小RNA组成的指纹图谱在人卵巢癌诊断和治疗中的应用

摘要

本发明涉及小RNA组成的指纹图谱在人卵巢癌诊断和治疗中的应用，由数个microRNA组成的指纹图谱可非常有效地区分正常卵巢组织和卵巢癌组织，灵敏度高，特异性强，可有效用于卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。

说明书

技术领域

本发明公开了一种小RNA(miRNA；microRNA)指纹图谱在卵巢癌诊断中的用途，属于生物医学、生物工程和检测技术领域。

背景技术

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位(Jemal等人；2011)。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，约占卵巢癌的80%-90%(Chan等人；2006)，其次是恶性生殖细胞肿瘤。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30%，大多数已扩散到子宫，大网膜及盆腔各器官。由于卵巢癌的早期症状不明显，鉴别其肿瘤良性、恶性很困难，只有20%的患者能够在进行早期诊断出来，而近80%的患者就诊时已属晚期(Ahmed等人；1996、Etzioni等人；2003和Wright等人；2009)。

在卵巢癌早期诊断中，CA-125是目前研究最深入、应用最广泛的血清肿瘤标志物，也是普遍使用的早期诊断工具之一，但是此标志物特异性差，而且只能检测30%的早期卵巢癌患者，所以早期诊断依然是卵巢癌的一大难题(Menon等人；2012)。

近年来不断有文献报道miRNA在肿瘤诊断和治疗中的作用，卵巢癌特异性miRNA的发现为其诊断和治疗打开了一个全新的局面。miRNA是一类内源性小分子非编码RNA，结构高度保守，具有表达时序性和组织特异性，通过与靶基因3'非编码区(3'UTR)互补序列特异性结合，导致翻译抑制或者mRNA降解，从而调节基因表达(Bartel；2004和Huang等人；2010)。miRNA在恶性肿瘤中表达谱各异并发挥着重要的调控作用，随着大规模、高通量miRNA检测技术的推广应用，发现新的miRNA不仅为肿瘤的诊断和预后提供了颇具价值的标准，同时也为寻找新的肿瘤生物治疗靶标奠定了基础(Mezzanzanica等人；2010)。

miRNA的表达水平和肿瘤细胞的分化程度密切相关，而常规的mRNA标志物不具备此特点。Bendoraite等人通过qPCR定量卵巢癌细胞中miR-200家族的表达，发现与在其余癌症中报道的miR-200家族明显低表达不同，在卵巢癌细胞中呈现高表达趋势，通过软件预测和3'UTR荧光素酶报告法发现其靶标为ZEB1和ZEB2，且进一步研究发现在卵巢癌发展模式中，卵巢表皮细胞是先从间质到上皮的转移，这点也是与其他癌症是先从上皮转移到间质过程相反(Bendoraite等人；2010)。ZEB转录因子是BMP信号通路的关键阻遏，Peart等人发现BMP信号通路通过调节AKT酶的活性从而达到调控腹水诱导的人类卵巢表皮癌的恶性程度(Peart等人；2012)。Li等人通过对人类转移性浆液性卵巢癌细胞SKOV-3ip和低转移人浆液性卵巢癌细胞SKOV-3做miRNA表达谱芯片和荧光定量PCR验证，发现有多条差异表达的miRNA，特别是miR-22对卵巢癌细胞的转移和侵袭有抑制作用(Li等人；2012)。Xu等人还发现，过表达miR-182和miR-96靶标作用于FHB O3,对于调控卵巢癌细胞的增殖起着显著作用(Xu等人；2013)。Wang和他的团队发现miR-182直接靶标负调节作用于卵巢癌的肿瘤抑制子PDCD4(Wang等人；2013)。Li等人的进一步研究发现，miR-183负调节Tiam1的表达，从而促进卵巢癌细胞的迁移，侵袭和生长(Li等人；2012)。Stark等研究表明，miRNA可以调节肿瘤形成，而且暗示其中的某些簇(如miR-17-92)可能是潜在的人类原癌基因(Stark等人；2010)。

