一种人源NKp80-Fc融合蛋白及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用

摘要

本发明公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次包含信号肽、IgG1的Fc段和NKp80的胞外结构域NKp80ED，本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法及其在提高NK细胞的杀伤活性、抑制肿瘤的生长等方面的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫学领域，主要涉及能在肿瘤免疫治疗中发挥重要 作用的活性蛋白及其制备和用途。具体而言，本发明涉及人源NKp80-Fc 融合蛋白及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)是重要的天然免疫细胞，能通过释放杀伤性颗 粒以及细胞因子杀伤肿瘤细胞。NK细胞缺陷会导致免疫监视功能缺失， 进而促进肿瘤的发生及逃逸。NK细胞识别并且靶向杀伤肿瘤细胞依赖于 NK细胞表面的活化性受体。NK细胞的活化性受体可以与肿瘤细胞上的配 体识别，进而活化NK细胞，杀伤肿瘤细胞。NK细胞表面的活化性受体包 括CD16，2B4，NKG2D，CD226以及自然杀伤性受体(包括NKp30、NKp44 和NKp46等)。近来的研究表明NKp80也是一种重要的NK细胞活化性受体， 几乎表达于所有NK细胞表面，与其配体AICL(activation-induced C-type  lectin，活化诱导的C型凝集素)结合后能迅速活化NK细胞，杀伤肿瘤。

AICL作为NKp80目前为止唯一的特异性配体，其主要表达于恶变的造 血细胞上，尤其是恶性的骨髓细胞，比如急性骨髓性白血病(AML)和慢性 骨髓性白血病(CML)细胞，此外还表达于恶性上皮肿瘤细胞和黑色素瘤细 胞。研究表明AICL的表达肿瘤细胞对NKp80阳性的NK细胞敏感，因而 NKp80-AICL的识别将成为一个重要的免疫治疗靶点。

长期以来，单克隆抗体已被广泛的应用于肿瘤治疗，例如，利妥昔单 抗与赫赛汀都取得了较好的治疗效果。这些单克隆抗体都是识别肿瘤细胞 的特异性分子，进而通过活化补体导致肿瘤被杀伤。此外，部分人源化抗 体还可以与NK细胞上的CD16分子作用，通过抗体介导的细胞毒作用 (ADCC)来杀伤肿瘤细胞。但遗憾的是，在许多白血病的治疗中，并未开 发出有效的治疗性抗体。鉴于AICL选择性表达于恶变的造血细胞上，尤其 是恶性的骨髓细胞上，而且目前尚没有靶向AICL分子的治疗性抗体。所以， 我们制备了能够靶向AICL的NKp80-Fc融合蛋白，该蛋白利用肿瘤细胞高 表达的AICL分子作为靶点，通过NK细胞的ADCC作用来杀伤肿瘤细胞， 为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。

发明内容

本发明提供一种融合蛋白NKp80-Fc。

本发明提供一种基于NKp80-Fc的肿瘤治疗方法

本发明的目的在于提供一种NKp80-Fc融合蛋白，具体而言，能靶向 肿瘤细胞表面AICL分子从而杀伤肿瘤细胞的融合蛋白。

本发明的又一个目的是提供本发明的NKp80-Fc融合蛋白的制备方 法。

本发明的又一个目的是提供本发明NKp80-Fc融合蛋白在NK细胞的 肿瘤免疫治疗中的应用。

本发明的融合蛋白能与肿瘤细胞表面的AICL配体特异性结合，其可 以用人工合成方法合成，也可以将所述融合蛋白的重组基因片段插入到真 核表达载体中，然后用所述重组载体转染宿主细胞，并进行培养、表达和 纯化，从而用基因工程方法生产。

上述的肿瘤细胞指的是各种人来源的AICL阳性的肿瘤细胞，例如， 但不限于各种恶性骨髓性的细胞如急性骨髓性白血病以及慢性骨髓性白 血病细胞等。

本发明提供活性成分是上述NKp80-Fc融合蛋白的抑制肿瘤细胞生长 的药物。

上述药物可包括一种或多种药学上可接受的载体。

上述载体可以是稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和/或润滑剂。

上述药物均可以按照药学领域的常规方法制备出以下剂型：注射液和 冻干粉针。

由于AICL选择性高表达于多种肿瘤细胞，特别是恶性的骨髓细胞， 而且目前尚没有可利用的靶向AICL分子的治疗性抗体，本发明将能够提 供一种能够靶向AICL分子的治疗性融合蛋白，并且这一融合蛋白能够在 肿瘤免疫治疗中起到显著作用。

