一种检测HLA-B*13:01等位基因的多重实时荧光PCR方法

摘要

本发明研发出适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*13:01等位基因的特异性引物探针组合，主要包括：F1：5’-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3’R1：5’-GAGCCACTCCACGCAGTC-3’F2：5’-ACAGGGGCTAACGCAGA-3’R2：5’-CAACACCACAACCATCAAG-3’Probe1：5’-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG-BHQ2-3’Probe2：5’-CY5-ATACATCCGTGCTTCATTGTCAC-BHQ2-3’；并基于此提供了一种快速、简便、高通量、高特异性检测该等位基因的方法。

说明书

技术领域

本发明属于药物基因分析领域，具体涉及一种针对HLA-B*13:01等位基因的特异性引物及探针设计，以及检测方法。

背景技术

麻风病是一种由分歧杆菌引起的一种慢性的具有较低传染性的疾病。主要累及皮肤及外周神经，严重者可致容貌毁损和肢体畸残。世界卫生组织曾提出在上世纪末全球消灭麻风的宏伟计划，虽然取得了相当显著的成绩，但至今麻风仍是一个重要的公共健康问题。麻风在世界上流行已接近3000年，印度、埃及和中国被认为是世界三大麻风疫源地。在我国，麻风已经流行了两千多年，20世纪40年代初应用砜类药物治疗麻风证明有效后，使麻风的治疗进入了化学治疗的年代，在几十年的临床实践中，又相继发现了数种有效的抗麻风药物。过去曾用单一药物治疗，疗期很长，后来陆续发现有耐药病例出现，而且耐药发生率在不断增加，说明单一药物治疗麻风病不够理想。因此，世界卫生组织根据结核病化疗的经验和马耳他采用多种药物联合化疗治疗麻风病的经验，于1982年推荐用MDT方案治疗麻风病，使麻风病的治疗又发展到一个一个新的阶段，即从单一药物治疗转入多种药物化疗，使麻风病的治疗期缩短了不少。联合化疗的药物通用的有3种，即氨苯砜、利福平和氯法齐明。但是，据报道有大约2％的麻风患者在服用氨苯砜后会出现药物不良反应，其中致死率高达12.5％。通常在临床上诊断氨苯砜过敏综合征(DIHR)的标准有发热、皮疹、淋巴结病和肝炎，氨苯砜过敏综合征通常还伴随着低血红蛋白症、胆汁阻塞及肝功能疾病。

人类主要组织相容性复合体(HLA)，是迄今为止人类多态性最高的区域之一，HLA定位于人类第6号染色体的短臂6p21.3，是一群紧密连锁的复等位基因群。包括220多个基因，总长度达到3600kb，约占人类基因组总长度的1/3000。HLA在人类的免疫调节中起着非常重要的作用。其中，Ⅰ类基因(HLA-A,HLA-B，和HLA-C)以及Ⅱ类基因(HLA-DR,HLA-DQ,和HLA-DP)与抗原传递的调节有关，并且在免疫系统的肽呈递上起着重要的作用。1973年，Brewerton等人研究结果表明HLA-B*27与强直性脊柱炎的发生有明显的统计学关联。2004年Chung等的研究发现了HLA-B*15:02与卡马西平用药所引起的史蒂文森-综合征有关。越来越多的结果表明HLA等位基因和一些药物引发的过敏性炎症有关，并且在2012年Nicholas等的研究表明HLA-B*13:01与氨苯砜用药所引起的氨苯砜过敏综合征(DIHR)有明显的统计学关联。因此，在对病人进行氨苯砜用药之前进行HLA-B*13:01等位基因的筛查是非常有意义的。

目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要包括PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链反应)，PCR-SSOP(序列特异性寡核苷酸探针分型)和PCR-SSP(序列特异性引导的聚合酶链式反应)。