上述这些发现可能会给药物设计和针对性治疗提供一个新的平台。而血清作为肿瘤生物标记物，也是研究的热点。Li等人在2011年发现血清miRNA不受RNase、环境、pH和低温影响的高度稳定性也使得肿瘤患者的实际值与实验所得结果大致一致(Li等人；2012)。miR-21是最早发现的血清miRNA生物标记物。Taylor等人比较了良性卵巢肿瘤血清和不同临床分期卵巢癌血清的外周血小体中miRNA表达谱。研究发现：miR-200,miR-21,miR-141等8条miRNA高表达，而在正常对照人群中未检测到其差异表达(Taylor等人；2008)。因此，在外周血中这8条目标miRNA作为对无明显症状的卵巢癌患者进行筛选，作为潜在的生物标记物。Resnick等人通过芯片法发现卵巢癌病人血清中，21条差异表达的miRNA，进一步通过文献和定量结果发现：miR-21，miR-92，miR-29a，miR-126相对于在正常样本中而言，在卵巢癌血清中是显著高表达的，而miR-155，miR-127，miR-99b则显著低表达，且还发现miR-21，miR-92，miR-93在生化指标CA125正常的卵巢癌患者中显著高表达，反映了miRNA可作为卵巢癌诊断的潜在生物标记物(Resnick等人；2009)。

尽管大量关于卵巢癌治疗的研究，卵巢癌仍难于诊断和有效治疗，患者中观测到的死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防需要改进。

发明内容

本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。

本发明的第一方面，提供一种分离的miRNA，所述的miRNA为：

(ⅰ)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA，其中n为选自1-3的正整数；

(ⅱ)与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA；

(ⅲ)序列如SEQ ID NO:1-3所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；或

(ⅳ)与SEQ ID NO:1-3所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合。

本发明的第二方面，提供一种miRNA集合或组合，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-3所示的3种miRNA。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID NO:1-6所示的6种miRNA所构成。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID NO:1-10所示的10种miRNA所构成。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个小RNA(HSA-MIR-1271-5P、HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P和HSA-MIR-135B-3P)组成的小RNA指纹图谱，用于卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合由序列如SEQ ID NO:1-6和SEQ ID NO:11所示的7种miRNA所构成。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由七个小RNA(hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p和hsa-miR-135b-3p)组成的小RNA指纹图谱，用于上皮性卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。

在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。

在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含序列如SEQ ID NO:12-516所示的miRNA中的两种或两种以上的组合。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括HSA-MIR-1271-5P、HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P和HSA-MIR-135B-3P中的一种或两种以上，用于区分卵巢癌组织和正常卵巢组织。

在另一优选例中，HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌组织中表达下调。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p和hsa-miR-135b-3p中的一种或两种以上，用于区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。

在另一优选例中，HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P和HSA-MIR-135B-3P在卵巢癌组织中表达上调。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括425种在卵巢癌组织和正常卵巢组织中表达倍数差异大于2的miRNA，其中204种上调(hsa-miR-522、hsa-miR-429、hsa-miR-141-5P、hsa-miR-200a、hsa-miR-96-5P、hsa-miR-183-5P、hsa-miR-449c、hsa-miR-205和hsa-miR-182-5P最显著，差异倍数大于10)；221种下调(hsa-miR-202-3p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4760-3p、hsa-miR-4804-5p,hsa-miR-4770、hsa-miR-4781-3p、hsa-miR-4738-5p、hsa-miR-4777-5p、hsa-miR-4696和hsa-miR-4678最显著，差异倍数大于10)；由此区分卵巢癌组织和正常卵巢组织。

在另一优选例中，所述的miRNA集合或组合包括489种在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中表达倍数差异大于2的miRNA，其中241种上调(hsa-miR-522、hsa-miR-429、hsa-miR-96-5P、hsa-miR-205、hsa-miR-141-5P、hsa-miR-183-5P、hsa-miR-200a、hsa-miR-182-5P、hsa-miR-519a、hsa-miR-200c、hsa-miR-449c、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-135b-3p和hsa-miR-1274a最显著，差异倍数大于10)；248种下调(hsa-miR-202-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4777-5p、hsa-miR-4738-5p、hsa-miR-4770、hsa-miR-4789-5p、hsa-miR-4804-5p、hsa-miR-4696,hsa-miR-4760-3p、hsa-miR-4781-3p、hsa-miR-4524-3p、hsa-miR-4759和hsa-miR-4719最显著，差异倍数大于10)；由此区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。

