收集管内。为了使PCR制剂中的DNA与柱结合，将混合样品应用于QIAQUICK ^?柱，并且以14 000 RPM离心30–60秒。弃去流通物，并且将QIAQUICK ^?柱放回到相同管中。为了洗涤结合的DNA，将QIAQUICK ^? PCR纯化试剂盒中提供的0.75 ml缓冲液PE加入QIAQUICK ^?柱中，并且将柱以14 000 RPM离心30–60秒。弃去流通物，并且将QIAQUICK ^?柱放回到相同管中。将QIAQUICK ^?柱再一次在2 ml收集管中离心1分钟，以去除残留洗涤缓冲液。将每个QIAQUICK ^?柱置于干净的1.5 ml微量离心管中。为了洗脱DNA，将33 μl水加入QIAQUICK ^?膜的中心，并且将柱以14 000 RPM离心1分钟。限制性酶和相关缓冲液得自New England BioLabs。例如，将大约5 μl pET26b载体（100 ng/μl）、2 μl NE缓冲液2（New England Biolabs，1X NE缓冲液2：50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM二硫苏糖醇，pH 7.9在25℃下）、1 μl NdeI（20 000单位/ml）、1 μl HindIII（20 000单位/ml）和11 μl去离子水混合，并且在37℃下温育两小时用于DNA消化。其后，使用QIAQUICK ^? PCR纯化试剂盒（QIAGEN^?），伴随上文描述的操作，执行第二纯化步骤。

使用来自New England BioLabs的Quick T4 DNA连接酶和快速连接反应缓冲液执行连接。例如，将在10 μl去离子水中的约10 ng载体和30 ng插入片段与10 μl 2X快速连接反应缓冲液（New England Biolabs，132 mM Tris-HCl、20 mM MgCl₂、2mM二硫苏糖醇、2 mM ATP、15%聚乙二醇，pH 7.6在25℃下）和1 μl Quick T4 DNA连接酶（New England Biolabs）混合。在转化前，将酶促反应在室温下温育5分钟。

为了生成LVL315、LVL317、LVL318、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739和LVL740，制备具有下述组分的PCR制剂：配制40 μl去离子水、5 μl反应缓冲液10X、1 μl dNTPs混合物、1 μl引物#1（10 μM）、1 μl引物#2（10 μM）、1 μl模板（25 ng/μl）和1 μl PfuUltra高保真DNA聚合酶2.5单位/μl（QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit，Agilent Technologies，Stratagene Division）。聚合酶链反应涉及在95℃下变性30秒的一个循环，在95℃下变性30秒、在55℃下退火1分钟和在68℃下引物延伸5分30秒的18个循环。在转化前，使用1 μl DpnI限制性酶，将PCR产物在37℃下消化一小时。

用于扩增的PCR引物序列的详细列表在表4中示出。

为了生成pRIT16711，通过PCR由NTHi菌株772的基因组DNA扩增编码SEQ ID NO. 4的氨基酸22 - 160的PE基因片段，其排除编码其相应的分泌信号的序列。扩增引物基于可用菌株Hi Rd序列进行设计（在那时，772序列是未知的）。5’引物序列含有与NTHi 772序列（如目前可用的序列）相比较的一个突变，引入在位置24处的PE编码序列中的一个氨基酸差异，谷氨酸（E）代替赖氨酸（K）。在PCR扩增后，使用BamHI和XhoI限制位点在pET-26（+）表达载体（NOVAGEN^?）中克隆插入片段。

为了生成pRIT16671，由NTHi菌株86-028NP的基因组DNA扩增编码PilA基因片段的DNA片段（SEQ ID NO. 58的氨基酸40 - 149，SEQ ID NO. 127）（其排除其引导肽以及预测的疏水性α螺旋的一部分），并且克隆到pET15表达载体内。载体pRIT16790（含有来自NTHi菌株86-028NP的氨基酸40 - 149）用作模板，以生成载体pRIT16671。使用载体pRIT16790以及引物MDES PILA-3和MDES PILA-4，通过PCR扩增PilA基因片段。使用NdeI / XhoI限制位点，将PilA片段克隆到pET-26表达载体内。将编码六组氨酸（his）氨基酸的DNA序列掺入5’引物内，以在PilA序列（MDES PILA-3）的N末端处添加六个组氨酸（6xhis）。

为了生成LVL312（FlgI信号肽-E-PilA片段-GG-PE片段-GGHHHHHH），使用pRIT16671载体作为模板以及引物CAN534和CAN537，执行聚合酶链反应，以扩增PilA基因（氨基酸40-149 /菌株86-028NP）。将对应于FlgI信号肽（sp）和谷氨酸（E）氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN534）内。为了将PilA序列连接至PE序列，将对应于两个甘氨酸（GG）氨基酸接头和N末端PE氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN537）内。使用pRIT16711载体作为模板以及引物CAN536和CAN538，执行另一聚合酶链反应，以扩增PE基因（氨基酸18-160）。将对应于C末端PilA氨基酸和GG氨基酸的DNA序列掺入5’引物内，以将pilA序列至PE序列（CAN536）。将对应于GG氨基酸接头和6xhis氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN538）内。最后，为了生成LVL312，执行第三次聚合酶链反应，以扩增融合的PilA和PE基因，所述融合物具有在N末端处的FlgI信号肽、在FlgI和pilA之间的谷氨酸（E）氨基酸、在PilA和PE序列之间的GG接头、以及在PE和C末端处的6xhis氨基酸之间的GG接头。为了实现该扩增，上文描述的两次聚合酶链反应的产物用作模板，伴随引物CAN534和CAN538。将对应于NdeI限制位点的DNA序列掺入5’引物内，并且将HindIII限制位点掺入3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL291（pelB信号肽-PE片段-GG-PilA片段-GG-6xhis），使用pRIT16711载体作为模板以及引物CAN544和CAN546，执行聚合酶链反应，以扩增PE基因（氨基酸19-160）。将对应于pelB信号肽（sp）氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN544）内。为了将PilA序列连接至PE序列，将对应于GG氨基酸接头和N末端PilA氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN546）内。使用pRIT16671载体作为模板伴随引物CAN545和CAN535，执行另一聚合酶链反应，以扩增PilA基因（SEQ ID NO. 58的氨基酸40-149，SEQ ID NO. 127）。将对应于C末端PE氨基酸和GG氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN545）内，以将PilA序列连接至PE序列。将对应于接头GG氨基酸和6xhis氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN535）内。最后，为了生成LVL291，执行第三次聚合酶链反应，以扩增融合的PE和PilA基因，所述融合物具有在N末端处的pelB信号肽、在PE和PilA序列之间的GG接头、以及在PilA和C末端处的6xhis氨基酸之间的GG接头。为了实现该扩增，上文描述的两次聚合酶链反应的产物用作模板，伴随引物CAN544和CAN535。将对应于NdeI限制位点的DNA序列掺入5’引物内，并且将HindIII限制位点掺入3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL268（pelB信号肽-D-PE片段-GG-PilA片段-GG-6xhis），使用pRIT16711载体作为模板伴随引物CAN547和CAN546，执行聚合酶链反应，以扩增PE基因（氨基酸20-160）。将对应于pelB信号肽（sp）氨基酸和天冬氨酸（D）氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN547）内。为了将PilA序列连接至PE序列，将对应于GG氨基酸接头和N末端PilA氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN546）内。使用pRIT16671载体作为模板伴随CAN545和CAN535，执行另一聚合酶链反应，以扩增PilA基因（氨基酸40-149 / NTHi菌株86-028NP）。将对应于C末端PE氨基酸和GG氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN545）内，以将PilA序列连接至PE序列。将对应于接头GG氨基酸和6xhis氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN535）内。最后，为了生成LVL268，执行第三次聚合酶链反应，以扩增融合的PE和PilA基因，所述融合物具有在N末端处的pelB信号肽、在pelB信号肽和PE之间的D氨基酸、在PE和PilA序列之间的GG接头、以及在PilA和C末端中的6xhis氨基酸之间的GG接头。为了实现该扩增，上文描述的两次聚合酶链反应的产物用作模板，伴随引物CAN547和CAN535。将对应于NdeI限制位点的DNA序列掺入5’引物内，并且将HindIII限制位点掺入3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL269（NadA信号肽-ATNDDD-PE片段-GG-PilA片段-GG-6xhis），使用pRIT16711载体作为模板伴随引物CAN548和CAN546，执行聚合酶链反应，以扩增PE基因（SEQ ID NO. 4的氨基酸22-160）。将对应于pelB信号肽（sp）氨基酸和ATNDDD氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN548）内。为了将PilA序列连接至PE序列，将对应于GG氨基酸接头和N末端PilA氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN546）内。使用pRIT16671载体作为模板伴随引物CAN545和CAN535，执行另一聚合酶链反应，以扩增PilA基因（SEQ ID NO. 58的氨基酸40-149，SEQ ID NO. 127）。将对应于C末端PE氨基酸和GG氨基酸的DNA序列掺入5’引物内，以将PilA序列连接至PE序列（CAN545）。将对应于接头GG氨基酸和6xhis氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN535）内。最后，为了生成LVL269，执行第三次聚合酶链反应，以扩增融合的PE和PilA基因，所述融合物具有在N末端处的NadA信号肽、在pelB信号肽和PE之间的ATNDDD氨基酸、在PE和PilA序列之间的GG接头、以及在PilA和C末端处的6xhis氨基酸之间的GG接头。为了实现该扩增，上文描述的两次聚合酶链反应的产物用作模板，伴随引物CAN548和CAN535。将对应于NdeI限制位点的DNA序列掺入5’引物内，并且将HindIII限制位点掺入3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL270（M-6xHis-PE片段-GG-PilA片段），使用pRIT16711载体作为模板伴随引物CAN540和CAN542，执行聚合酶链反应，以扩增PE基因（氨基酸17-160）。将对应于6xhis氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN540）内。为了将PilA序列连接至PE序列，将对应于GG氨基酸接头和N末端PilA氨基酸的DNA序列掺入3’引物（CAN542）内。使用pRIT16671载体作为模板伴随引物CAN541和CAN543，执行另一聚合酶链反应，以扩增PilA基因（氨基酸40-149 / NTHi菌株86-028NP）。将对应于C末端PE氨基酸和GG氨基酸的DNA序列掺入5’引物（CAN541）内，以将PilA序列连接至PE序列。最后，为了生成LVL270，执行第三次聚合酶链反应，以扩增融合的6-his-PE-GG-PilA基因。为了实现该扩增，上文描述的两次聚合酶链反应的产物用作模板，伴随引物CAN540和CAN543。将对应于NdeI限制位点的DNA序列掺入5’引物内，并且将HindIII限制位点掺入3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL315（pelB信号肽-MD-PE片段-GG-PilA片段-GG-6xhis），使用LVL291作为模板伴随引物CAN670和CAN671，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division），执行定点诱变，以将N末端PE氨基酸序列从QIQ改变为MD。

