抗结核药物及抗结核药物筛选方法

摘要

本发明涉及式Ⅰ所示的抗结核药物以及抗结核药物筛选方法。本发明以丙氨酸消旋酶为靶点，建立了抗结核药物筛选模型，并利用该模型筛选出具有应用前景的抗结核药物。本发明还涉及含有式Ⅰ所示的抗结核药物的组合物，以及式Ⅰ所示的抗结核药物用于制备预防或治疗结核病的药物的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及抗结核药物以及抗结核药物筛选方法，本发明还涉及 含有该抗结核药物的组合物，以及该抗结核药物用于制备预防或治疗 结核病的药物的用途。

背景技术

近年来结核病感染人数逐年攀升，2012年全球结核病新增860万人， 结核病死亡人数约130万人^[1]；中国是高结核病负担国家，多药耐药结 核病以及与HIV结合感染情况的增加，使结核病疫情的防控面临着更 为严峻的挑战。快速研发新型抗结核药物解决结核病治疗所面临的难题 成为控制结核病疫情的当务之急。

针对已经确认的靶点寻找全新结构抗结核新药是最快捷而有效的 途径。丙氨酸消旋酶（alanine racemase，ALR）是已经确认的抗结核 药物靶点，该酶可以催化L-丙氨酸与D-丙氨酸之间相互转化^[2，3]。D-丙 氨酸是菌体细胞壁中肽聚糖合成的必需前体物质，而自然界中只存在天 然来源的L-丙氨酸，因此L-丙氨酸进入菌体后必须通过ALR的催化作用 生成D-丙氨酸，用于细胞壁的合成^[4]。

ALR广泛存在于原核细胞中，且在不同的生物体中的相似性较高， 氨基酸序列覆盖率为35%-50%，在部分细菌中存在两个编码基因alr和 dadX，而结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的基因组 中只存在一个ALR的编码基因alr^[5]。由于人体细胞中不存在ALR，所以 针对ALR靶点的抗菌药物在人体中具有高度的选择性。

ALR属于5-磷酸吡哆醛（pyridoxal5’-phosphate,PLP）依赖型的 异构酶家族，其活性构型是由两个43kD的单体组合而成的二聚体结构， 每个单体中含有两个活性结合位点：即PLP结合位点和丙氨酸结合位 点[⁶]，已经发现的ALR抑制剂中多数是以PLP结合位点为靶点的竞争 性抑制剂，由于原核生物中PLP依赖型的酶普遍存在^[7-8]，所以以ALR 为靶点的药物很可能是多靶点的。目前，作用于ALR的抗结核药物D- 环丝氨酸（D-cycloserine,DCS）已应用于临床，但DCS对ALR的抑 制活性偏低，且DCS对人体有较大的毒副作用^[9]，对于DCS的结构改 造也没有明显的改善其毒性^[10-11]。因此，针对ALR靶点建立新的抗结 核药物筛选模型以及寻找不同作用机制的新型抗结核药物具有重要的 意义。

发明内容

本发明的发明人通过大量实验和反复摸索，建立了以丙氨酸消旋 酶为靶点的抗结核药物筛选模型，并筛选出了具有较好抗结核活性、 抗菌谱广、细胞毒性低的抗结核药物。

本发明第一方面涉及式Ⅰ所示的化合物，或其药学上可接受的盐。

本发明第二方面涉及药物组合物，其含有本发明第一方面任一项 的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第三方面涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上 可接受的盐在制备抗结核药物中的用途。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受 的盐在体内/体外作为丙氨酸消旋酶抑制剂的用途，优选地，所述丙氨 酸消旋酶为分枝杆菌的丙氨酸消旋酶，更优选地，所述丙氨酸消旋酶为 结核分枝杆菌的丙氨酸消旋酶。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受 的盐在体内/体外用于抑制分枝杆菌活性的用途，优选地，所述分枝杆 菌为结核分枝杆菌。

在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌为H37Rv。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受 的盐在制备抗分枝杆菌药物的用途，优选地，其中所述分枝杆菌为结核 分枝杆菌。

在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌为H37Rv。

本发明还涉及本发明第一方面任一项的化合物或其药学上可接受 的盐在制备预防或治疗结核病的药物中的用途。

在本发明的实施方案中，其中所述的结核病为肺结核或肺外结核 （例如骨关节结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、肾结核、肠结核等）。

本发明还涉及一种筛选抗结核药物的方法，所述方法包括以下步 骤：

（1）建立反应体系，所述反应体系中包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD）、丙氨酸脱氢酶（ALD）、D-丙氨酸、丙氨酸消旋酶（ALR）、 待测样品以及反应缓冲液，同时设立阳性对照和阴性对照，该反应体系 在一定温度下反应一定时间；

（2）通过检测反应产物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH） 的浓度计算酶的反应速率，并根据酶的反应速率计算得到待测样品对丙 氨酸消旋酶的抑制率，选择抑制率≥50%的样品作为抗结核药物；