本发明的融合蛋白均以正常人体中的蛋白为模板设计，对人体几乎没 有副作用。

本发明的蛋白可采用现有的常规方法制备，技术成熟。这些都是本发 明相对于现有技术的有益技术效果。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次包含信号肽、IgG1的 Fc段和NKp80的胞外结构域NKp80ED。

2.根据1所述的融合蛋白，其中所述NKp80ED的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示。

3.根据1所述的融合蛋白，其中所述IgG1的Fc段的氨基酸序列如 SEQ ID NO:3所示。

4.根据1所述的融合蛋白，其中所述信号肽是IL-2分子的信号肽， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5.根据1所述的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。

6.核酸，所述核酸编码根据1-5中任一项所述的融合蛋白，所述核酸 具有例如如SEQ ID NO:8所示的核酸序列。

7.载体，所述载体包含根据6所述的核酸。

8.根据1-5中任一项所述的融合蛋白、根据6所述的核酸和根据7所 述的载体在制备药物中的用途，所述药物用于提高NK细胞杀伤肿瘤细胞 的能力。

9.根据8所述的用途，其中所述肿瘤细胞是AICL阳性肿瘤细胞，例 如白血病细胞。

10.药物组合物，所述药物组合物包含根据1-5中任一项所述的融合 蛋白和药用载体。

附图说明

图1，NKp80-Fc在单克隆细胞株细胞培养上清中的表达。

图2，NKp80-Fc能特异性结合肿瘤细胞表面的AICL配体。

图3，NKp80-Fc能有效促进NK细胞与肿瘤细胞的结合。

图4，NKp80-Fc能促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。

图5，NKp80-Fc能抑制肿瘤细胞的生长。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只 是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验 试剂均为市售产品。

实施例所用仪器如下：移液器购自法国Gilson公司，超净工作台购自 上海智城仪器公司，CO₂恒温培养箱购自美国Thermo Fisher公司，离心机 购自德国Hettich公司，PCR仪购自Biometra公司，蛋白核酸检测仪购自 上海泸西分析仪器厂，荧光显微镜购自Olympus公司，流式细胞仪购自 BD公司，γ射线计数器购自中科大中佳公司。

实施例1、NKp80-Fc融合蛋白的制备

1.NKp80-Fc融合蛋白的设计

NKp80是一个二型跨膜糖蛋白，其胞外端包含有一个C型凝集素结 构域(C-Type Lectin Domain,CTLD)，与NKG2D同属于NKC编码的活化 性C型凝集素样受体家族。其蛋白序列包含232个氨基酸，分子量为26,666 Da，其中胞内段包含从1-38aa共38个氨基酸，跨膜段包含从39-59aa共 21个氨基酸，胞外端则包含从60-232aa共173个氨基酸。其中胞外端从 121-231aa共111个氨基酸是一段C型凝集素结构域(CTLD)，这段结构域 包含了C型凝集素受体共有的六个保守的半胱氨酸残基。

根据GenBank数据库中的NKp80的基因数据，我们得到NKp80全基 因的编码序列(参考NCBI Reference Sequence：CCDS41750.1)。基于NKp80 的二级结构以及功能域的分析，我们选取了NKp80胞外端66-231aa共166 个氨基酸的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其DNA编码序列如 SEQ ID NO:2所示)作为融合表达的NKp80胞外端(NKp80ED)。由于 NKp80胞外端结构域位于C端，所以我们设计的NKp80-Fc融合蛋白需要 将Fc置于N端位置才不会影响NKp80结构域发挥功能。为了能实现对人 源肿瘤细胞的功能检测，我们选择了人IgG1的Fc段作为融合表达的另一 个重要组成部分。我们参考了EMBL数据库中hIgG1-Fc全基因编码序列 (EMBL Database Coding：AAC82527.1)以及UniProtKB/Swiss-Prot数据库 中hIgG1-Fc蛋白氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot Database：P01857.1)， 从上述数据库中我们可以得到，hIgG1-Fc蛋白质氨基酸序列共包含330个 氨基酸，我们选取了CH2+CH3+Hinge Sequences，即其中100-330aa共231 个氨基酸的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其DNA编码序列如 SEQ ID NO:4所示)。

