平卧菊三七中绿原酸类成分的分离和含量测定方法

摘要

本发明公开了两种平卧菊三七浸膏中绿原酸、新绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法。步骤如下：a、确定最佳色谱条件；b、取新绿原酸、绿原酸、三种异绿原酸对照品，加甲醇制成对照品溶液；c、取平卧菊三七浸膏，加甲醇，过滤，得样品；d、分别精密吸取对照品与样品溶液，色谱进样，测定绿原酸、新绿原酸和三种异绿原酸的含量；e、或b中只制备绿原酸对照品溶液，以绿原酸为对照，异绿原酸C、异绿原酸A、异绿原酸B、新绿原酸相对校正因子分别为1.21、1.12、1.07、0.92，测定五种物质的含量。本发明以绿原酸为参照，建立其与其他成分之间的fk/s，并计算各成分的量，外标和一测多评法准确性和可靠性相当，这为更真实评价平卧菊三七质量提供了全新模式。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药质量控制领域，具体涉及平卧菊三七浸膏的质量检测方法，更具 体地，涉及平卧菊三七浸膏中绿原酸、新绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法。

背景技术

平卧菊三七(Gynura procumbens(Lour.)Merr)俗称帕崩板，为菊科菊三七属多年 生草本植物，药食兼用，具有广泛的药理作用，《傣医药》记载帕崩板“散瘀、消肿、 活血生肌”，在我国周边的东南亚民族地区，它还用于降糖降脂、抗肝癌、解脏毒和保 护肠道。民间常将嫩茎叶作蔬菜食、作茶饮，作为新食品原料(原卫生部公告2012年 第8号)，其在广东、江西等地有规模化的种植。已知成分包括绿原酸(朱玉婷廖为明， 郑国栋，张清峰.平卧菊三七中绿原酸提取及纯化工艺的优化.湖北农业科 学.2012,51(19).)、咖啡酸、黄酮、生物碱、萜烯、香豆素类等。现有文献报道了其中绿 原酸的提取及纯化工艺，对于平卧菊三七中其他绿原酸类似成分的研究尚未有涉及，且 目前未见其质量标准的相关报道，因此，申请人分离制备各成分，同时建立HPLC法测 定各成分含量。

利用传统外标法测定多指标需要对照品的种类多、数量大、价格昂贵，有文献提出 一测多评的多指标的质控模式(何兵，刘艳，杨世艳，张燕.HPLC一测多评法同时测 定双青咽喉片中10种成分.中草药，2013，08(44):974-981.)，以廉价易得的对照品为内 标，以该成分与其他成分的相对校正因子(f_k/s)，来计算其他成分的量。本实验以绿原酸 为参照物，建立其与其他成分之间的f_k/s，并计算各成分的含量，与采用外标法的结果 进行对比，来验证一测多评的准确性和可靠性。这为更真实评价平卧菊三七质量提供了 全新模式。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的首先在于提供了一种分离制备平卧菊三 七中绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的HPLC方法；

基于上述HPLC方法，本发明进一步提供了两种平卧菊三七中绿原酸、新绿原酸和 三种异绿原酸的定量测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

本发明用制备型高效液相色谱法分离平卧菊三七中单体成分，利用液质联用、核磁 共振法鉴定其结构。建立能准确测定其成分含量的HPLC方法，从平卧菊三七中分离纯 化绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C，其中异绿原酸A、B和 C首次从本属植物中分离。在此基础上，以绿原酸为对照，计算相对校正因子，建立“一 测多评”法，相对校正因子的耐用性良好，一测多评法与外标法对比结果无显著差异。 所建立的含量测定方法可用于同时测定平卧菊三七提取物中5种绿原酸类成分。