为了生成LVL317（pelB信号肽-PE片段-GG-pilA片段），使用LVL291作为模板伴随引物CAN678和CAN679，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division），执行定点诱变，以将终止密码子掺入PilA基因和对应于GGHHHHHH氨基酸残基的DNA序列（SEQ ID NO: 3）之间。

为了生成LVL318（pelB信号肽-MD-PE-GG-PilA），使用LVL315作为模板伴随引物CAN678和CAN679，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division），执行定点诱变，以将终止密码子掺入PilA基因和对应于GGHHHHHH氨基酸残基的DNA序列（SEQ ID NO: 3）之间。

为了生成LVL702（LVL291 ΔQ），使用LVL291载体作为模板伴随引物CAN1517和CAN1518，执行聚合酶链反应。将对应于在LVL291序列上的位置23处的氨基酸Q的三核苷酸缺失掺入5’引物内。LVL702和LVL291之间的唯一差异是在LVL291序列上的位置23处的氨基酸Q缺失。将NdeI和HindIII限制位点分别掺入5’和3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL735（LVL317 ΔQ），使用LVL317载体作为模板伴随引物CAN1517和CAN1519，执行聚合酶链反应。将对应于在LVL317序列上的位置23处的氨基酸Q的三核苷酸缺失掺入5’引物内。LVL735和LVL317之间的唯一差异是在LVL317序列上的位置23处的氨基酸Q缺失。将NdeI和HindIII限制位点分别掺入5’和3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

为了生成LVL736（LVL291 + SA），执行定点诱变，以将氨基酸S和A加入LVL291序列上的氨基酸22和23之间。LVL291用作模板，伴随引物CAN1531和CAN1532，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division）。

为了生成LVL737（LVL291 + A），执行定点诱变，以将氨基酸A加入LVL291序列上的氨基酸22和23之间。LVL291用作模板，伴随引物CAN1529和CAN1530，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division）。

为了生成LVL738（LVL291 ΔQIQ），执行定点诱变，以缺失在LVL291序列上的位置23 - 25的氨基酸Q、I和Q。LVL291用作模板，伴随引物CAN1523和CAN1524，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division）。

为了生成LVL739（LVL291 ΔQIQK），执行定点诱变，以缺失在LVL291序列上的位置23 - 26的氨基酸Q、I、Q和K。LVL291用作模板，伴随引物CAN1525和CAN1526，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division）。

为了生成LVL740（LVL291 ΔQIQKA），执行定点诱变，以缺失在LVL291序列上的位置23 - 27的氨基酸Q、I、Q、K和A。LVL291用作模板，伴随引物CAN1527和CAN1528，以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division）。

为了生成LVL778（LVL736 Δ6xHis标签）、LVL779（LVL737 Δ6xHis标签）、LVL780（LVL738 Δ6xHis标签）、LVL781（LVL739 Δ6xHis标签）和LVL782（LVL740 Δ6xHis标签），使用LVL736、LVL737、LVL738、LVL739和LVL740载体分别作为模板，伴随引物CAN1669和CAN543，执行聚合酶链反应。6xHis标签的缺失对应于在C末端序列处的氨基酸序列GGHHHHHH（SEQ ID NO. 3）。将该缺失掺入3’引物内。将NdeI和HindIII限制位点分别掺入5’和3’引物内。随后将生成的PCR产物插入pET-26b（+）克隆载体（NOVAGEN^?）内。

表4：用于PE、PilA和PE-PilA扩增的PCR引物序列

转化

根据对于CaCl₂处理细胞的标准方法，用质粒DNA转化大肠杆菌BLR（DE3）或大肠杆菌HMS（DE3）细胞。（Hanahan D. ? Plasmid transformation by Simanis. ? In Glover，D. M.（编辑），DNA cloning. IRL Press London.（1985）: 第109-135页.）。简言之，使BLR（DE3）或HMS174（DE3）感受态细胞在冰上逐渐解冻。使用50-100 μl感受态细胞混合大约4μl质粒（10-100 ng）。其后，将该制剂在冰上温育30分钟。为了执行转化反应，使制剂在42℃下热脉冲45秒，随后在冰上温育2分钟。将大约0.5 ml SOC培养基（具有分解代谢产物阻遏的超最佳肉汤（Super Optimal broth））加入经转化的细胞，并且在具有50 ug/ml卡那霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂上铺平板之前，将细胞培养物在37℃下温育一小时。将约100 μl经转化的细胞培养物铺平板，并且在37℃下温育过夜。

BLR（DE3）: BLR是BL21（F– ompT hsdSB（rB– mB–）gal dcm（DE3）的recA^–衍生物。用于重组蛋白表达的该大肠杆菌菌株改善质粒单体得率，并且可以帮助稳定含有重复序列或其产物可以引起DE3原噬菌体丧失的靶质粒。（Studier，F.W.（1991）J. Mol. Biol.219: 37–44）。大肠杆菌BLR（DE3）的详细基因型已由NOVAGEN^?公开。（F- ompT hsdSB（rB- mB-）gal dcm Δ（srl-recA）306::Tn10（TetR）（DE3）。

HMS174（DE3）: HMS174菌株提供了在K-12背景中的recA突变。如同BLR，这些菌株可以稳定其产物可以引起DE3原噬菌体丧失的某些靶基因。大肠杆菌HMS174（DE3）的详细基因型已由NOVAGEN^?公开。（F– recA1 hsdR（rK12– mK12+）（DE3）（Rif R ）。

使用BLR（DE3）的生产和加上His标签的构建体的表征在实施例3到实施例6中描述

实施例3：使用摇瓶的蛋白表达

一般地，将用大肠杆菌BLR（DE3）（所述大肠杆菌BLR（DE3）用重组质粒转化）接种的一块汇合琼脂平板剥离，重悬浮于培养基中，并且用于接种800 ml LB肉汤（Becton，Dickinson and Company）± 1%（重量/体积，w/v）葡萄糖（Laboratoire MAT，目录号: GR-0101）和50μg/ml卡那霉素（Sigma），以获得在0.1和0.2之间的O.D._600nm。培养物在37℃下伴随250 RPM搅动进行温育，以达到O.D._600nm ~0.8。

随后收集1 ml每种培养物，以14 000 RPM离心5分钟，并且将上清液和沉淀分别冷冻于-20℃下。

在O.D._600nm ~0.8时，在通过添加1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG；EMD Chemicals Inc.，目录号: 5815），且伴随250 RPM搅动在16、22和30℃下温育过夜，或在37℃下温育3小时，优选在22℃下温育过夜，诱导重组蛋白表达之前，将BLR（DE3）培养物冷却（-20℃ 20分钟或4℃ 1小时，优选在4℃下1小时）。在温育期后，将培养物以14 000 RPM离心5分钟或以6 000 RPM离心15分钟，并且将上清液（培养基级分样品）和沉淀（含有可溶性和不溶性级分）分别冷冻于-20℃下。

这些条件用于周质蛋白表达。

实施例4：使用摇瓶、细胞糊(cell paste)、加上His标签的构建体的蛋白纯化

将在诱导后获得的每种细菌沉淀重悬浮于20 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH 8.0）中，所述缓冲液含有500 mM NaCl、10 mM咪唑和Roche  COMPLETE^?蛋白酶抑制剂混合物（1个片剂/50 ml含有500 mM NaCl的HEPES缓冲液，Roche  COMPLETE? ULTRA片剂，Roche Diagnostics Corporation）。

可替代地，可以使用20 - 50 mM N,N-二羟乙基甘氨酸（bicine）缓冲液代替含有NaCl的HEPES缓冲液。例如，可以使用20 mM N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液。使用Constant System 1.1 KW 2 X 30 000 PSI（磅/平方英寸）裂解细菌。通过在4℃下以20 000g离心20分钟，分离可溶性（上清液）和不溶性（沉淀）组分。

使用PROFINIA^TM蛋白纯化方案（Bio-Rad Laboratories，Inc.），在固定化金属亲和层析（IMAC）上，在天然条件下纯化加上6-His标签的蛋白。将可溶性组分装载到5ml His Trap柱（Bio-Rad Laboratories，Inc.）上，所述His Trap柱由用于细菌重悬浮的相同缓冲液预平衡；可溶性组分以最高达5 ml/分钟添加（产生“流通物级分”）。在装载到柱上之后，将柱用10柱体积的相同缓冲液以10 ml/分钟的速率进行洗涤（产生“洗涤级分#1）。执行使用含有500 mM NaCl和20 mM咪唑的20 mM N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液或20 mM HEPES缓冲液（pH 8.0）的二次洗涤，（产生“洗涤级分#2）。使用2柱体积的含有500 mM NaCl和20 mM咪唑的20mM HEPES缓冲液或50mM N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液（pH 8.0）以10 ml/分钟的速率执行洗脱，产生“洗脱级分”。

为了改善蛋白的纯度，将来自IMAC的阳性洗脱级分合并，并且装载到尺寸排阻层析（SEC）柱（来自GE Healthcare的HILOAD^TM SUPERDEX^TM 200 26/60）上，所述柱在不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水（NaCl 137 mM、KCl 2.7 mM、Na₂HPO₄ 8.1 mM、KH₂PO₄ 1.47 mM，pH 7.4）中预平衡。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析来自洗脱级分的样品。使用Centricon 10 000 MW（Millipore）浓缩样品。

使用分光光度计确定蛋白浓度。

实施例5：加上His标签的构建体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，以及未加上His标签的LVL317和LVL318构建体的SDS-PAGE分析