本发明的第三方面，提供一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA。

本发明还提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成第二方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

本发明的第四方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成第一方面所述的miRNA。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向    式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

    式II，

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明还提供一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合包括能被人细胞转录成前体miRNA的多核苷酸，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成第二方面所述的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸集合或组合中的一种或多种多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向    式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

    式II，

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明的第五方面，提供一种载体，它含有第一方面所述的分离的miRNA、或第二方面所述的miRNA集合或组合，或第四方面所述的多核苷酸。

本发明的第六方面，提供第一方面所述的分离的miRNA、或第二方面所述的miRNA集合或组合的用途，其特征在于，用于制备区分正常卵巢组织和卵巢癌组织的芯片或试剂盒。

本发明的第七方面，提供一种miRNA芯片，包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQID NO:1-11所示的部分或全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

互补结合区；和/或

与固相载体相连的连接区。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-3所示的全部序列。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-10所示的全部序列。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-6和11所示的全部序列。在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-11所示的部分或全部序列之外，还特异性地对应于SEQ ID NO:12-516所示的部分或全部序列。

本发明的第八方面，提供第七方面所述的miRNA芯片的用途，用于制备区分正常卵巢组织和卵巢癌组织的试剂盒。

本发明的第九方面，提供一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有第七方面所述的miRNA芯片。

本发明的第十方面，提供一种筛选抗卵巢癌候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在实验组中，在待测物质存在下培养卵巢细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的卵巢细胞；

(b)测定所述实验组中卵巢细胞的一种或多种miR的表达水平，并与对照组中卵巢细胞的miR的表达水平进行比较；

其中，如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miR的表达水平发生了趋向于正常卵巢细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗卵巢癌候选药物。

在另一优选例中，所述的miRNA的序列与第一方面所述的分离的miRNA的序列相同。

在另一优选例中，所述的miRNA为第二方面所述的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的“发生了趋向于正常卵巢细胞的表达水平的变化”指对于某一miRNA而言，满足下式：

Q≤0.6

其中，Q=abs(A1-A0)/abs(A2-A0)

式中，A0为正常卵巢细胞中所述miRNA表达水平；A1为实验组的所述miRNA表达水平；A2为对照组的所述miRNA表达水平。

在另一优选例中，当所述miRNA为卵巢癌上调型(即A2-A0＞0)时，则A1-A0≤0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。在另一优选例中，当所述miRNA为卵巢癌下调型(即A2-A0＜0)时，则A1-A0≥0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。

在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(a)中还包括阳性对照组，即在与所述实验组条件相同且不存在所述待测物质但存在已知抗卵巢癌药物的情况下，培养相同的卵巢细胞；

并且，在步骤(b)中还包括将所述实验组中卵巢细胞的一种或多种miR的表达水平，并与所述阳性对照组中卵巢细胞的miR的表达水平进行比较。

在另一优选例中，所述的卵巢细胞包括正常的卵巢细胞和卵巢癌细胞。

在另一优选例中，所述miR选自：HSA-MIR-1271-5P、HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P、HSA-MIR-135B-3P。

在另一优选例中，所述miR的序列选自SEQ ID NO:1-10。

在另一优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在另一优选例中，所述miR选自：hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p、hsa-miR-135b-3p。

在另一优选例中，所述miR的序列选自SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:11。

本发明基于鉴定相对于正常对照卵巢组织中差异表达的卵巢癌组织或上皮性卵巢癌组织特异miRNA的特征，提出了检测卵巢癌组织和正常组织的小RNA指纹图谱，较佳地本发明提出了三个较佳地为十个或七个小RNA组成的指纹图谱，用于卵巢癌早期诊断、病理分级、分期和预后评价。围绕小RNA的表达可以通过荧光定量PCR反应检测，提供在卵巢癌检测中的应用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为通过SVM模型和留一法交叉验证法对10个选定的miRNA(表2)对卵巢癌区分：A为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，轴表示每个样本的概率，所有组织样本(N=59)被分为两部分，黑色点表示癌症组织，红色为正常组织，错误率为0.03；B为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出结果的ROC曲线图。