为了实现可溶性表达我们选择了在N端连接入信号肽序列，我们选择 IL-2分子的信号肽来协助NKp80-Fc融合蛋白的分泌，以便融合蛋白在翻译 完后能够被信号肽序列导出至内质网腔而使蛋白分泌出来。我们参考了 UniProtKB/Swiss-Prot数据库中Interleukin-2蛋白氨基酸序列 (UniProtKB/Swiss-Prot Database：P60568)。我们选择了前20个氨基酸组成 的IL-2信号肽(IL-2ss)序列作为融合蛋白的N端信号肽分子，其氨基酸序列 如SEQ ID NO:5所示，其DNA编码序列如SEQ ID NO:6所示。至此，我们 选定了组成融合蛋白的基本DNA编码序列和蛋白质氨基酸序列。我们利用 RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中提取出NKp80ED和hIgG1-Fc的cDNA 模板，然后利用分子克隆方法将NKp80ED和hIgG1-Fc的编码序列分别克隆 出来，并且利用重叠延伸PCR技术将两段序列拼接起来，然后将IL-2ss序 列克隆至N端，至此IL-2ss-hIgG1Fc-NKp80ED融合蛋白基因的基本框架构 建成功，其核酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO:7所示。

进一步我们建立了NKp80-Fc的真核表达载体的构建策略。我们利用 pcDNA3.1Hygro(+)真核表达载体(购于Life Technologies公司)上多克隆位 点(MCS)进行IL-2ss-hIgG1Fc-NKp80ED基因片段的克隆，测序并验证含有 IL-2ss-hIgG1Fc-NKp80ED基因片段的重组质粒。将得到的重组表达质粒转 染入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)(购于ATCC: No.CCL-61)，通过有限稀释方法和一定浓度的G418抗生素筛选得到阳性 CHO-Fc-NKp80单克隆细胞株。

2.NKp80-Fc融合蛋白的表达及纯化

我们首先通过流式以及免疫印迹结果确定了不同的CHO-Fc-NKp80 单克隆细胞株表达NKp80-Fc融合蛋白阳性比例，并选择高表达融合蛋白 的六种单克隆细胞株D1、D3、D4、D7、D9和D10进行NKp80-Fc蛋白 分泌表达的进一步鉴定。

由于融合蛋白最终需要分泌出细胞外，我们对这六种单克隆细胞株进 行了培养上清的最终检测。为了避免牛血清蛋白对分泌蛋白NKp80-Fc后 续纯化的影响，我们使用了无血清的CD-CHO细胞培养基(购于Life  Technologies公司)对这六种单克隆细胞株进行培养。我们首先取等量的六 种单克隆细胞株进行铺板，用无血清培养基CD-CHO进行44和48小时两 个时间点的培养，然后取等量的六种单克隆细胞上清作为样品使用抗 hIgG1-Fc的特异性抗体(购于Sigma-Aldrich公司)进行Western Blot鉴定， 结果如图1所示，无血清培养后六种CHO-Fc-NKp80单克隆细胞株只有四 种(D1、D7、D9和D10)能有效分泌NKp80-Fc融合蛋白。其中我们选择了 CHO-Fc-NKp80D1单克隆细胞株作为制备融合蛋白的主要细胞来源。

我们进一步检测发现CHO-Fc-NKp80D1单克隆细胞株在40-52小时 的培养时间段内随时间增加其表达分泌NKp80-Fc融合蛋白量也随之增 加，所以随后我们对CHO-Fc-NKp80D1单克隆细胞株进行了大规模培养 后分别使用有血清以及无血清培养的条件培养48-52小时之后收集培养上 清后进行蛋白浓缩，之后使用Protein A亲和层析柱对浓缩上清进行纯化， 得到不同批次的纯度较高的NKp80-Fc融合蛋白。

以上所述的将构建好的IL-2ss-hIgG1Fc-NKp80ED基因片段构建到真 核表达载体中并在宿主细胞中进行真核表达以及纯化的方法仅是示例性 的，本领域技术人员了解本发明的基因片段IL-2ss-hIgG1Fc-NKp80ED还 可以构建到其他本领域常用的真核表达载体中，并可将所述重组载体转入 常用的宿主细胞中进行表达，并且采用常规方法对本发明的融合蛋白进行 纯化，这些同样可以解决本发明的技术问题并实现本发明的技术效果。其 中所涉及的方法和技术都是本领域技术人员熟知的。