其中PCR-SBT法是对于HLA等位基因进行测序，从而确定具体的HLA等位基因亚型，但其检测的操作繁琐、耗时长、成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不适合对于临床样本的快速指导。PCR-SSP技术则需要进行凝胶电泳实验、PCR后处理，因此该技术在操作过程中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而造成假阳性结果。目前基于RT-PCR方法检测HLA-B*13:01等位基因的试剂盒较少，而且操作繁琐，要多管反应，容易出现假阳性和污染，远远不能满足快速、简便、高特异性检测HLA-B*13:01等位基因的需求。

目前已知HLA-B等位基因的亚型已达到3600多种，基于HLA等位基因的多态性，在设计HLA-B*13:01等位基因特异性引物和探针之前，必须将HLA-B*13:01等位基因序列与HLA-B其他等位基因序列进行比对，其中将HLA-B*07:02:01等位基因作为基础序列参照。根据序列比对结果，发现HLA-B*13:01与多个HLA-B等位基因都具有很高的同源性，尤其是HLA-B*13系列的等位基因，而这些针对HLA-B*13:01等位基因特异性的位点分布在多个外显子和内含子区域中。

发明内容

本发明研发出两套适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*13:01等位基因的引物和探针组合；在已有的实时定量PCR检测HLA等位基因的基础上，提供了一种更加快速、简便、高通量、高特异性并且稳定检测HLA-B*13:01等位基因的方法。这样，能够为麻风患者服用氨苯砜后出现严重皮肤不良反应的可能性的判断提供有意义的参考，有利于氨苯砜的个体化用药。

本发明通过比对HLA-B的等位基因序列发现HLA-B*13:01相对于其他HLA-B等位基因的特异性位点，主要在Intron2、Exon3和Intron5上。为了保证HLA-B*13:01等位基因检测的特异性，至少需要设计两对特异性引物和探针，其中第一对特异性引物和探针分布在内含子2和外显子3具有特异性位点的区域上，第二对特异性引物和探针分布在内含子5具有特异性位点的区域上，将两对特异性的引物和探针放置在同一反应管中进行PCR反应，最终扩增出来的HLA等位基因只有HLA-B*13:01。因此，检测待测样本时，当同时出现第一对和第二对特异性引物、探针的扩增曲线时，说明此样本携带HLA-B*13:01等位基因。

本发明设计的HLA-B*13:01特异性的引物探针组合包括：

第一条上游引物F1：5’-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3’(序列1)

第一条下游引物R1：5’-TCCTTGCCGTCGTAGGCT-3’(序列2)

探针Probe1：5’-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG-BHQ2-3’(序列5)

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

第二条上游引物F2：5’-CACAGGGGCTAACGCAGA-3’(序列3)

第二条下游引物R2：5’-CCCAACACCACAACCATCAAG-3’(序列4)

探针Probe2：5’-CY5-ATACATCCGTGCTTCATTGTCAC-BHQ2-3’(序列6)

其中CY5为：Cyaine5

一种检测HLA-B*13:01等位基因TaqMan探针实时荧光PCR法，主要包括以下环节：

(1)针对HLA-B*13:01特异性的引物和探针组合，即权利要求1所述的引物和探针：并设计内参基因的引物和探针：

(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；

(3)在同一个反应体系中将待测样本基因组DNA与HLA-B*13:01特异性的引物和探针以及内参基因的引物和探针按一定的比例混合；

(4)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System 480进行实时荧光PCR检测，其中分别利用FAM、HEX/VIC和CY5通道进行三通道荧光采集；

(5)分析判断待测样本是否携带HLA-B*13:01等位基因。

基于以上方案，本发明还做了如下优化：

环节(1)中内参基因ACTB的引物和探针为：

上游引物F：5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’(序列7)

下游引物R：5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’(序列8)

探针Probe：5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-TAMRA-3’(序列9)

使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，所述反应体系以20μL计，则包括：10μL Premix Ex Taq(2×),HLA-B*13:01特异性第一条上游引物F1：125nM,第一条下游引物R1：125nM，第一条特异性探针probe1:100nM。第二条上游引物F2：125nM,第二条下游引物R2：125nM,第二条特异性探针probe2:100nM，以及ACTB基因特异性的上游引物250nM，下游引物250nM及其对应的探针100nM，最后用水补充到20μL最终体积。扩增程序：95℃预变性30s，95℃5s～10sec,64℃34s～40s，共计35～40个循环。