在制备体系中，申请人对比了乙腈-水和乙腈-0.1v/v％三氟乙酸水溶液系统，结果采 用乙腈-0.1v/v％三氟乙酸水溶液洗脱系统在高浓度进样情况下，洗脱分离效果最好，理 论塔板数最高，节省了成本；在分析体系中，乙腈-0.1v/v％三氟乙酸水溶液洗脱体系未 能使异绿原酸A、异绿原酸B与异绿原酸C之间有效分离，而使用乙腈-0.1w/v％(w/v 的单位是g/mL)磷酸水溶液洗脱体系使得各单体分离度高。同时比较了超纯水、98v/v％ 甲醇、50v/v％甲醇三种提取溶媒，结果50v/v％的甲醇效果更优。

单独测定药材中成分含量耗时、耗力、效率低下、成本高，已不能满足中药材质量 研究的需求，同时测定多种成分含量的方法成为质量控制的有效方法之一，本发明所建 立的条件为绿原酸类极其相似的成分的分离提供了参考。

随着平卧菊三七的应用逐步增多，仅控制其中绿原酸的含量显然不能真实地评价药 物的内在质量，而采用一测多评法，在一定线性范围内，成分的量与检测器响应成正比， 通过使用一种常见对照品同时测定其他四种成分的含量，能全面而真实地评价平卧菊三 七的质量。

附图说明

图1为实施例1中步骤1.3所得到的HPLC图谱，其中，1为新绿原酸；2为绿原 酸；3为异绿原酸B；4为异绿原酸A；5为异绿原酸C。

图2为实施例2中的混合对照品(A)及样品(B)的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明方法进行详细说明。

实施例1 平卧菊三七中绿原酸类成分的分离鉴定

1平卧菊三七浸膏样品的制备

1.1浸膏样品制备平卧菊三七产自广东，由中科院武汉植物园张炳坤老师鉴定。 取干燥茎(0.5㎏)粉碎，每次加入5L的80v/v％乙醇，85℃下回流提取1h，共提取3 次，合并提取液并浓缩干燥，浸膏(密度1.40g/L)得率为18.5％。将浸膏溶于50v/v％ 的甲醇(浸膏与50v/v％的甲醇的比例为0.1g：1mL)，用0.45μm微孔滤膜过滤，以供 制备使用。

再将上述实验重复操作3次，共得到四批浸膏，批号分别为2012/6/14、2012/6/20、 2012/6/21，2012/9/6供后续实验使用。

1.2制备色谱与质谱条件

1.2.1色谱条件：DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱仪，色谱柱为WATERS  C₁₈-MS-Ⅱ色谱柱(10×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1v/v％三氟乙酸(B)， 梯度洗脱：0～40min，5％～38％A(v/v％)，40～45min，38％～5％A(v/v％)，流动相流 速3.0mL/min，进样量500μL，检测波长326nm；柱温：30℃。

1.2.2质谱条件：毛细管温度320℃，雾化器压力20Pa，源电压5KV，总电流100μA， 干燥器温度320℃，干燥气流速10L/min，检测方式为MSⁿ(n＝1～3)，全扫描质谱。质 量扫描范围M/Z 100～600。

1.3分离纯化过程

在1.2.1色谱条件下进样，色谱图见图1，收集1～9号峰的馏分，经过旋转蒸发，冻 干，得到9种棕色粉末，2号样品量>50mg，3号样品量为5mg，4号样品54mg，5 号样品32mg，其它均低于1mg。