（3）任选地，可以重复进行步骤（1）和（2）。

在本发明的实施方案中，其特征在于以下（1）～（8）项中的一项 或多项：

（1）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应浓度为5-20mmol/L，例如 8-12mmol/L，例如10mmol/L；

（2）丙氨酸脱氢酶的浓度为0.025-0.15U/ml，例如为0.05-0.10U/ml， 例如为0.08U/ml；

（3）D-丙氨酸的浓度为5-20mmol/L，例如8-12mmol/L，例如10 mmol/L；

（4）丙氨酸消旋酶的浓度为2.1-8.4U/100μl，例如为3.8-4.6U/100μl， 例如为4.2U/100μl；

（5）步骤（1）中的反应温度为34-40℃，例如为36-38℃，例如为 37℃；

（6）步骤（1）中的反应时间为30-50min，例如为40min；

（7）步骤（1）中的反应pH值为7.0-9.0，例如为8.5-9.0；

（8）步骤（1）中的反应缓冲液为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。

在本发明的具体实施方案中，所述阳性对照药物为作用于丙氨酸 消旋酶的抑制剂，例如为D-环丝氨酸。

在本发明的实施方案中，所述阴性对照药物为溶解药物的溶剂。 在本发明的具体实施方案中，所述阴性对照药物为DMSO。

在本发明的实施方案中，所述反应缓冲液可以为本领域常用的缓 冲溶液，例如为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液。在本发明的具体实施方 案中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。在本发明的具体实施方案中， Tris-HCl缓冲液的浓度为100mmol/L，pH为8.0。

在本发明的实施方案中，反应体系的体积为100μl。

在本发明的实施方案中，所述酶的抑制率（IR%）的计算方法为：

IR（%）=（1-V_S/V_N）×100%，其中V_S代表待测样品孔的酶反应速 率，V_N代表阴性对照孔的平均酶反应速率。

在本发明的实施方案中，所述酶的反应速率的计算方法为：

V=(Q_t2-Q_t1)/(t₂-t₁)，其中Q为反应体系中生成的产物浓度，t₁和 t₂为反应在线性范围内的两个时间点。

发明的有益效果

本发明以丙氨酸消旋酶为靶点构建了抗结核药物筛选模型，利用 该模型成功地筛选出抗结核药物，为更多新抗结核药物的筛选奠定了 基础。同时，筛选出的药物具有较好的抗结核活性，且抗结核菌谱广， 细胞毒性低。

附图说明

图1alr的PCR扩增结果，1：DNA分子量标准，2：alr的PCR 产物

图2pET28a::alr的双酶切验证，1：DNA分子量标准；2： pET28a::alr经EcoRI和HindIII双酶切

图3ALR SDS-PAGE蛋白图谱，1：Fermentas#SM0671marker； 2：全蛋白；3：沉淀；4：上清；5：流川液；6-7：杂质峰；8-10：纯化 的ALR蛋白

图4NADH浓度与OD₃₄₀关系

图5ALR的稳定性

图6筛选条件优化，A:最适温度；B:最适pH；C:最佳D-alanine 浓度；D:最佳NAD浓度；E:最佳LAD浓度；F:最佳酶量；G:DMSO 浓度对酶活的影响

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1MTB ALR的表达载体的构建

以MTB H37Rv基因组为模板，以ALR-PF：5’ CGGGAATTCATGAAACGGTTCTGGGAGAATGTCGGAAAGC3’ （SEQ ID NO：1）和ALR-PR：5’ CATAAGCTTACCACGGTTTTCAGCCTCGCGATAGGTCCT3’ （SEQ ID NO：2）为引物（下划线为酶切位点），进行PCR扩增，条 件为：95℃预变性5min；98℃变性20s，70℃复性15s，72℃延伸 1.5min，30个循环；最后72℃反应8min。PCR产物用EcoR I和Hind III双酶切后与表达载体pET28a连接，转化进入E.coli DH5α。用含50 mg/L卡那霉素（Kan）的LB平板筛选阳性克隆，将测序正确的质粒转 化进入E.coli BL21(DE3)pLysS，在含50mg/L Kan的LB平板上筛选 得到ALR蛋白稳定表达的菌株。基本操作参见分子克隆实验指南^[12]。

结果：PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到了长度为1227 bp的alr基因（图1）。选取经PCR验证为阳性的转化菌落，提取质粒 pET28a::alr，用双酶切的方法进一步验证（图2）。酶切鉴定正确的质 粒进行序列测定，经过序列比对分析与GeneBank中H37Rv的alr基因 序列一致。