本发明的主要优点有：

1、节省耗材和时间、简单易行、高通量

本发明将目的基因与内参基因的引物和探针放置在同一反应管中进行反应，在很大程度上节省时间及实验耗材，整个检测过程可在2小时内全部完成。将本发明与HLA等位基因分型的“金标准”PCR-SBT测序法进行方法学的对比，100例样本结果完全吻合。同时使用本发明可一次同时高通量进行96例或384例样本进行检测，因此，可完全使用本发明进行HLA-B*13:01的检测，适用于临床分子诊断。

2、结果可靠、灵敏度高

只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的HLA-B*13:01基因分型检测，相比与传统的PCR-SSP技术，大大提高了检测的灵敏度。其中，最低检测样本量可达到0.08ng。

3、检测方法灵活、无污染

本发明方法较传统的HLA等位基因分型方法，未涉及多重扩增、重复开盖等二次污染的可能。本发明可直接根据探针的荧光曲线判断扩增产物，不涉及任何对人体有毒害作用的化学试剂，操作简便、耗时短、安全、无污染。

4、成本低、经济适用

由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术适用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，用以判断麻风患者服用氨苯砜后出现严重过敏综合反应的概率，较经济适用。

附图说明

图1为利用内参基因(Target3)的引物与探针对人基因组DNA实时扩增结果。FAM-1为阳性样本(携带HLA-B*13:01等位基因)；FAM-2为阴性样本(不携带HLA-B*13:01等位基因)；NTC表明此实验无污染；本图说明此发明所用的阳性样本和阴性样本质量可靠。

图2为分别利用HEX/VIC和CY5通道进行荧光采集的实时扩增结果，其中HLA-B*13:01probe1为HEX/VIC荧光通道所进行的扩增结果；HLA-B*13:01probe2为CY5荧光通道所进行的扩增结果；NTC扩增曲线表明实验无污染。

图3为利用FAM通道、HEX/CY5通道和VIC通道进行多通道荧光采集的实时扩增结果。其中FAM-1、HEX/VIC-1、CY5-1为阳性样本的扩增曲线；FAM-2、HEX/VIC-2、CY5-2为阴性样本的扩增曲线；NTC扩增曲线表明此实验无污染。

图4为HLA-B*13:01标准阳性样本DNA系列稀释后实时扩增曲线，样本系列稀释倍数分别为1:5(10ng/μL)，1:25(2ng/μL)，1:125(0.4ng/μL)，1:625(0.08ng/μL)，1:3125(0.016ng)；。其中未携带HLA-B*13:01等位基因的阴性样本及NTC在灵敏度检测反应中作为对照。

具体实施方式

本发明将实时定量PCR与扩大阻滞突变系统ARMS(Amplification refractory mutationsystem)结合起来，针对HLA-B*13:01区别于其它HLA-B等位基因的特异性位点，分别在Intron2、Exon3以及Intron5上设计引物和探针，值得注意的是，这两组特异性的引物和探针能够排除其他HLA-B等位基因的结合、识别，尤其是与其相似性特别高的HLA-B*15等位基因。本发明将两个特异性的引物和探针系统和一个内参基因的引物和探针系统放在同一个反应管里进行扩增，这样大大提高了检测通量，同时克服了操作繁琐，成本高的缺点。

实施例一TaqMan探针法检测HLA-B*13:01等位基因

1、DNA样本的提取及稀释

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A_260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H₂O将样本稀释至10ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA-B*13:01的特异性引物及探针，上游引物Fp1：5’-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3’，下游引物Rp1：5’-TCCTTGCCGTCGTAGGCT-3’，以及配套的荧光探针probe1:5’-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG–BHQ2-3’；上游引物Fp2：5’-CACAGGGGCTAACGCAGA-3’，下游引物Rp2：5’-CCCAACACCACAACCATCAAG-3’，以及配套的探针Probe2:5’-CY5-ATACATCCGTGCTTCATTGTCAC-BHQ2-3’，另外在ACTB基因上设计内参基因，上游引物ACTB-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物ACTB-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’，以及配套的荧光探针Probe:5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’。