可溶性和不溶性级分的制备

例如，将1 ml诱导（参见例如上文实施例3）后的培养物以14 000 RPM离心2分钟。使用40 μl BUGBUSTER^?蛋白提取试剂（NOVAGEN^?，EMD4 Biosciences，Merck），将沉淀重溶解，产生细胞悬浮液。使细胞悬浮液在旋转平台上在室温下温育10分钟。随后将细胞悬浮液以14 000 RPM离心2分钟，以分离可溶性级分。使用70 μl去离子水、5 μl二硫苏糖醇（DTT）1M和25 μl NUPAGE^? LDS（十二烷基硫酸锂）样品缓冲液4X（INVITROGEN^TM），将所得到的沉淀（不溶性级分）重溶解。将可溶性级分（来自重溶解沉淀的细胞悬浮液的上清液）加入30 μl 去离子水、5 μl DTT 1M和25 μl LDS样品缓冲液4X中。

培养基级分的制备

例如，为了制备培养基级分，通过添加500 μl RC试剂I（Bio-Rad Laboratories，Inc.）浓缩100 μl上清液，所述上清液来自离心后的经诱导的全细胞培养物（参见例如上文实施例3）；将样品混合且在室温下温育1分钟。随后，将500 μl试剂II（Bio-Rad Laboratories，Inc.）加入样品且混合。将该制剂以14 000 RPM离心10分钟。使用28 μl 去离子水、2 μl DTT 1M和10 μl LDS SB 4X，将沉淀重溶解。

纯化级分的制备

例如，通过添加70 μl样品、5 μl DTT 1M和25 μl LDS样品缓冲液4X，制备纯化的蛋白（例如，如实施例4中所述获得）用于SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE分析和对硝酸纤维素膜的转移

根据制造商的建议（Invitrogen），使用NUPAGE^? Bis-Tris 4-12%凝胶，执行SDS-PAGE分析和对硝酸纤维素膜的转移。在由供应商推荐的条件下完成样品制备、缓冲液和迁移条件。

在一个实例中，使凝胶装载有来自主要混合物（master mix）的20 ul样品，所述主要混合物包含70 μl纯化蛋白级分、5 μl DTT 1M和25 μl LDS SB 4X。

在NUPAGE^? Bis-Tris 4-12%凝胶上运行样品后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜。

使用3%乳/ PBS 1X新鲜溶液，将硝酸纤维素膜在37℃、60 RPM下封闭30分钟。在封闭温育后，在37℃、60 RPM下加入在3%乳/ PBS 1X新鲜溶液中以1:1000稀释的一抗（6X His Tag^?抗体，Abcam PLC，目录号: ab9108），共1小时。在那之后，使用0.02%聚山梨醇酯（polsorbate）20（例如TWEEN^TM 20）/ PBS 1X，在室温下将膜洗涤三次，各5分钟。使用3%乳/ PBS 1X新鲜溶液，加入以1:14 000稀释的二抗（碱性磷酸酶（AP）兔抗IgG（H+L）兔，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）。使膜在37℃、60 RPM下温育1小时。在那之后，在膜暴露于5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基四氮唑蓝（例如来自Sigma-Aldrich^?的BCIP^?/NBT，1个片剂/ 10 ml水）之前，使用0.02%聚山梨醇酯20（例如TWEEN^TM 20）/ PBS 1X，在室温下将膜洗涤三次，共5分钟。

关于融合蛋白构建体LVL291、LVL268和LVL269的经诱导的细菌提取物的SDS-PAGE，参见图1。在诱导（ind）前和诱导后，对于LVL291、LVL268和LVL269装载不溶性级分（I）、可溶性级分（S）和培养基级分（M）。

关于与融合蛋白构建体LVL291、LVL268和LVL269的纯化提取物相关的SDS-PAGE和蛋白质印迹，参见图2。对于LVL291、LVL268和LVL269的纯化，装载流通物级分（Ft）、洗涤级分（W）和洗脱级分（E）。抗his标签用于探测提取物。

关于融合蛋白构建体LVL291和LVL315的经诱导的细菌和纯化提取物的SDS-PAGE，参见图3。对于LVL291和LVL315装载培养基级分（M）、可溶性级分（Sol）、不溶性级分（Ins）、流通物级分（Ft）、洗涤级分#1（W1）、洗涤级分#2（W2）和洗脱级分（E）。

关于融合蛋白构建体LVL312的经诱导的细菌和纯化提取物的SDS-PAGE，参见图4。对于LVL312装载培养基级分（M）、可溶性级分（Sol）、不溶性级分（Ins）、流通物级分（Ft）、洗涤级分#1（W1）、洗涤级分#2（W2）和洗脱级分（E）。

关于融合蛋白构建体LVL291、LVL702、LVL736、LVL737、LVL738、LVL739、LVL740和pET26b载体（阴性对照）的经诱导的细菌提取物的可溶性级分的SDS-PAGE，参见图25。（a）实验1（b）实验2（c）实验3。PE-PilA融合蛋白由箭头指示。

关于来自实验1、2和3的可溶性级分中的融合蛋白的平均条带百分比，参见图26。

一般如上所述制备分别在图5和图6中的SDS-PAGE分析中使用的LVL317和LVL318细菌提取物。

图5. 融合蛋白构建体LVL317的经诱导（1mM和10μM IPTG）的细菌提取物的SDS-PAGE。来自诱导前（NI）和诱导后（In）的提取物、可溶性级分（S）、不溶性级分（I）。

图6. 融合蛋白构建体LVL318的经诱导（1mM和10μM IPTG）的细菌提取物的SDS-PAGE。来自诱导前（NI）和诱导后（In）的提取物、培养基级分（M）、可溶性级分（S）、不溶性级分（I）。

将通过SDS-PAGE分离的蛋白转移至Immobilon-P膜。将考马斯蓝染色的蛋白条带切割且置于序列分析仪反应器中。根据制造商的方案，使用Applied Biosystems  PROCISE?蛋白测序仪，型号494-cLC，进行测序。

表5：摇瓶蛋白表达概况和融合蛋白构建体的信号肽切割

So = 可溶性级分。In = 不溶性级分。Se = 在培养基级分中分泌的蛋白。Nt = 未测试。下述等级评定基于目视检查（考马斯）+ : 低表达； ++ : 中等表达；+++ : 高表达；- : 无表达。

实施例6：LVL291融合蛋白表征

LVL291的物理特性：PE和PilA在LVL291中的折叠和解链温度

圆二色性：

二级结构的分析

通过测量由于结构不对称在左旋偏振光相对于右旋偏振光的吸收中的差异，圆二色性（CD）用于确定蛋白的二级结构组成。无论蛋白显示出β折叠、α螺旋还是无规卷曲结构，在远UV区（190-250nm）中的CD谱的形状和量级是不同的。在给定蛋白样品中的每个二级结构类型的相对丰度可以通过与参考谱比较进行计算。

使用从178到250nm，0,01cm的光程，伴随在Jasco J-720分光偏振计上的1nm分辨率和带宽，测量远UV谱。细胞的温度通过Peltier恒温RTE-111细胞块而维持在23℃。在测量期间维持10L/分钟的氮流。

结果：

对于PE（来自构建体pRIT16762）、PilA（来自构建体pRIT 16790）和PE-PilA蛋白获得的远UV CD谱是含有α和β结构的混合物的折叠蛋白特有的，但PE明显比PilA和PE-PilA更富含α螺旋（图7，PE、PilA和PE-PilA融合蛋白的CD谱）。

为了评估在嵌合蛋白中结合在一起的PE和PilA各个蛋白的折叠完整性，并且随后验证两者之间的可能相互作用，计算差示谱。

当组合PE和PilA远UV谱时，所得到的谱与PE-PilA嵌合体(chimer)的谱重叠（图8，PE和PilA CD谱的组合）。该结果提示PE-PilA嵌合体含有在各个组分中检测到的所有二级结构。还提示蛋白的融合对各个组分的二级结构没有重大影响，并且因此无论蛋白是分离的还是融合的，PE和PilA的折叠并无显著不同。

解链温度评估：

为了评估融合物中的表达对各个蛋白的热力学特性是否具有影响，通过经由圆二色性监控α螺旋随着温度的解折叠，来评估PE、PilA和PE-PilA的解链温度。

α螺旋的存在的特征在于在222nm处的圆二色性信号中的最小值，因此在温度增加期间在222nm处的CD信号中的显著增加指示蛋白变性。蛋白在其下经历二级结构丧失的温度的确定允许确定解链温度（Tm），这对应于在其下一半蛋白已丧失其结构的温度。

解链温度可以通过鉴定在得自温度相对于CD 222nm图获得的热变性曲线上的拐点进行确定。

如通过远UV CD确定的PilA和PE的解链温度分别为52℃和68℃（图9，PilA热变性曲线；图10，PE热变性曲线）。

PE-PilA融合蛋白显示出在48℃和71℃下的两个独特Tm（图11，PE-PilA融合蛋白热变性曲线）。这些值指示当结合成嵌合体时，PE和PilA蛋白仍独立折叠，并且无论它们是分离的还是融合的，它们都在相似温度下解折叠。PilA部分在48℃下解折叠不引起沉淀或影响PE部分在71℃下的Tm的观察强烈指示：在融合物内PE和PilA之间的相互作用是降到最低的，并且它们彼此没有可观察的较大影响。蛋白的解链温度对多种外部条件敏感，包括缓冲液组成或相互作用分子的存在；在PE和PilA融合后未观察到较大变化强烈指示：当PE和PilA结合在一起时，它们的结构和特性大部分得到保存。

实施例7：发酵过程

本发明的融合蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。

实施例8：PE、PilA和LVL317的蛋白纯化

来自pRIT16762的PE蛋白纯化：

为了生成pRIT16762表达载体，使用BamHI和NcoI限制性酶消化pRIT16711载体，以便缺失在信号序列（pelB）和PE之间的6个氨基酸残基。所获得的载体命名为pRIT16712。在该载体中，在信号序列pelB和PE之间存在3个氨基酸：MDP。在第二步中，使用pRIT16712作为模板，伴随引物MnoNTHi-44和MnoNTHi-45（在表4中描述），以及QuikChange II定点诱变试剂盒（Agilent Technologies，Stratagene Division），执行定点诱变，以将氨基酸序列从MDP改变为QIQ。

含有PE QIQ（来自pRIT16762构建体）的大肠杆菌BLR（DE3）的工作种子由-80℃解冻，并且通过在37℃下在以215 RPM的搅动下的过夜温育，用于制备100  ml在LB肉汤中的预培养物。在过夜温育后，用12.5 ml预培养物接种含有800 ml LB APS的八个烧瓶，并且OD₆₀₀测量为约0.06。培养物在37℃下伴随振荡温育3小时。在约0.9的OD₆₀₀时，加入1mM IPTG以起始诱导。在诱导期间，使培养物在22℃下伴随振荡温育19小时。在诱导后，OD₆₀₀为约2.2。将细胞培养物转移到置于1L瓶内部的1L离心袋内，并且在4℃下以6,000xg离心30分钟且弃去上清液。保存在诱导前和诱导后的培养物和上清液的1ml等分试样用于未来分析。