实施例2、NKp80-Fc融合蛋白的细胞结合活性检测

为了评估根据实施例1制备并纯化的NKp80-Fc融合蛋白的生物学活 性，我们首先检测了融合蛋白结合NKp80特异性配体AICL分子的能力。 由于NKp80配体AICL分子能够高表达于白血病细胞上，我们利用两种白 血病细胞系U937(人组织细胞白血病细胞系)(购于ATCC:CRL-1593.2)和 THP-1(人单核细胞白血病细胞系)(购于ATCC:No.TIB-202)以及一种实 体瘤细胞系HeLa(人宫颈癌细胞系)(购于ATCC:No.CCL-2)来检测融合 蛋白结合能力。考虑到U937细胞和THP-1细胞上可能的FcγR(CD32和 CD64)的表达可能结合NKp80-Fc融合蛋白的Fc段而导致检测结果出现假 阳性，我们首先将这三种细胞与足量的人IgG蛋白进行孵育以封闭Fc受 体(CD32和CD64)，然后与纯化的NKp80-Fc融合蛋白共孵育，进一步利 用荧光偶联的抗hIgG1-Fc的特异性抗体进行标记后，FACS检测蛋白标记 效果。

阳性U937细胞比例的统计结果如图2所示，不管是有血清还是无血 清培养的条件下收集并纯化的NKp80-Fc融合蛋白，随着标记浓度的增加， U937细胞的标记率也相应增加，而且无血清培养条件下的NKp80-Fc融合 蛋白的标记效率比有血清培养条件下要高很多。

同时，我们检测了不同培养条件下的NKp80-Fc融合蛋白(有血清 NKp80-Fc(a)以及无血清NKp80-Fc(b))与不表达AICL分子的HeLa细胞的 结合情况，结果如图2所示，无论是有血清还是无血清培养来源的 NKp80-Fc融合蛋白都不能结合HeLa细胞，说明NKp80-Fc融合蛋白结合 肿瘤细胞具有AICL表达的特异性。

实施例3、NKp80-Fc融合蛋白促进NK与肿瘤细胞结合的检测

我们将新鲜分离的人NK细胞和肿瘤细胞U937分别用荧光标记的抗 CD56(购于BD Biosciences公司)和抗CD33的抗体(购于BD Biosciences 公司)进行标记，将CD33标记的肿瘤细胞U937与五组不同批次纯化的 NKp80-Fc融合蛋白(Grp1-Grp5)预先孵育，与CD56标记的新鲜分离的NK 细胞以效靶比(E:T)2:1混匀后，置37℃条件下孵育10min，将孵育完成的 效靶细胞固定后进行流式检测，以CD56+CD33+双阳性细胞在CD56+阳 性细胞中的所占比例展示细胞结合率。检测结果如图3所示，相比对照IgG 组的25％左右的结合率，NKp80-Fc融合蛋白明显提高了NK细胞与肿瘤 细胞之间的结合率，达35-43％。

实施例4、NKp80-Fc融合蛋白增强NK对肿瘤细胞杀伤功能的检测

为进一步检测NKp80-Fc融合蛋白对NK细胞最终杀伤效应的影响， 我们使用4小时Cr⁵¹释放法来检测NK细胞对U937细胞的杀伤活性。我 们分别使用无血清培养条件下获得的NKp80-Fc融合蛋白以及对照IgG与 NK细胞在孵育45分钟后，再与放射性元素Cr51标记的U937细胞以效 靶比(E:T)4:1和1:1的比例混合，再在37℃下共孵育4小时。通过检测细 胞上清中的放射性CPM值来检测NK细胞杀伤活性，从而来判断 NKp80-Fc融合蛋白对NK细胞杀伤肿瘤细胞活性的影响。结果如图4所 示，NKp80-Fc融合蛋白能够显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。 这种增强作用在效靶比为4:1时尤为明显。

实施例5、NKp80-Fc融合蛋白抑制异体移植模型中肿瘤细胞的生长

为进一步验证NKp80-Fc融合蛋白在体内对肿瘤细胞生长的影响，我 们建立了肿瘤移植模型来检测肿瘤细胞的生长状况。取6-8周龄 NOD-SCID小鼠(购于北京维通利华公司)，对每只鼠腋下进行皮下接种 2.0x10⁶个U937细胞。3天后将无血清纯化的NKp80-Fc融合蛋白与对照 hIgG以0.1mg/ml的终浓度与新鲜分离的2.0x10⁶个NK细胞混合后皮下注 射至肿瘤细胞接种部位。在小鼠接种肿瘤细胞26天后对皮下肿瘤进行分 离以及拍照观测，并对肿瘤体积和重量进行检测统计。结果如图5所示， 与未处理组相比，接种NK能够明显抑制肿瘤的生长，而且与hIgG+NK 细胞组相比，NKp80-Fc+NK组抑制肿瘤的生长的效果更为明显。这提示 了NKp80-Fc融合蛋白在分子靶向的肿瘤免疫治疗中的具有较好的应用前 景。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地 显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求 书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细 节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。