图2为7个选定的miRNA比较上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织样本：A表示SVM模型预测概率，53个样本错误为3个(错误率0.06>0.05)；B表示AUC曲线(AUC=0.965)预测miRNA从正常组织中区分出上皮性卵巢癌组织。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次筛选出数个特异性的miRNA，经检验证明，这些特异性的miRNA标志物可非常有效地区分卵巢癌组织及正常卵巢组织。本发明人还首次筛选出数个特异性的miRNA能够非常有效的区分上皮性卵巢癌组织及正常卵巢组织。在此基础上完成了本发明。

miRNA及其前体

本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:11所示的序列，其中n为选自1-11的正整数。

为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含义。

对于本发明所揭示的卵巢癌特异性的miRNA，可以通过常规的miRNA芯片技术进行验证，例如包括用常规方法或常规试剂盒抽提miRNA，然后进行检测。代表性的试剂盒包括(但并不限于)：Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提。

此外，还可通过特异性扩增并检测扩增产物(或相应的荧光信号等可检测信号)来检测或验证本发明的卵巢癌特异性的miRNA。优选的高灵敏度和高特异性的的技术包括(但并不限于)：CN10267663A中所公开的技术。通常，所用引物的特异性结合区可根据所需检测的已知miRNA的序列进行设计，优选地扩增时所用引物的特异性结合区通常是与miRNA完全互补的互补序列。

反义寡核苷酸

根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。

将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向    式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

    式II，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

miRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种miRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种miRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的miRNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分正常卵巢组织和卵巢癌组织。

本发明的所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQID NO:1-11所示的序列中的至少1种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种)。

具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science,1997;278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将步骤(1)得到的RNA与所述的miRNA芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测步骤(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于区分正常卵巢组织和卵巢癌组织。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。扩增液中还可含有荧光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的试剂盒中还可包括引物。

另外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的有益之处在于：

(1)本发明提供了一类可用于区分卵巢癌组织如上皮性卵巢癌及正常卵巢组织的新的miRNA指纹图谱；

(2)本发明的miRNA指纹图谱，可非常有效地区分卵巢癌组织如上皮性卵巢癌及正常卵巢组织，灵敏度高、特异性强；

(3)本发明的miRNA指纹图谱，可有效用于卵巢癌如上皮性卵巢癌诊断、肿瘤分级和预后评价。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

样本的收集和信息分析

样本遵循上海中山医院伦理委员会批准，并在病人知情同意书签字情况下，按照上海中山医院组织库收集方法获得。总共63例组织样本从病人身体中移除并存储于-80℃，样本信息见表1。用于生物统计分析的组织采集14例正常的卵巢组织样本与45例肿瘤样本，其中包括39例上皮性卵巢癌样本和6例上皮性的边缘卵巢癌组织样本。

表1样本信息

实施例2

总RNA抽提

从冰冻或新鲜动物组织切取小于50mg的碎片，称重，剩余的组织液氮速冻。

切取的碎片匀浆后，参照miRNeasy MiniKit(Qiagen，217004)说明书，抽提总RNA。

电泳检测质量，用紫外分光光度法测定OD_260nm和OD_280nm，计算RNA浓度。-80℃保存。

实施例3

加PolyA尾并反转录

将上述实施例2抽提得到的总RNA用含有0.1%Tween-20(Sigma)的0.1x RNA储存缓冲液(Ambion、USA)稀释成125ng/ul。

用盛元公司生产的miRNA cDNA合成盒(盛元公司产品编号：9000004)为miRNA加上PolyA的尾，并且反转录为cDNA。具体步骤为：

将1.5ml离心管置于冰上，加入66微升浓度为125ng/ul的总RNA，33微升盛元公司生产的miRNA cDNA合成反应液I(盛元公司产品编号：9000005)11微升盛元公司生产的miRNA cDNA合成反应液II(盛元公司产品编号：9000006))，和去核酸酶的超纯水至165微升。总RNA量的终浓度为50ng/ul，轻柔混匀后分装入3个0.2ml的PCR管，每管50ul。1000rpm离心10s后放入ABI9700PCR仪进行反应，反应程序：37℃15min，25℃25min，37℃30min，85℃5min，4℃保持。