用PE QIQ诱导的BLR（DE3）的裂解

从离心瓶中取出离心袋，打开且将沉淀从袋逐出到烧杯内。将八个沉淀合并在一起，并且重悬浮于100ml结合缓冲液（20mM Hepes、10mM咪唑、500mM NaCl，pH 8.01）中。用来自Constant Systems Ltd.的TS Series Bench Top细胞破碎器(1x30 kPsi; 1x15kPsi)破碎含有PE QIQ构建体的大肠杆菌BLR（DE3）。将裂解产物在6000RPM、4℃下离心30分钟。将上清液保存且装载到IMAC柱上。

PE QIQ的IMAC纯化

用5CV结合缓冲液（20mM HEPES、10mM咪唑、500mM NaCl，pH 8.01）以5ml/分钟平衡IMAC柱（BioRad，Bio-Scale Mini Profinity IMAC药液筒5ml）。将100ml裂解产物上清液以2.5mL/分钟装载到IMAC上。流通物在50ml级分中收集用于未来分析。将柱用3CV结合缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白。将含有未结合的蛋白的样品以15 ml的一个等分试样收集在50 ml管中。将柱用2CV洗涤缓冲液（20mM HEPES、20mM咪唑、500mM NaCl，pH 8.01）洗涤，以2 ml级分收集在96孔板中。随后用6CV 100%洗脱缓冲液（20mM HEPES、250mM咪唑、500mM NaCl，pH 8.01）洗脱结合的蛋白。将洗脱的蛋白以2 ml级分收集在96孔板中。洗涤和洗脱以5ml/分钟执行。

对PE QIQ的IMAC库的尺寸排阻层析（SEC）

用3CV SEC缓冲液（20mM HEPES、150mM NaCl，pH8.49）平衡SEC柱（GE healthcare，HILOAD^TM 26/60 SUPERDEX^TM 75制备级别，60cm高度，大约319ml体积）。将11 ml IMAC洗脱物以2.5 ml/分钟的流速装载到柱上。收集从0.3CV到0.9CV的2ml级分。执行两次运行，随后通过SDS-PAGE分析级分。将含有Prot E蛋白的来自两次运行的级分合并在一起（“SEC库”，大约48ml总体积）。将500mM精氨酸加入SEC库中。

在上文SEC方案中生成的PE QIQ合并样品的剂量

遵循制造商的方案，用来自Bio-Rad RC DC^TM试剂盒的RCDC（还原试剂和去污剂相容的）方法分配（dosed）SEC库剂量：

对于每种测试的样品和标准，将25μL一式两份分配于微量离心管中。将125μL Bio-Rad RC试剂I加入每个管内；将每个管涡旋且在室温下温育1分钟。将125μL Bio-Rad RC试剂II加入每个管内；将每个管涡旋且随后以14,000xg离心5分钟。通过将管倒置在干净的吸附性棉纸上，允许液体完全从管中排出，而弃去上清液。将25.4μL试剂A（已通过混合20μL试剂S/1ml试剂A制备）加入每个管中；将每个管涡旋且在室温下温育5分钟，或直至沉淀物完全溶解。在进行性下一步之前涡旋。将200μL DC试剂B加入每个管且立即涡旋。在室温下温育15分钟。将所有样品转移至96孔板，并且阅读在750nm处的吸光度，以确定每种未知蛋白样品的蛋白浓度。

ProtE浓度为1.069 mg/ml。

加上His标签的PilA的蛋白纯化：

PilA遵循下文一般操作进行纯化：

将含有编码PilA或其片段的构建体的大肠杆菌细胞悬浮于BUGBUSTER?和BENZONASE?核酸酶（NOVAGEN?），例如10 ml BUGBUSTER?和10 ul BENZONASE?核酸酶中。将细胞裂解产物在室温下在旋转平台上混合例如15分钟。将细胞裂解产物在4℃下例如以16,000g离心20分钟。将含有蛋白的上清液加入含有Ni NTA  HIS ·BIND?树脂的Ni NTA柱，且在4℃下混合例如1小时。柱可以由2 ml Ni NTA HIS ·BIND?树脂（NOVAGEN?）和10 ml 1X结合缓冲液（来自NOVAGEN?’s  Ni-NTA缓冲液试剂盒）组成。随后收集柱流通物。将树脂用1X洗涤缓冲液洗涤两次，所述1X洗涤缓冲液例如含有300 mM NaCl、50mM NaH₂PO₄、25 mM咪唑（imidazone），pH 8.0）。通过重力流动收集洗涤物。用1X洗脱缓冲液，例如300 mM NaCl、50mM NaH₂PO₄、250 mM咪唑，pH 8.0，从柱中洗脱蛋白。蛋白可以通过用结合缓冲液透析进一步纯化，并且如上所述在Ni NTA柱上再运行。

PilA的凝血酶切割

随后使PilA与凝血酶（1/50稀释）一起在室温下温育16小时，以去除组氨酸标签。

对用凝血酶切割的PilA的尺寸排阻层析（SEC）

用5CV SEC缓冲液（20mM HEPES、150mM NaCl，pH8.52）平衡SEC柱（GE healthcare，HILOAD^TM 26/60 SUPERDEX^TM 75制备级别，60cm高度，大约319ml体积）。将大约10 ml切割的PilA以2.5 ml/分钟的流速装载到柱上。收集从0.3CV到0.9CV的2ml级分。执行两次运行，随后通过SDS-PAGE分析级分。将含有切割的PilA蛋白的来自两次运行的级分合并在一起（“SEC库”，大约52ml总体积）。

PilA，SEC库的剂量。

如上所述用RCDC方法分配SEC库。切割的PilA浓度为5.37 mg/ml。

用PBS 1x pH 7.4透析PilA SEC库（透析因子= 1600）和通过RCDC的剂量

通过RCDC确定的透析后浓度为3.0 mg/ml。

LVL317的纯化

渗透休克

因为LVL317融合蛋白在细菌周质中表达且加工，所以通过渗透休克提取该蛋白。

将来自4 L发酵罐培养物的含有LVL317的冷冻（-20℃）收获的大肠杆菌B2448细胞糊合并，且重悬浮于高渗缓冲液中最多达4L的最终体积，所述高渗缓冲液由24 mM Tris-HCl、16%（w/v）蔗糖、9.9%（w/v）葡萄糖、10 mM EDTA，pH 8.0组成。使用安装在RW 16基础搅拌器上的3叶片螺旋桨，以中等速度，将悬浮液在室温下轻轻混合30分钟。将悬浮液在室温下以15,900 x g离心30分钟。保存上清液（SN1）用于凝胶分析。

将所得到的沉淀重悬浮于低渗溶液中；38 mM MgCl₂，并且在室温下混合30分钟。将混合物在室温下以15,900 x g离心30分钟，并且在上清液（SN2）中回收抗原。

通过经由0.45/0.2 μm聚乙烯砜Sartorius Sartopore 2 MidiCap滤器，以600ml/分钟的流速过滤，执行SN2的澄清。

将SN2用20 mM NaH₂PO₄ -Na₂HPO₄，pH 7.0进行1:3稀释，需要时将pH调整至7.0，并且执行通过经由0.45/0.2 μm聚乙烯砜Sartorius Sartopore 2 MidiCap滤器，以600ml/分钟的过滤的另一次澄清。

SP SEPHAROSE?快速流动（SP FF）层析

将稀释/过滤的SN2装载到14 cm ID（内径）x 20 cm长度柱（柱体积3100ml）中，并且在柱中的强阳离子交换树脂（SP SEPHAROSE? FF - GE Healthcare）上捕获，所述柱用2CV 20 mM NaH₂PO₄ / Na₂HPO₄缓冲液pH 7.0平衡。在用5CV 20 mM NaH₂PO₄ / Na₂HPO₄缓冲液pH 7.0洗涤柱后，通过将相同洗涤缓冲液中的NaCl浓度增加直到100 mM来洗脱抗原（包含在LVL317内）。

关于典型的SP Sepharose^TM快速流动层析图，参见图12。

Q SEPHAROSE?快速流动（Q FF）层析

将SP FF洗脱物中存在的抗原用20 mM Tris pH 8.5进行1:4稀释，需要时将pH调整至8.5，并且经过在14 cm ID x 11.8 cm长度柱（柱体积1800ml）中的强阴离子交换树脂（Q SEPHAROSE? FF - GE Healthcare），所述柱用2CV 20 mM Tris缓冲液pH 8.5平衡。抗原在流通物级分中回收。

关于典型的Q Sepharose^TM快速流动层析图，参见图13。

浓缩、渗滤、聚山梨醇酯80添加和无菌过滤

基于层析图UV，将含有抗原的Q FF流通物浓缩直到0.7-0.8mg/ml，并且使用Pellicon-2? 10 kDa截断膜（Millipore），用5DV 10 mM KH₂PO₄ / K₂HPO₄缓冲液pH 6.5进行渗滤。

使用5%原液，将聚山梨醇酯80（例如，TWEEN^TM 80）加入超滤渗余物中，并且用磁性搅拌器在4℃下以130rpm搅动30分钟。聚山梨醇酯80的最终浓度为0.04%。超滤渗余物通过经由0.45/0.2 μm乙酸纤维素膜（Sartobran 300，Sartorius）过滤进行灭菌。将纯化的批次贮存于-20℃或-80℃下。绝对蛋白浓度通过AAA（氨基酸分析）测量为0.737mg/ml。

实施例9：聚山梨醇酯80的使用

滴定实验指示在无菌过滤前，聚山梨醇酯80具体地TWEEN^TM 80加入纯化的批次中至0.04%（w/v）的最终浓度，降低丝状颗粒形成和聚集。

根据DSC分析，在-20℃下贮存后以及在4℃、-20℃和-80℃和37℃贮存4天后，TWEEN^TM 80降低在冻融循环后可见的结构变化（30-45℃）程度。

实施例10：LVL317的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析：

如下所述，使NUPAGE^?，Bis-Tris 4-12%凝胶装载有在95℃下加热5分钟的在含有50mM DTT的NUPAGE^? LDS样品缓冲液中的10μg样品（对于具有低浓度的样品，装载20μL样品）。迁移：在200伏特下在室温（RT）下在NUPAGE^? MES 运行缓冲液中35分钟。凝胶在瞬间蓝（Instant blue）（Novexin目录: ISB01L）染色2小时，并且在水中脱色过夜。