其中HEX为：6-carboxy-hexachlorofluorescein，CY5为Cyanine5，FAM为：6-carboxyfluorescein，BHQ2为Black Hole Quencher-2。

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(ACTB)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用HEX/VIC、CY5和FAM通道进行三通道荧光采集；

使用10μL Premix Ex Taq(2×),HLA-B*13:01特异性第一条上游引物F1：125nM,第一条下游引物R1：125nM，第一条特异性探针probe1:100nM。第二条上游引物F2：125nM,第二条下游引物R2：125nM,第二条特异性探针probe2:100nM，以及ACTB基因特异性的上游引物250nM，下游引物250nM及其对应的探针100nM，最后用水补充到20μL最终体积。扩增程序：95℃预变性30s，95℃5s～10sec,64℃34s～40s，共计35～40个循环。

4、结果分析

内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到曲线，则判断待测样本携带HLA-B*13:01等位基因。本发明中，有荧光扩增曲线达到阈值以上，则代表该目的片段的特异性引物及探针与DNA模板结合，并且引物能够顺利延伸，引物覆盖区域碱基序列与模板序列一致，且探针覆盖范围内碱基也与模板序列一致。

实施例二HLA-B*13:01特异性引物灵敏度的检测

1、DNA样本的稀释

取HLA-B*13:01标准品DNA作为试验样品，其浓度为10ng/μL。用PCR等级的H₂O5倍连续稀释样品，即1:5，1:25，1:125，1:625，1:3125；其DNA浓度分别为：10ng/μL，2ng/μL，0.4ng/μL，0.08ng/μL，0.016ng/μL。

2、设计引物和探针

在多态性位点集中的区域，利用ARMS方法设计HLA-B*13:01的特异性引物，上游引物Fp1：5’-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3’，下游引物Rp1：5’-TCCTTGCCGTCGTAGGCT-3’，以及配套的荧光探针probe1:5’-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG–BHQ2-3’；上游引物Fp2：5’-CACAGGGGCTAACGCAGA-3’，下游引物Rp2：5’-CCCAACACCACAACCATCAAG-3’，以及配套的探针Probe2:5’-CY5-ATACATCCGTGCTTCATTGTCAC-BHQ2-3’，另外在ACTB基因上设计内参基因，上游引物Actin-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’，下游引物Actin-R:5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’，以及配套的荧光探针Probe:5’-FAM-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC–BHQ2-3’。

其中HEX为：6-carboxy-hexachlorofluorescein，CY5为Cyanine dyes 5，FAM为：6-carboxyfluorescein，BHQ2为Black Hole Quencher-2。

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因的引物、探针同时加入一个管中，分别利用HEX/VIC、CY5和FAM通道进行三通道荧光采集；使用10μL Premix Ex Taq(2×),HLA-B*13:01特异性第一条上游引物F1：125nM,第一条下游引物R1：125nM，第一条特异性探针probe1:100nM。第二条上游引物F2：125nM,第二条下游引物R2：125nM,第二条特异性探针probe2:100nM，以及ACTB基因特异性的上游引物250nM，下游引物250nM及其对应的探针100nM，最后用水补充到20μL最终体积。扩增程序：95℃预变性30s，95℃5s～10sec,58℃34s～40s，共计35～40个循环。

4、实验结果

HLA-B*13:01标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图4。由图4可见，标准阳性样品系列稀释倍数1:5(10ng/μL)，1:25(2ng/μL)，1:125(0.4ng/μL)，1:625(0.08ng/μL)，1:3125(0.016ng)，综合HEX/VIC荧光通道和CY5荧光通道的最低检测值，可知本发明检测灵敏度为至少需要0.016ng DNA左右的样本。

验证实验：100例样本进行SBT测序与HLA-B*13:01基因检测方法比较

从4个不同民族中，将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序，并且测序结果用表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1