取出PCR管，将3管RT产物合并，震荡离心后-20℃保存或者直接用于qPCR反应。

实施例4

荧光定量PCR检测

采用CN10267663A中所公开的方法检测小RNA。

在15毫升的离心管中加入141微升实施例3得到的反转录产物，10542微升的荧光定量PCR酶反应液(盛元公司产品编号：9000008，2x Universal qPCR Master MixHigh Rox)，4076微升去核酸酶超纯水(盛元公司产品编号：9000015)，轻柔混匀。

将盛元公司生产的小RNA反应模板，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-A v1.0(盛元公司产品编号：1000002)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-B v1.0(盛元公司产品编号：1000003)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-C v1.0(盛元公司产品编号：1000004)，Sharpvue^TMHuman miRNA Array-D v1.0(盛元公司产品编号：1000005)，Sharpvue^TMHuman miRNAArray-E v1.0(盛元公司产品编号：1000006)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(Thermo、ST16R，转头型号：M-20)。共1757个小RNA反应液，每个反应模板上有3对阳性对照和1个空白对照。小心解开封膜。

将前述步骤得到的混合液倒入加样槽中，使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入到上述小RNA反应模板中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。

使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心5min。

放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃2min，后运行96℃5s，60℃1min，3个循环；之后96℃5s，60℃5s，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为SYBR，参比荧光设为Rox。

收集数据，进行生物信息学分析。

实施例5

miRNA生物统计数据的计算分析

小RNA数据分析图表通过使用R和Bioconductor软件包进行分析。在检测的1722个miRNA和两个内参对照(HSA-RNU6B和HSA-RNU48)，发现在检测的63例组织样本中，每个miRNA的ct值和平均值被差减背景、归一化，对1696种miRNA进行进一步的分析。为了去除样品中RNA加入量的差异，分位数-median函数的分析方法用于处理原始的ct值(Sing等人；2005)，我们对卵巢微阵列数据进行全部中值归一化。此过程使随后的统计分析去除了两个上皮性卵巢癌组织样本，一个上皮性的边缘卵巢癌组织样本，以及一个正常的上皮性卵巢组织样本。

在随后的统计分析，45例卵巢癌(39例上皮性卵巢癌组织和6例上皮性的边缘卵巢癌组织)与14例正常卵巢组织之间的miRNA比较差异表达的miRNA通过使用t检验分析所得，倍数变化2以上的被称为差异表达。

差异表达的miRNA通过使用三种计算机算法：支持向量法(SVM,Bioconductor package“e1071”)，KNN算法(Bioconductor package“class”)和对角线线性判别分析法(Bioconductorpackage“sfsmisc”)，算法的性能采用留一交叉验证程序，对不同数量的预测标志物进行初步评估。对每一组训练样本中，miRNA基于卵巢癌组织和正常卵巢组织比较产生的t检验值和p值进行排名。前n的miRNA(n为2和50之间的阈值范围)被用来构建基于对训练样本的信息应用得到其余的测试样本的预算模型中。挑选FDR调整的p值低于0.1，差异变化倍数变化大于2的miRNA。

结果如表1-表5、图1和图2所示。

miRNA的命名是根据miRBase Version20的miRNA数据库，在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。

表1：卵巢癌组织诊断倍数变化2以上差异表达的425种miRNA序列及表达情况

本发明各表格中参数具体如下：miRID=根据miRBase version20命名的小RNA；LogFC为倍数变化的对数值；Ave.Expr为评价表达值；Adj.P.Val为调整的P值。Log FC(CE+CB vs.Normal)为(上皮性卵巢癌组织和上皮性的边缘卵巢癌组织.VS正常卵巢组织.)的2为底的倍数变化对数值；Log FC(CE vs.Normal)为(上皮性卵巢癌组织.VS正常卵巢组织.)的2为底的倍数变化对数值。