泳道内容物：

1: MW标准（10μL）            2: 起始（总级分）（10μg）        3: 未过滤的SN1（10μg）

4: 未过滤的SN2（10μg）     5: 未提取的（10μg）                  6: 装载SP FF（10μg）

7: 流通物SP FF（6.9μg）     8: 洗涤SP FF（20μL）               9: 洗脱SP FF（10μg）

10: 剥离(Strip) SP FF（10μg）        11: 装载Q FF（8.9μg）              12: 洗脱Q FF（9.8μg）

13: 剥离Q FF（4.8μg）        14:在掺料0.04% TWEEN^TM 80之前的TFF渗余物（10μg）

15: 纯化的批次，未过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

16: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

17: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（20μg + 掺料的大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg））

18: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（2μg）

19: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg）

20: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（0.5μg）。

关于来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的SDS-PAGE，参见图14。

对于蛋白质印迹，将蛋白在4℃下在30伏特下在硝酸纤维素膜上的NUPAGE^?转移缓冲液+ 20%甲醇、0.1% SDS中转移过夜。将膜用50mM Tris、150mM NaCl pH 7.4 + 5%脱脂奶粉封闭1小时，在封闭缓冲液中稀释的兔多克隆一抗（抗Prot-E 1/50 000和抗大肠杆菌（BLR）1/1 000）中温育2小时，在50mM Tris pH 7.4 + 0.05% Tween 20中洗涤3x5分钟，在二抗（在封闭缓冲液中1/5000稀释的缀合至碱性磷酸酶的山羊抗兔）中温育1小时，在洗涤缓冲液中洗涤3x5分钟，且在BCIP/NBT底物（1个片剂/10ml）中显色。所有温育均以25ml/膜执行。

关于来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的蛋白质印迹，参见图15。印迹使用兔多克隆抗PE。

泳道内容物：

1: MW标准（10μL）            2: 起始（总级分）（10μg）        3: 未过滤的SN1（10μg）

4: 未过滤的SN2（10μg）     5: 未提取的（10μg）                  6: 装载SP FF（10μg）

7: 流通物SP FF（6.9μg）     8: 洗涤SP FF（20μL）               9: 洗脱SP FF（10μg）

10: 剥离SP FF（10μg）        11: 装载Q FF（8.9μg）             12: 洗脱Q FF（9.8μg）

13: 剥离Q FF（4.8μg）        14:在掺料0.04% TWEEN^TM 80之前的TFF渗余物（10μg）

15: 纯化的批次，未过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

16: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

17: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（20μg + 掺料的大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg））

18: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（2μg）

19: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg）

20: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（0.5μg）。

关于来自PE-PilA融合蛋白的纯化过程的过程内样品的蛋白质印迹，参见图16。印迹使用兔多克隆抗大肠杆菌（BLR）。

泳道内容物：

1: MW标准（10μL）            2: 起始（总级分）（10μg）        3: 未过滤的SN1（10μg）

4: 未过滤的SN2（10μg）     5: 未提取的（10μg）                  6: 装载SP FF（10μg）

7: 流通物SP FF（6.9μg）     8: 洗涤SP FF（20μL）               9: 洗脱SP FF（10μg）

10: 剥离SP FF（10μg）        11: 装载Q FF（8.9μg）             12: 洗脱Q FF（9.8μg）

13: 剥离Q FF（4.8μg）        14:在掺料0.04% TWEEN^TM 80之前的TFF渗余物（10μg）

15: 纯化的批次，未过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

16: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（10μg）

17: 纯化的批次，无菌过滤，掺料0.04% TWEEN^TM 80（20μg + 掺料的大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg））

18: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（2μg）

19: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（1μg）

20: 大肠杆菌细胞裂解产物Rix（0.5μg）。

SDS-PAGE和蛋白质印迹图注释：PE-PilA融合蛋白以30kDa迁移。通过渗透休克的提取将在细菌周质中表达且加工的融合蛋白提取，并且降低来自细菌的污染。在高渗处理期间的融合蛋白的小丧失（泳道3）。小比例不通过低渗处理进行提取，并且保持与细胞结合（泳道5）。SP FF流通物（泳道7）和两个柱的剥离级分（泳道10和13）中的小丧失。因为剥离级分的总体积很低，所以融合蛋白的丧失并不显著。降解的条带在剥离级分而不是最终产物中可见。在纯化的批次中没有来自大肠杆菌宿主细胞蛋白的显著污染（泳道16）。

LVL735和LVL778的分析获得与LVL317相似的概况。

实施例11：PE、PilA和LVL317的解链温度

PE-PilA融合物、未加上His标签的蛋白（LVL317）的热转变，与如上所述纯化的加上his标签的PE（如实施例8中所述）和切割的PilA（如实施例8中所述）蛋白的热转变相比较。

在DSC前，使PE和PilA在10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6.5 + 0.04% Tween 80（1:250样品:缓冲液体积比）中透析过夜，以具有在与融合蛋白相同的缓冲液中的PE和PilA。在透析后，通过BCA测量蛋白浓度，且调整至300μg/ml（PE）和500μg/ml（PilA）。

分析在来自MicroCal，LLC（GE Healthcare的一部分）的VP^TM-DSC上完成。最终透析缓冲液用作参考，并且从扫描中扣除。DSC扫描速率90℃/小时。为了评估测量在配制后的最终容器（FC）中的热转变的能力，将融合蛋白稀释至FC浓度（60μg/ml）。最终容器数据未示出。

结果：

关于PE-PilA融合蛋白以及PE和PilA蛋白的热转变，参见图17。曲线：PilA（1），蛋白E（Prot E，PE）（2），未稀释的PE-PilA PB，737μg/ml（3），和以FC浓度稀释的PE-PilA PB，60μg/ml（4）。

1 –  PilA                                                                      Tm: 53℃

2 – 蛋白E                                                                   Tm: 63

3 –未稀释的PE-PilA PB（纯化批次）737μg/ml     Tm₁ : 53.7℃和Tm₂ : 66.1℃

4 – 以FC浓度稀释的PE-PilA PB 60μg/ml             Tm1: 53.2℃和Tm2: 67.6℃。

在纯化的融合蛋白（LVL317）中检测到两个转变（曲线3和4）。

PE-PilA融合蛋白的Tm₁（53.7℃）类似于PilA转变（53℃）。

与PE转变（63℃）相比较，在PE-PilA中的Tm₂（66.1℃）的显著转变。两个结构域的融合看起来稳定PE片段。

与未稀释的相比较，在稀释的融合蛋白中的Tm₂转变是起于聚集典型的陡降斜率(steep decreasing slope)的浓度假象，所述聚集是浓度依赖性的。

LVL735和LVL778的抗原折叠分析类似于LVL317的那种。

实施例12：在Balb/c小鼠中的PE-PilA融合蛋白构建体LVL291抗PilA免疫原性应答。

在Balb/c小鼠中评估针对在AS03_A中配制的纯化的LVL291 PE-PilA融合蛋白（不含异源信号肽的LVL291融合蛋白）的免疫应答。在第0、14和28天时，使用各自在AS03_A中配制的10 μg PE（来自载体pRIT16762）、PilA（来自载体pRIT16790）或PE-PilA，通过肌内途径来免疫动物（20只小鼠/组）。对照组用单独的AS03_A进行疫苗接种。在第42天时收集的各个血清中确定针对每种抗原的抗体应答。用阴性对照未获得抗体应答。如图18中所示，与用单价PilA免疫的小鼠中的抗体应答相比较，针对PilA的抗体应答在用PE-PilA融合物免疫的小鼠中更高。在用融合蛋白免疫的小鼠和用单价PE免疫的小鼠中，针对PE的抗体应答是相似的。GMT = 几何平均滴度。用在WINDOWS^?（Microsoft）下运行的SOFTMAX^? Pro软件（Molecular Devices）捕获且分析数据；四参数逻辑对数函数用于计算标准曲线。四参数逻辑对数函数以高准确度描述参考血清的曲线，当在光密度相对于浓度（对数）规模上标绘时，所述参考血清的曲线展示明显的S形。通过标准曲线的内插，在小鼠血清样品的每个稀释度下计算抗体浓度。通过将来自所有稀释度的值求平均值获得质量控制血清和未知血清样品中的抗体，所述所有稀释度的值落入参考的稀释曲线的工作范围内（10-80%）。结果显示于图18中，其描绘在Balb/c小鼠模型中针对LVL291 PE-PilA融合蛋白以及针对单价PE和PilA的抗体应答。

实施例13：鼠鼻咽定殖模型。用PE-PilA免疫。用NTHi菌株86-028NP和NTHi菌株3224A攻击。

Balb/c雌性小鼠（20/组）在第0和14天时用6μg由LT（大肠杆菌的不耐热毒素）配制的纯化的PE-PilA融合蛋白（LVL291用于由86-028NP的攻击；LVL317用于由菌株3224A的攻击）进行鼻内免疫，并且在第28天时用6 μg在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的纯化PE-PilA融合蛋白进行鼻内免疫。对照小鼠（20/组）用单独的LT进行疫苗接种。小鼠随后用5 x 10⁶ CFU（菌落形成单位）同源NTHi菌株86-028NP和异源NTHi菌株3224A进行鼻内攻击。同源性和异源性通过参考小鼠由其免疫的NTHi菌株进行测定。细菌菌落在攻击后1和2天取出的鼻腔中进行计数。D1 = 第1天。D2 = 第2天。

在攻击后的第1天和第2天时，PE-PilA疫苗接种增加鼻咽中的NTHi菌株86-028NP和菌株3224A的清除。

对于用NTHi菌株86-028NP执行的实验：使用计数的log10值作为应答执行2向固定ANOVA，固定因素是组（4个水平）和天数（2个水平）。拒绝方差异质性的假设，并且具有异质性方差的模型与数据拟合。在2种因素间未检测到显著相互作用。与对照组（LT）相比较，融合物PE-PilA（6 μg/小鼠）组显著降低CFU；几何平均比等于0.06，具有0.01、0.25的95%置信区间。