1.4绿原酸类化合物结构鉴定

化合物3号、4号、5号，均为浅棕色粉末，三者¹H-NMR、¹³C-NMR峰信号极其 相似，应为同分异构体，[M-H]^﹣离子的m/z为517，[M-H]^﹣离子的MS²丰度较大的离 子m/z为353、191、179和135，¹H-NMR(400MHz，in CH₃DO)中有两组反式烯烃信 号[δ7.50(1H,d,J＝16.0Hz)，7.46(1H,d,J＝16.0Hz)，6.25(1H,d,J＝16.0Hz)，6.15(1H, d,J＝16.0Hz)]，存在具有奎宁酸在1,3,5-三取代的苯环质子所具有的特征信号[δ7.04 (2H,brd,J＝1.9Hz)，6.99(2H,brd,J＝8.1Hz)，6.78(2H,brd,J＝8.0,1.9Hz)]；化合物 4具有奎宁酸H-3,H-5在δ5.21(2H,m)特征信号，H-4在相对高场的δ3.84(1H,brd) 特征质子信号，奎宁酸结构中两个亚甲基的氢信号在高场位置δ2.13(2H)，2.14(2H) 有特征信号。而化合物5，奎宁酸H-3,H-4的特征信号在δ4.98(2H)，5.33(2H)，而 H-5的质子信号在相对低场位置δ4.18(1H,brd)，结合碳谱可推测二者皆为二咖啡奎宁 酸类，推测化合物分子式为C₂₅H₂₄O₁₂，计算不饱和度为14。通过与文献核磁数据对比， 可知4号样为异绿原酸A(3,5-二咖啡酰基奎宁酸)，3号、4号、5号的碳谱、氢谱、 质谱图都极其类似，3号为异绿原酸B(3,4-二咖啡奎宁酸)，5号样为异绿原酸C(4,5- 二咖啡奎宁酸)。

1号峰和2号峰，其MS谱中，[M-H]^﹣的m/z为353，MS²谱中丰度较大的离子峰 为m/z为191、164、135，其中191为奎宁酸碎片离子峰，164为咖啡酸碎片离子峰， 135为咖啡酸脱一分子水后碎片离子峰，两者为同分异构体，通过与标准品对比可判断， 较高的2号色谱峰为绿原酸，1号为新绿原酸。

实施例2 外标法测定绿原酸、新绿原酸和三种异绿原酸含量的方法

2.1分析色谱条件

DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱仪；DIONEX C18色谱柱(250nm×4.6mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1w/v％磷酸水溶液(B)(w/v的单位是g/mL)，梯度洗脱： 0～65min，9％～27％A(v/v％)；65～70min，27％～9％(v/v％)A；时间为70min，体积 流量1.0mL/min，进样量10μL，检测波长326nm，柱温30℃。

2.2溶液制备

2.2.1样品制备

精密称取实施例1中浸膏100-250mg，于10mL容量瓶中，加9mL 50v/v％甲醇， 于超声仪中20-40KHz超声15-30min，放冷，加50v/v％甲醇至刻度摇匀，过0.45μm 滤膜，即得样品溶液。

2.2.2混合对照品溶液制备

采用中国2010年版附录VIII M水分测定法第一法A测得平卧菊三七浸膏 (2012/6/14)、绿原酸对照品、新绿原酸对照品、异绿原酸A对照品、异绿原酸B对照 品、异绿原酸C对照品含水量分别为9.46％、6％、5.85％、11.94％、13.53％、6.12％。

称取新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品3.30、6.12、 5.96、6.56、7.88mg置于10mL容量瓶中，加入50v/v％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀， 制成质量浓度分别为0.31、0.57、0.58、0.63、0.74mg/mL的混合对照品溶液，过0.45μm 微孔滤膜备用。

2.2.3系统适应性实验

在2.1色谱条件下进行分析，混合对照品溶液及样品溶液(2012/9/6、2012/6/21、 2012/6/20、2012/6/14图谱无明显区别，故以2012/6/14图谱为代表)的结果分别见图2A 和图2B。绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C与其相邻的色谱峰的分离度 均大于1.5，拖尾因子在1.00-1.20之间，理论塔板数以各色谱峰计均在10000以上，新 绿原酸因极性过大，分离效果稍差，但因其含量相对其他成分极少，故未进一步优化。

2.2.4线性关系考察

精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mL，分别置于10mL 容量瓶中，加50v/v％甲醇定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，在2.1色谱条件 下进样，记录色谱峰面积。以对照品质量浓度为纵坐标(Y)，以峰面积为横坐标(X)， 绘制标准曲线，进行线性回归，回归方程及线性范围见表1。结果表明，各对照品在各 自质量浓度范围内线性关系良好。