表1示出在卵巢癌组织和正常卵巢组织中miRNA的显著差异表达，425种miRNA在卵巢癌组织中表达倍数大于2，其中204种上调(hsa-miR-522、hsa-miR-429、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-200a、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-449c、hsa-miR-205和hsa-miR-182-5p最显著)；221种下调(hsa-miR-202-3p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4789-5p和hsa-miR-4760-3p最显著)。

表2示出在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中miRN显著差异表达，489种miRNA在卵巢癌组织中表达倍数大于2，其中241种上调(hsa-miR-522、hsa-miR-429、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-205、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-200a和hsa-miR-182-5p最显著)；248种下调(hsa-miR-202-3p、hsa-miR-4778-5p、hsa-miR-4711-3p、hsa-miR-4510、hsa-miR-4777-5p和hsa-miR-4738-5p最显著)。

表2：上皮性卵巢癌组织诊断倍数变化2以上差异表达的489种miRNA序列及表达情况

根据表3中miRNA分析结果发现，利用荧光定量PCR的方法检测45例卵巢癌(C)组织(包括39例上皮性卵巢癌(CE)组织和6例上皮卵巢癌交接(CB)组织)和14例正常卵巢(N)上皮组织的1696个小RNA表达(hsa-RNU6B和hsa-RNU48作为内参)，发现十个小RNA组成的指纹图谱(HSA-MIR-1271-5P和HSA-MIR-574-3P在卵巢癌组织中表达下调；HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P和HSA-MIR-135B-3P在卵巢癌组织中过表达)，可以更好地理解卵巢癌的发生和发展机制，并在卵巢癌诊断中的潜在用途。如图1所示，此指纹图谱检测的灵敏度为97%，特异性为92%，AUC曲线值为0.978。

表3卵巢癌诊断中十个小RNA组成的指纹图谱表达情况

根据表4中miRNA实验分析结果还发现七个小RNA组成的指纹图谱(hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p和hsa-miR-135b-3p)能区分上皮性卵巢癌组织和正常组织样本，如图2所示，此指纹图谱检测的灵敏度为97%，特异性为85%，AUC曲线值为0.965。

表4上皮性卵巢癌诊断中七个小RNA组成的指纹图谱表达情况

根据表5所示的结果，还发现两个miRNA簇MIR183-96-182(HSA-MIR-182、HSA-MIR-183和HSA-MIR-96-5P)和MIR200家族(HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR200A，B，C和HSA-MIR-429)在卵巢癌组织样本中有显著升高，暗示这些小RNA参与了卵巢癌的发展。

表5HSA-miR-183-96-182家族和HSA-miR200家族在卵巢癌中表达情况

以上实施例显示miRNA在人类卵巢癌组织中异常表达，由十个miRNA组成的指纹图谱，可以很好的区分卵巢癌组织和正常卵巢组织，由7个miRNA(其中有6个小RNA和10个小RNA中的6个是一样的)组成的指纹图谱，可以很好地区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。

进一步地实验表明，采用hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p和hsa-miR-182-5p组成的指纹图谱，也可以用于区分卵巢癌组织和正常卵巢组织，检测的灵敏度大于为90%，特异性大于80%。

实施例6

卵巢癌特异性miRNA标志物的验证

对于随机挑选的50个卵巢组织样本（包括来自25个正常人和25个卵巢癌患者），用实施例5中确定的如下miRNA实验组进行检测。

实验组一：HSA-MIR-1271-5P、HSA-MIR-574-3P、HSA-MIR-182-5P、HSA-MIR-183-5P、HSA-MIR-96-5P、HSA-MIR-15B-5P、HSA-MIR-182-3P、HSA-MIR-141-5P、HSA-MIR-130B-5P、HSA-MIR-135B-3P；

实验组二：hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-1468-5p、hsa-miR-135b-3p；

实验组三：hsa-miR-183-5p、hsa-miR-96-5p和hsa-miR-182-5p。

结果表明：上述三组均能检测出80%以上的卵巢癌组织样本，25个正常卵巢组织样本未被错检。

另外，实验组二可以很好地区分上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：上文讨论的参考文献和以下参考文献在提供示例性程序的细节或补充文本提到的参考文献的其他细节方面，特别通过引用并入本文。

Jemal A,Bray F,Center MM,Ferlay J,Ward E,等人(2011)Global cancer statistics.CACancer J Clin61:69-90.