对于用NTHi菌株3224A进行的实验：使用log10值作为应答执行3向固定ANOVA，固定因素是组、天数和实验。Shapiro-Wilk和Levene检验不拒绝方差正态性和异质性的假定。在2种因素中任一种之间或在3种因素之间未检测到显著相互作用，并且唯一的主要因素保留在分析中。与对照组相比较，PE-PilA / LT  显著降低CFU；几何平均比等于0.11，具有0.02、0.61的95%置信区间。

关于PE-PilA融合蛋白疫苗接种对小鼠鼻咽中的NTHi菌株86-028NP细菌清除的作用，参见图19。

关于PE-PilA融合蛋白疫苗接种对小鼠鼻咽中的NTHi菌株3224A细菌清除的作用，参见图20。

实施例 14：鼠鼻咽定殖模型。用PilA免疫。用NTHi菌株3219C攻击。

雌性OF1小鼠（20只小鼠/组）在第0和14天时用3μg由LT配制的PilA（来自载体16790）进行鼻内免疫，并且在第28天时用3 μg在PBS中的PilA进行鼻内免疫。对照小鼠用单独的LT进行疫苗接种。小鼠随后用5 x 10⁶ CFU NTHi菌株3219C进行鼻内攻击。细菌菌落在攻击后3和4天取出的鼻腔中进行计数。D3 = 第3天。D4 = 第4天。

关于PilA疫苗接种对小鼠鼻咽中的细菌清除的作用，参见图21。

实施例 15：鼠鼻咽定殖模型。用PE免疫。用NTHi菌株3224A攻击。

Balb/c雌性小鼠（20只小鼠/组）在第0和14天时用3μg由LT配制的PE（来自载体pRIT16762）进行鼻内免疫，并且在第28天时用3 μg在PBS中的PE进行鼻内免疫。对照小鼠用单独的LT进行疫苗接种。小鼠随后用5 x 10⁶ CFU NTHi菌株3224A进行鼻内攻击。细菌菌落在攻击后3和4天取出的鼻腔中进行计数。10只小鼠在第3天（D3）时进行检查。10只小鼠在第4天（D4）时进行检查。在攻击后第4天时，PE疫苗接种显著增加鼻咽中的NTHi清除（图22），使用Dunn检验用于统计分析。

关于PE疫苗接种对小鼠鼻咽中的细菌清除的作用，参见图22。

实施例 16：玻连蛋白结合。通过LVL317和LVL735 PE-PilA融合蛋白抑制玻连蛋白结合。

评估纯化的LVL317 PE-PilA融合蛋白构建体中的PE与玻连蛋白结合的能力。用PE（来自载体pRIT16762）或纯化的LVL317 PE-PilA融合蛋白（10 μg/ml）包被微量滴定板（POLYSORP^TM，Nunc，Thermo Fisher Scientific）。板用NaCl 150mM-聚山梨醇酯20，0.05%（例如，TWEEN^TM 20）洗涤四次，并且用PBS-BSA 1%封闭一至两小时。在四次洗涤后，加入两倍稀释的（12个稀释度）玻连蛋白（来自人血浆的玻连蛋白，SIGMA-ALDRICH^?）（10 μg/ml），并且使板在室温下温育1小时。板随后用NaCl 150mM-聚山梨醇酯20，0.05%（例如TWEEN^TM 20）洗涤4次。在洗涤后，使用过氧化物酶绵羊抗人玻连蛋白（US Biological），随后添加邻苯二胺/H₂O₂底物，来检测结合的玻连蛋白。显示的颜色与固定至玻连蛋白的抗体量成正比。

关于（a）与玻连蛋白结合的LVL317 PE-PilA融合蛋白，参见图23。PilA = 来自NTHi菌株86-028NP的PilA（如对于pRIT16790描述的）；PE = 蛋白E（如对于pRIT16762描述的），以及（b）与玻连蛋白结合的LVL317和LVL735 PE-PilA融合蛋白。

实施例 17：玻连蛋白结合。通过针对LVL291 PE-PilA融合蛋白的抗体抑制玻连蛋白结合。

用PE（来自载体pRIT16762）或纯化的PE-PilA融合蛋白（10 μg/ml）包被微量滴定板（POLYSORP^TM，Nunc，Thermo Fisher Scientific）。板用NaCl 150mM-聚山梨醇酯20，0.05%（例如，TWEEN^TM 20）洗涤四次，并且用PBS-BSA 1%封闭两小时。在洗涤后，玻连蛋白（来自人血浆的玻连蛋白，SIGMA-ALDRICH^?）以50μg/ml添加，并且将纯化的抗体抗PE-PilA（内部产生且纯化的）两倍系列稀释，并且在室温下温育1小时。板然后用NaCl 150mM-聚山梨醇酯20，0.05%（例如，TWEEN^TM 20）洗涤4次。在四次洗涤后，使用过氧化物酶绵羊抗玻连蛋白（US Biological），随后添加邻苯二胺/H₂O₂底物，来检测结合的玻连蛋白。显示的颜色与固定至玻连蛋白的抗体量成正比。

观察到通过针对PE-PilA的多克隆抗体抑制玻连蛋白与PE的结合。

关于通过针对PE-PilA融合蛋白的多克隆抗体的玻连蛋白结合抑制，参见图24。

实施例18：LVL291 PE-PilA融合蛋白的抗原性。ELISA。

在用单价蛋白作为对照的抗原性测试中，验证纯化的LVL291 PE-PilA融合蛋白。在夹心ELISA中测试融合蛋白，所述夹心ELISA用针对PE基因片段（如对于pRIT16711描述的）或来自NTHi菌株86-028NP的PilA（来自载体pRIT16790）生成的多克隆抗体（兔和豚鼠）显色，所述PE基因片段编码SEQ ID NO: 4的氨基酸22 - 160。

PilA或PE以100 ng/ml加入且系列两倍稀释。在30分钟温育后和洗涤后，通过在用PE或PilA免疫后获得的兔多克隆血清检测结合的抗原。使用过氧化物酶抗兔Ig（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.），随后添加邻苯二胺/H₂O₂底物，来检测结合的抗体。显示的颜色与存在的抗原量成正比。使用用于微量滴定板的分光光度计测量吸光度读数。通过与全长PE或全长PilA参考抗原的曲线的比较，确定样品的抗原性且以ug/ml表示。参考表示100%的抗原性。

如表6中观察到的：与单价PE和PilA抗原相比较，用纯化的LVL291 PE-PilA融合蛋白观察到抗原性。

表6：在抗原性测试中用纯化的LVL291 PE-PilA融合蛋白获得的相对抗原性。

实施例19：LVL735 PE-PilA融合蛋白的免疫原性。

在第0、14和28天时，用50 μl含有在AS01_E或AlPO₄（磷酸铝）内配制的1、0.2或0.04 μg PE-PilA融合蛋白LVL317或LVL735的疫苗制剂，通过肌内途径免疫雌性Balb/c小鼠（n = 34）。在第42天时收集的各个血清中确定针对PE和PilA的抗体应答，并且测量针对PE和PilA的IgG水平且以μg /ml表示。

关于针对LVL317和LVL735的PE和PilA抗体应答，参见图27。GMC=几何平均浓度。GMT=几何平均滴度。IC =置信区间。

实施例20：LVL735和LVL317融合蛋白在不可分型的流感嗜血杆菌鼻咽定殖的小鼠模型中的保护功效。

在第0和14天时，用10 μl含有5.8 μg LVL735或LVL317的疫苗制剂鼻内免疫雌性Balb/c小鼠，所述LVL735或LVL317与0.5 μg大肠杆菌不稳定毒素（LT）混合。在第28天时施用5.8 μg非佐剂化的LVL735或LVL317的加强剂量。对照小鼠在第0和14天时用单独的LT且在第28天时用PBS进行疫苗接种。动物在第42天时用5 x 10⁶ cfu的NTHi 3224A菌株进行鼻内攻击。细菌菌落在攻击后1和2天取出的鼻腔中进行计数（n = 10/时间点）。

鼻腔在培养基中匀浆化且执行细菌定量。结果以CFU/ml良好表示。

关于LVL735和LVL317疫苗接种对不可分型的流感嗜血杆菌鼻咽定殖的小鼠模型中的细菌清除的作用，参见图28。

实施例21：包含PE-PilA融合蛋白的多价疫苗制剂

设计了3种疫苗：

10V：含有下述十种肺炎链球菌荚膜糖缀合物的十价（10V）疫苗：缀合至蛋白D的来自血清型1的荚膜糖（1-PD），缀合至蛋白D的来自血清型4的荚膜糖（4-PD），缀合至蛋白D的来自血清型5的荚膜糖（5-PD），缀合至蛋白D的来自血清型6B的荚膜糖（6B-PD），缀合至蛋白D的来自血清型7F的荚膜糖（7F-PD），缀合至蛋白D的来自血清型9V的荚膜糖（9V-PD），缀合至蛋白D的来自血清型14的荚膜糖（14-PD），缀合至蛋白D的来自血清型23F的荚膜糖（23F-PD），缀合至破伤风类毒素的来自血清型18C的荚膜糖（18C-TT），和缀合至白喉毒素的来自血清型19F的荚膜糖（19F-DT）。

12V：含有与10V相同的十种肺炎链球菌荚膜糖缀合物连同下述另外两种肺炎链球菌糖缀合物的十二价（12V）疫苗：缀合至CRM197的19A（19ACRM）和缀合至CRM197的6A（6ACRM）。

12V+蛋白（12V+prot）：含有与12V相同的十二种肺炎链球菌荚膜糖缀合物连同PhtD、dPly和PE-PilA融合蛋白的添加的疫苗。

dPly的制备：如WO2004/081515和WO2006/32499中所述，使用甲醛脱毒，将肺炎球菌肺炎球菌溶血素制备且脱毒。

PhtD的表达和纯化：

PhtD的表达：PhtD蛋白是特征在于三联组氨酸的存在的肺炎球菌三联组氨酸（Pht）蛋白家族的成员。PhtD是838 aa-分子且携带5个三联组氨酸（关于氨基酸序列参见Medlmmune WO00/37105 SEQ ID NO: 4，并且关于DNA序列参见SEQ ID NO: 5）。PhtD还含有在中间的富含脯氨酸区（氨基酸位置348-380）。PhtD具有20 aa-N末端信号序列。PhtD的制备和纯化在WO2007/071710中描述（参见例如实施例1b）。来自WO00/37105的SEQ ID NO:4的氨基酸21-838的序列对应于SEQ ID NO:220。