表1 线性关系考察结果

2.2.5精密度实验

精密吸取2.2.2制备的混合对照品溶液，在2.1色谱条件下重复进样6次，进样体积 为5或10μL，以对照品峰面积计算，新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、 异绿原酸C峰面积的RSD分别为3.21％0.06％、0.18％、0.14％、0.08％。

2.2.6稳定性实验

取样品溶液(2012/9/6)分别在0、2、4、6、12、24小时进样，测得新绿原酸、绿 原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为5.51％、0.30％、0.35％、 1.75％、0.73％，表明样品在24小时内稳定。

2.2.7重复性实验

取同一批次平卧菊三七浸膏(均按实施例1中1.1的方法制备而得，(2012/6/21) 约500mg，平行称定6份，制备样品溶液6份，分别测得新绿原酸、绿原酸、异绿原酸 A、异绿原酸B、异绿原酸C质量分数的RSD分别为3.78％、1.40％、2.76％、2.11％、 2.07％。

2.2.8加样回收率实验

取已测定新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C含量的平卧菊 三七浸膏(2012/6/21)，精密称定，每份同时加入一定量的新绿原酸、绿原酸、异绿原 酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，制备样品溶液9份，在2.1色谱条件下，新绿 原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C平均回收率分别为109.9％、101.36％、 93.9％、104.2％、105.9％，RSD分别为1.12％、0.59％、1.03％、1.22％、1.01％。

2.2.9样品含量测定

取不同批号的平卧菊三七浸膏，按照本实施例中的方法，在2.1色谱条件测定样品 中五种绿原酸成分的含量，结果见表2。

表2 平卧菊三七浸膏中5种成分含量测定结果

实施例3一测多评法方法学考察

1相对校正因子的计算在实施例2的基础上，以多个质量浓度点计算相对校正因 子(f_k/s)，计算公式：f_k/s＝(C_s×A_k)/(C_k×A_s)，待测成分质量浓度计算公式：C_k′＝(C_s×A _k′)/(f_k/s×A_s)，其中C_s为参照物质量浓度，A_s为参照物色谱峰面积，C_k为其他对照组质量 浓度，A_k为其他对照色谱峰峰面积，C_k′为待测组分质量浓度，A_k′为待测组分色谱峰峰 面积，结果见表3。

表3 以绿原酸为参照物的f_k/s(多点校正法)

2校正因子重现性考察

本实验考察了不同实验室的2套色谱系统DIONEXUltiMate 3000和Agilent1100， 及不同色谱柱DIONEX C₁₈、WATERS C₁₈对f_k/s的影响，其RSD＜3.12％。表明在不 同实验室、不同色谱系统和不同色谱柱下具有良好的重现性。

3待测组分色谱峰定位

3.1利用相对保留时间(RT)差定性：知道内标峰的保留时间，加上相对保留时间 差，再根据峰形判断，既能够正确判断出目标峰的准确位置。利用绿原酸与最后一个高 峰的异绿原酸C，两点校正，推导其校正方程，以DIONEX C₁₈、WATERS C₁₈分离的绿 原酸和异绿原酸C保留时间为自变量X，其他色谱柱测定的绿原酸和异绿原酸C的实 测保留时间为因变量Y，可快速推导其校正方程。再将分离的各成分的保留时间带入方 程，即可算得各成分在其他仪器和色谱柱分离的理论出峰时间对应的色谱峰，即可快速 初步定为色谱峰。(何兵，刘艳，杨世艳，张燕.HPLC一测多评法同时测定双青咽喉片 中10种成分.中草药，2013，08(44):974-981.)

3.2一测多评法与外标法结果比较：分别精密吸取对照品和实施例2中2.2.9样品 10μL在实施例2的2.1项色谱条件下进样测定，记录新绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、 异绿原酸B、异绿原酸C的峰面积，采用外标法和一测多评法计算其含量。结果见表4， 可见一测多评在平卧菊三七的多指标成分质量评价中应用是可行的。

表4 两种方法中四个组分在样品(浸膏)中的含量测定结果