Chan JK,Cheung MK,Husain A,Teng NN,West D,等人(2006)Patterns and progress inovarian cancer over14years.Obstet Gynecol108:521-528.

Ahmed FY,Wiltshaw E,A'Hern RP,Nicol B,Shepherd J,等人(1996)Natural history andprognosis of untreated stage I epithelial ovarian carcinoma.J Clin Oncol14:2968-2975.

Etzioni R,Urban N,Ramsey S,McIntosh M,Schwartz S,等人(2003)The case for earlydetection.Nat Rev Cancer3:243-252.

Wright JD,Shah M,Mathew L,Burke WM,Culhane J,等人(2009)Fertility preservationin young women with epithelial ovarian cancer.Cancer115:4118-4126.

Menon U,Kalsi J,Jacobs I(2012)The UKCTOCS experience--reasons for hope?Int JGynecol Cancer22Suppl1:S18-20.

Bartel DP(2004)MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function.Cell116:281-297.

Huang Y,Shen XJ,Zou Q,Zhao QL(2010)Biological functions of microRNAs.BioorgKhim36:747-752.

Mezzanzanica D,Bagnoli M,De Cecco L,Valeri B,Canevari S(2010)Role of microRNAsin ovarian cancer pathogenesis and potential clinical implications.Int J Biochem Cell Biol42:1262-1272.

Peart TM,Correa RJ,Valdes YR,Dimattia GE,Shepherd TG(2012)BMP signallingcontrols the malignant potential of ascites-derived human epithelial ovarian cancer spheroids viaAKT kinase activation.Clin Exp Metastasis29:293-313.

Xu X,Dong Z,Li Y,Yang Y,Yuan Z,等人(2013)The upregulation of signal transducerand activator of transcription5-dependent microRNA-182and microRNA-96promotes ovariancancer cell proliferation by targeting forkhead box O3upon leptin stimulation.Int J Biochem CellBiol45:536-545.

Wang YQ,Guo RD,Guo RM,Sheng W,Yin LR(2013)MicroRNA-182promotes cellgrowth,invasion,and chemoresistance by targeting programmed cell death4(PDCD4)in humanovarian carcinomas.J Cell Biochem114:1464-1473.

Li J,Liang S,Jin H,Xu C,Ma D,等人(2012)Tiam1,negatively regulated by miR-22,miR-183and miR-31,is involved in migration,invasion and viability of ovarian cancer cells.Oncol Rep27:1835-1842.

Taylor DD,Gercel-Taylor C(2008)MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes asdiagnostic biomarkers of ovarian cancer.Gynecol Oncol110:13-21.

Bendoraite A,Knouf EC,Garg KS,et al:Regulation of miR-200family microRNAs andZEB transcription factors in ovarian cancer:evidence supporting a mesothelial-to-epithelialtransition.Gynecol Oncol116:117-25,2010

Stark MS,Tyagi S,Nancarrow DJ,et al:Characterization of the Melanoma miRNAome byDeep Sequencing.PLoS One5:e9685,2010

Li H,Guo L,Wu Q,et al:A comprehensive survey of maternal plasma miRNAs expressionprofiles using high-throughput sequencing.Clin Chim Acta413:568-76,2012

Resnick KE,Alder H,Hagan JP,et al:The detection of differentially expressed microRNAsfrom the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol112:55-9,2009

Sing T,Sander O,Beerenwinkel N,Lengauer T(2005)ROCR:visualizing classifierperformance in R.Bioinformatics21:3940-3941.