蛋白D的表达

蛋白D如WO2007/071710中所述进行表达。

CRM197大肠杆菌的表达和纯化：

为了改善CRM197生产过程的得率，用过程得率的10倍增加的靶评估替代表达模式。所选择的构建在大肠杆菌菌株（B834（DE3））中作为融合物进行表达，所述融合物在来自大肠杆菌的Flgl信号序列（19aa）和CRM197（537aa）之间。在转运至周质后切割信号序列。在纯化前通过渗透休克提取CRM197。纯化过程类似于WO2006/100108中公开的那种，除了在Q-Sepharose-XL和羟磷灰石步骤之间添加另外的层析步骤（苯基琼脂糖），并且去除最后一个在辛基琼脂糖4FF上的层析步骤。

缀合物的制备

本领域众所周知如何制备纯化的肺炎球菌多糖。为了这些实施例的目的，多糖基本上如EP072513中所述或通过紧密相关方法进行制备。在缀合前，多糖可以如下所述通过微流化具有一定大小。

活化和偶联条件对于每种多糖是特异性的。这些在表1中给出。将具有一定大小的多糖（除了6B和23F之外）溶解于NaCl 2M、NaCl 0.2M或注射用水（WFI）中。对于所有血清型评估最佳多糖浓度。如下文详述的，除了血清型18C之外的所有血清型均直接缀合至载体蛋白。

从在乙腈或乙腈/水（50%/50%）溶液中的100 mg/ml原液中，将CDAP（1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐）（CDAP/PS比0.5-1.5 mg/mg PS）加入多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M-0.3M NaOH以获得特异性活化pH。多糖的活化在该pH下在25℃下执行3分钟。将纯化的蛋白（蛋白D、CRM197或DT）（数量取决于初始PS/载体蛋白比）加入活化的多糖中，并且在pH调节下，在特定pH下执行偶联反应最高达2小时（取决于血清型）。为了猝灭未反应的氰酸酯基团，随后将2M甘氨酸溶液加入混合物中。将pH调整至猝灭pH（pH 9.0）。将溶液在25℃下搅拌30分钟，并且随后在2-8℃下伴随连续缓慢搅拌温育过夜。

18C的制备：

经由接头 - 己二酸二酰肼（ADH），将18C连接至载体蛋白。

在缀合前使多糖血清型18C微流化。

破伤风类毒素用EDAC（2-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）的衍生

对于破伤风类毒素的衍生，将纯化的TT以25 mg/ml在0.2M NaCl中稀释，并且加入ADH间隔物，以便达到0.2M的最终浓度。当间隔物的溶解完成时，将pH调整至6.2。随后加入EDAC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺），以达到0.02M的最终浓度，并且将混合物在pH调节下搅拌1小时。通过在25℃下将pH增加到最高达9.0至少30分钟停止缩合反应。

随后将衍生的TT渗滤（10 kDa CO膜），以便去除残留ADH和EDAC试剂。

TT_AH（缀合至ADH接头的破伤风类毒素）批次最终无菌过滤，直至偶联步骤，且贮存于-70℃下。

TT_AH与PS 18C的化学偶联

缀合参数的细节可以在表1中找到。

将2克微流化PS在水中以限定浓度稀释，并且通过NaCl粉末添加调整至2M NaCl。

加入CDAP溶液（在50/50 v/v乙腈/WFI中新鲜制备的100 mg/ml），以达到适当的CDAP/PS比。

通过添加0.3M NaOH使pH上升高达活化pH 9.0，并且在该pH下稳定直至TT_AH添加时。

在3分钟后，加入衍生的TT_AH（在0.2 M NaCl中20 mg/ml），以达到TT_AH /PS比2；将pH调节至偶联pH 9.0。溶液在pH调节下静置一小时。

对于猝灭，将2M甘氨酸溶液加入混合物PS/TT_AH/CDAP中。

将pH调整至猝灭pH（pH 9.0）。

将溶液在25℃下搅拌30分钟，并且随后伴随连续缓慢搅拌在2-8℃下过夜。

肺炎链球菌荚膜糖-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件

当“μ流体”在行标题中出现时，它指示糖在缀合前通过微流化具有一定大小。在微流化后的糖大小在表2中给出。

表1肺炎链球菌荚膜糖-蛋白D/TT/DT/CRM197缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条件

注：pHa、c、q对应于分别用于活化、偶联和猝灭的pH。

缀合物的纯化：

使用由0.15M NaCl（除了S500HR用作18C的缓冲液，并且含20mM乙酸盐的1.15MNaCl pH6.2用于19A之外）平衡的Sephacryl S400HR凝胶过滤柱，通过凝胶过滤纯化缀合物，以去除小分子（包括DMAP）以及未缀合的糖和蛋白。基于反应组分的不同分子大小，PS-PD、PS-TT、PS-CRM197或PS-DT缀合物首先洗脱，随后为游离PS，随后为游离蛋白载体，并且最后为DMAP及其他盐（NaCl、甘氨酸）。

通过UV_280 nm检测含有缀合物的级分。根据其Kd合并级分，无菌过滤（0.22μm）且贮存于+2-8℃下。测定缀合物制剂中的PS/蛋白比。

疫苗的配制

10V疫苗含有以1、3、1、1、1、1、1、3、3、1 μg的人剂量一起吸附到磷酸铝上的肺炎链球菌荚膜糖血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F缀合物（糖个别吸附至磷酸铝，随后将它们混合在一起，并且将磷酸铝水平调整至500μg）。

12V疫苗以与10V疫苗相同的方式进行制备，其中添加以2μg的剂量吸附到磷酸铝上的另外血清型19A和6A缀合物。

12V +蛋白疫苗以与12V疫苗相同的方法进行制备，除了添加蛋白PhtD、dPly和PE-PilA之外。PE-PilA如本文描述的进行生产。使用上文对于12V描述的剂量和各30μg剂量的蛋白（注：这指30μg PE-PilA，而不是30μg PE和30μg PilA），将12种缀合物和蛋白混合在一起。

实施例22: 10V、12V和12V+蛋白疫苗在小鼠中的免疫原性比较

抗肺炎球菌多糖PS（多糖）ELISA的描述

用荚膜多糖（CPS）（100 μl/孔的在PBS中的2.5 μg/ml PS1和PS3，5 μg/ml PS4、5、6A、6B、7F、9V或14；10 μg/ml PS19A和23F或40 μg/ml PS18C和PS19F），将微板在37℃下包被2小时。将板用NaCl 150 mM（0.9%）-聚山梨醇酯20 0.05%洗涤三次。将血清在含CPS的PBS-聚山梨醇酯20 0.05%（1 mg CPS/ml未稀释的血清，除了以2.5mg/ml的6A和6B之外）V/V中稀释（对于6A和6B 1/2，并且对于其他血清型1/10），并且在37℃下温育1小时，以中和针对CPS的抗体。将来自如名称为‘三种疫苗制剂在小鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的小鼠的血清或参考（用Chrompure小鼠IgG校准的内部参考）加入微孔中，并且在PBS-聚山梨醇酯20 0.05%中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤）。将板在搅动下在室温下温育30分钟。板如上进行洗涤，并且加入缀合至过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体（100 μl/孔），使板在室温下伴随振荡温育30分钟。在洗涤后，将底物（在10 ml柠檬酸盐0.1M pH 4.5-4.6和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA（邻苯二胺（ortho phenylen-diamine））加入每个孔中（100 μl），并且使板在黑暗中温育15分钟。通过添加HCl 1N（50μl）来停止反应。使用分光光度计，在490nm或用于参考的620nm处阅读吸光度。显示的颜色与血清中存在的抗体量成正比。

测量PD、PE和PilA抗体的ELISA的描述

用100 μl/孔的在碳酸盐缓冲液pH 9.6中的2 μg/ml PD（1 mg/ml）、2 μg/ml PE（1500 μg/ml）、2 μg/ml PilA（3660 μg/ml），将板在4℃下包被过夜。将板用NaCl 0.9% 聚山梨醇酯20 0.05%洗涤四次。对于PE和PilA ELISA，将板用PBS-BSA1%在室温下（伴随振荡）饱和30分钟。在洗涤后，将来自如名称为‘三种疫苗制剂在小鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的小鼠的血清或参考（用Chrompure小鼠IgG校准的内部参考）加入微孔中，并且在PBS聚山梨醇酯20 0.05%（用于PD测定）和PBS 聚山梨醇酯20 0.05% BSA 0.1%（用于PE和PilA测定）中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤）。随后板在室温下伴随搅动温育30分钟。在洗涤后，使板与缀合至过氧化物酶(peroxidaseperoxidase)的抗小鼠IgG抗体（100 μl/孔）一起在室温下伴随振荡温育30分钟。板随后如上进行洗涤，并且将底物缀合物（在10 ml柠檬酸盐0.1M pH 4.5-4.6和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA（邻苯二胺））加入每个孔中（100 μl），在黑暗中15分钟。通过添加HCl 1N 50μl来停止反应，并且在490nm（用于参考的620nm）处阅读吸光度。

测量PhtD和dPly抗体的ELISA的描述

用100 μl/孔的1 μg/ml PhtD（1021 μg/ml）或4μg/ml Ply（367μg/ml），将板在37℃下包被2小时。随后将板用NaCl 0.09% 聚山梨醇酯0.05%洗涤三次。在洗涤后，将来自如名称为‘三种疫苗制剂在小鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的小鼠的血清或参考（用Chrompure小鼠IgG校准的内部参考）加入微孔中，并且在PBS聚山梨醇酯20 0.05%中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤）。板在室温下伴随搅动温育30分钟。在洗涤后，使板与缀合至过氧化物酶的抗小鼠IgG抗体（100 μl/孔）一起在室温下伴随振荡温育30分钟。板如上进行洗涤，并且将底物缀合物（在10 ml柠檬酸盐0.1M ph 4.5和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA）加入每个孔中（100 μl），在黑暗中15分钟。通过添加HCl 1N 50μl来停止反应，并且在490nm（用于参考滤波器的620nm）处阅读吸光度。

调理吞噬测定（OPA）的描述

将血清样品在56℃下加热45分钟，以使任何剩余的内源补体失活。在96孔圆底微量滴定板的每个孔中，将每份1:2稀释的血清样品的二十五微升等分试样在25 μl OPA缓冲液（HBSS（Hank’s平衡盐溶液）–14.4%灭活的FCS（胎牛血清））中进行两倍系列稀释。随后，将以例如4/2/1比（v/v/v）（除了该比为4/2/2的血清型1、6B和6A之外）的活化HL-60细胞（1 × 107细胞/ml）、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体的25 μl混合物加入稀释的血清中，以获得50μl的最终体积。测定板在37℃下伴随定轨振荡（210 rpm）温育2小时，以促进吞噬过程。通过将微板置于冰上至少1分钟来停止反应，板在冰上保持直至使用时。随后将板的每个孔的20μl等分试样转移到96孔平底微板的相应孔内，并且将50μl Todd–Hewitt Broth–0.9%琼脂加入每个孔中。在37℃和5% CO₂下过夜温育后，使用自动化图像分析系统（KS 400，Zeiss，Oberkochen，德国），计数在琼脂中出现的肺炎球菌菌落。不含血清样品的八个孔用作细菌对照，以确定每个孔的肺炎球菌数目。确定对照孔的平均CFU数目，且用于计算每份血清样品的杀死活性。通过能够促进50%肺炎球菌杀死的血清的倒数稀释度，来确定血清样品的OPA滴度。通过使用4参数曲线拟合分析来计算调理吞噬滴度。

三种疫苗制剂在小鼠中的免疫原性

用1/10人剂量的不同制剂，包括单独的蛋白（PhtD、dPly和PEPilA），Prevnar 13（_TM商购可得的链球菌疫苗 – 结果未呈现），10V、12V（DSP2A017）和12V+蛋白（DSP2A012）GMP批次(lots)，在第0、14和28天时，通过肌内（IM）注射免疫在2个实验中分配的2组27只雌性Balb/c小鼠。小鼠接受在不同腿中（模拟在临床试验中婴儿的不同部位处的共施用）1/10人剂量的Infanrix Hexa（_TM疫苗，包含白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳类毒素，丝状血凝素（haemmagglutinin），百日咳杆菌黏附素，乙肝表面抗原，灭活的脊髓灰质炎病毒1、2和3型以及流感嗜血杆菌b糖（PRP））。

在第42天时收集的各个和合并血清中分别测定抗IgG水平和调理吞噬滴度。

评估12V +蛋白疫苗诱导IgG抗体滴度和调理活性的潜力，并且与12V和10V疫苗的那种相比较。

来自用不同制剂注射的小鼠的血清在针对多糖血清型和蛋白的ELISA（如上所述）以及针对12个多糖血清型的OPA中进行测试。

对于大多数血清型，12V +蛋白疫苗诱导与12V相似的应答。

图31中的结果证实对于12V+制剂和不含肺炎链球菌糖缀合物的制剂测量的，在PE、PilA、PhtD、Ply和PD抗体应答之间不存在统计差异。

实施例23：10V、12V和12V+蛋白疫苗在豚鼠中的免疫原性比较

抗肺炎球菌多糖PS的ELISA描述

用100 μl/孔的在PBS中的2.5 μg/ml PS1，5 μg/ml PS4、5、6A、6B、7F、9V或14；10 μg/ml PS19A和23F，40 μg/ml PS18C和PS19F，或用于参考孔的稀释至2μg/ml的Affinipure山羊抗豚鼠IgG（2.4mg/ml），将微板在37℃下包被2小时。将板用NaCl 150 mM（0.9%）-聚山梨醇酯20 0.05%洗涤三次。将来自每组的合并血清在含CPS的PBS-聚山梨醇酯20 0.05%（1 mg CPS/ml未稀释的血清，除了以2.5mg/ml的6A和6B之外）V/V中稀释（对于PS 6A和6B 1/2，并且对于所有其他血清型1/10），并且在37℃下温育1小时，以中和针对CPS的抗体。将来自如名称为‘三种疫苗制剂在豚鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的豚鼠的血清加入微孔中，并且在PBS-聚山梨醇酯20 0.05%中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤），或者加入参考（在PBS-聚山梨醇酯20 0.05%中稀释至0.25μg/ml的Chrompure豚鼠IgG（11mg/ml））。将板在搅动下在室温下温育30分钟。板如上进行洗涤，并且加入缀合至过氧化物酶的抗豚鼠IgG抗体（100 μl/孔），并且使板在室温下伴随振荡温育30分钟。在洗涤后，将底物（在10 ml柠檬酸盐0.1M pH 4.5-4.6和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA）加入每个孔中（100 μl），并且在黑暗中温育15分钟。通过添加HCl 1N来停止反应。使用分光光度计，在490nm（用于参考的620nm）处阅读吸光度。显示的颜色与血清中存在的抗体量成正比。

测量抗PD、PE和PilA抗体的ELISA的描述

用100 μl/孔的在PBS中的碳酸盐缓冲液pH 9.6中的2 μg/ml PD（1 mg/ml）、2 μg/ml PE（1500 μg/ml）或2 μg/ml PilA（3660 μg/ml），或用于参考孔的在PBS中稀释至2μg/ml的Affinipure山羊抗豚鼠IgG（2.4mg/ml），将板在37℃下包被2小时。将板用NaCl 0.9% 聚山梨醇酯20 0.05%洗涤4次。对于PE和PilA ELISA（该步骤对于PD和Ply ELISA不执行），将板用PBS-BSA1%在室温下饱和30分钟。在洗涤后，将来自如名称为‘三种制剂在豚鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的豚鼠的血清或参考血清样品（用Chrompure豚鼠IgG校准的内部参考）加入微孔中，并且在PBS聚山梨醇酯20 0.05%（用于PD ELISA）和PBS 聚山梨醇酯20 0.05% BSA 0.1%（用于PE和PilA ELISA）中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤）。板在室温下温育30分钟。在洗涤后，使板与缀合至过氧化物酶的抗豚鼠IgG抗体（100 μl/孔）一起在室温下伴随振荡温育30分钟。板如上进行洗涤，并且将底物缀合物（在10 ml柠檬酸盐0.1M pH 4.5-4.6和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA）加入每个孔中（100 μl），在黑暗中15分钟。通过添加HCl 1N 50μl来停止反应，并且在490nm（用于参考滤波器的620nm）处阅读吸光度。

测量PhtD和dPly抗体的ELISA的描述

用100 μl/孔的在PBS中的1 μg/ml PhtD（1021 μg/ml）或2μg/ml Ply（376μg/ml），将板在37℃下包被2小时。随后将板用NaCl 0.09% 聚山梨醇酯20 0.05%洗涤4次。在洗涤后，将来自如名称为‘三种疫苗制剂在豚鼠中的免疫原性’的部分中所述免疫的豚鼠的血清或参考（用Chrompure豚鼠IgG校准的内部参考）加入微孔中，并且在PBS聚山梨醇酯20 0.05%中系列稀释100 μl（两倍稀释步骤）。板在室温下伴随搅动温育30分钟。在洗涤后，使板与缀合至过氧化物酶的抗豚鼠IgG抗体（100 μl/孔）一起在室温下伴随振荡温育30分钟。板如上进行洗涤，并且将底物缀合物（在10 ml柠檬酸盐0.1M pH 4.5-4.6 和5 μl H₂O₂中的4 mg OPDA）加入每个孔中（100 μl），在黑暗中15分钟。通过添加HCl 1N 50μl来停止反应，并且在490nm（用于参考滤波器的620nm）处阅读吸光度。

调理吞噬测定

将血清样品在56℃下加热45分钟，以使任何剩余的内源补体失活。在96孔圆底微量滴定板的每个孔中，将每份1:2稀释的血清样品的二十五微升等分试样在25 μl OPA缓冲液（HBSS（Hank’s平衡盐溶液）–14.4%灭活的FCS（胎牛血清））中进行两倍系列稀释。随后，将以例如4/2/1比（v/v/v）（除了该比为4/2/2的血清型1、6B和6A之外）的活化HL-60细胞（1 × 107细胞/ml）、新鲜解冻的肺炎球菌工作种子和新鲜解冻的幼兔补体的25 μl混合物加入稀释的血清中，以获得50μl的最终体积。测定板在37℃下伴随定轨振荡（210 rpm）温育2小时，以促进吞噬过程。通过将微板置于冰上至少1分钟来停止反应（板应在冰上保持直至进一步使用时。随后将板的每个孔的20μl等分试样转移到96孔平底微板的相应孔内，并且将50μl Todd–Hewitt Broth–0.9%琼脂加入每个孔中。在37℃和5% CO₂下过夜温育后，使用自动化图像分析系统（KS 400，Zeiss，Oberkochen，德国），计数在琼脂中出现的肺炎球菌菌落。不含血清样品的八个孔用作细菌对照，以确定每个孔的肺炎球菌数目。确定对照孔的平均CFU数目，且用于计算每份血清样品的杀死活性。通过能够促进50%肺炎球菌杀死的血清的倒数稀释度，来确定血清样品的OPA滴度。通过使用4参数曲线拟合分析来计算调理吞噬滴度。

三种疫苗制剂在豚鼠中的免疫原性

用?人剂量的不同制剂，包括单独的蛋白（PhtD、dPly和PEPilA），Prevnar 13（_TM商购可得的链球菌疫苗 – 结果未呈现），10V、12V（DSP2A017）和12V+蛋白（DSP2A012）GMP批次，在第0、14和28天时，通过肌内（IM）注射免疫在2个实验中分配的2组17只豚鼠。豚鼠接受在不同腿中（模拟在临床试验中婴儿的不同部位处的共施用）?人剂量的Infanrix Hexa（_TM疫苗，包含白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳类毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，乙肝表面抗原，灭活的脊髓灰质炎病毒1、2和3型以及流感嗜血杆菌b糖（PRP）。

在第42天时收集的各个和合并血清中分别测定抗IgG水平和调理吞噬滴度。

评估IgG抗体滴度和调理活性，并且在12V+蛋白、12V和10V疫苗之间进行比较。

来自用不同制剂注射的豚鼠的血清在针对多糖血清型和蛋白的ELISA以及针对制剂中的12个血清型的OPA中进行测试。

12V +蛋白诱导与12V制剂相似的应答。

图34中的结果证实当它们与PEPilA组合时，对12价缀合物的免疫原性不存在负面影响。

用12V +蛋白GMP制剂获得的结果证实10V多糖以及蛋白的免疫原性，并且支持该制剂的临床评估。