实施例2MTB ALR的表达与纯化

挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养，以1： 100的比例接种于含100mmol/L山梨醇的LB培养基中，培养至 OD₆₀₀=0.6。加入IPTG至终浓度为20μmol/L，加入乳糖至终浓度为5 mmol/L，16℃、200r/min诱导过夜。低温离心收集菌体，加入裂解缓 冲液[50mmol/L NaH₂PO₄、300mmol/L NaCl、30mmol/L咪唑，pH8.0]， 液氮-冰水反复冻融5次，再用细胞超声破碎仪在70%能量下，3s/8s， 破碎100个循环，8000×g离心10min后收集上清。利用Ni⁺亲和层析 柱分离目的蛋白，上样前加入PLP至终浓度0.5mmol/L，用洗脱缓冲 液[50mmol/L NaH₂PO₄、300mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑，pH8.0] 与裂解缓冲液按比例进行梯度洗脱，得到的纯化产物用聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE）进行检测，纯化的蛋白加入PLP（购自Sigma公司） 至0.1mmol/L在-80℃下保存。

结果：对表达纯化得到的ALR蛋白进行SDS-PAGE分析，相对分 子质量约48kD，与理论预期一致。虽然大部分表达的ALR蛋白在沉 淀当中，但上清液经纯化后可以看到明显的目的条带，并且为单一的条 带（图3）。

实施例3酶活测定及筛选条件的优化

酶活反应于96孔酶标板中进行，终体积为100μl。酶活测定体系包 括：100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L NAD，0.1U/mL丙 氨酸脱氢酶（Alanine dehydrogenase，ALD），10mmol/L D-alanine （D-丙氨酸），0.3μg ALR。在37℃条件下检测40min内反应体系340 nm的吸收值（OD₃₄₀）变化。其中DMSO为化合物的溶剂及阴性对照。 酶稳定性测定为分别在温度4、25、30、34、37、42、48、52、58、65℃ 下处理30min后，ALR的活性测定。筛选条件优化的参数包括：反应 温度（28、31、34、37、40、45℃），反应pH值（2-11，间隔选取17 个pH值），反应底物NAD（20～0.1625mmol/L，二倍稀释）和D-alanine （20～0.1625mmol/L，二倍稀释），级联反应酶ALD（0.4、0.3、0.2、 0.15、0.1、0.075、0.05、0.025U/ml），ALR酶量（16.8～0.26U，二倍 稀释）及DMSO（10、8、6、4、3、2、1%）。Z’因子法是评价HTS 模型稳定性的一种重要方法。根据公式计算Z’因子值：Z’=1-3（SDn+ SDp）/（Vn-Vp）。其中Vn和SDn分别为阴性对照孔的酶反应速率 平均值和标准差；Vp和SDp分别为阳性对照孔的酶反应速率平均值和 标准差。其中酶反应速率V的计算方法为：

V=(Q_t2-Q_t1)/(t₂-t₁)，其中Q为反应体系中生成的产物浓度，t₁和 t₂为反应在线性范围内的两个时间点。

其中线性范围由酶标仪连续检测得到的反应曲线判定。

结果：ALR酶活测定原理是应用吸光光度法检测酶催化反应产物 NADH，通过检测体系中NADH的浓度来反映ALR的酶活。NADH的 浓度与其OD₃₄₀成线性关系（图4）。ALR酶活力的定义：37℃条件下 反应，每分钟催化生成1μmol/L NADH的酶量设定为1U。纯化后ALR 为62.63μl/ml，酶比活力为13.53kU/mg。ALR在52℃以下处理30min 活性基本保持稳定，52℃、58℃处理使酶活有所下降，65℃处理酶活 下降明显（图5）。

酶反应温度在37℃以下时，随着温度的升高ALR反应速度增加， 40℃时反应速度有所下降，可能酶部分失活，45℃时反应速度再次提 升，可能是酶活力的提高抵消了蛋白热失活的损失，为保证模型稳定性， 选择第一个峰值37℃为筛选温度。体系中pH值大于7时，ALR表现 出酶活力，并随着pH的升高酶活力逐渐增加，pH大于9时，酶活力 变化幅度减小，且可能影响体系稳定性，故筛选的pH确定为8.5-9.0。 随着底物浓度的增加酶反应速度逐渐提高达到平台期，最佳D-alanine 浓度为10mmol/L，最佳NAD浓度为10mmol/L。最佳ALR酶量为4.2 U，最佳级联反应酶ALD的浓度为0.08U/ml。DMSO的浓度对ALR 酶活力影响较小，1%的DMSO对反应体系基本没有影响（图6）。

实施例4酶抑制剂的高通量筛选

以优化后的反应条件进行筛选，每块96孔酶标板上设88个待测样 品孔及4个阳性对照孔和4个阴性对照孔，其中阳性对照化合物为DCS， 阴性对照为DMSO。每孔加入待测样品终浓度为20_μg/ml，在37℃条 件下检测40min内反应体系OD₃₄₀的变化，计算酶的反应速率。利用反 应速率计算样品对ALR的抑制率（IR%）：IR（%）=（1–V_S/V_N）×100%。 其中V_S代表待测样品孔的酶反应速率；V_N代表阴性对照孔的平均酶反 应速率。其中酶反应速率V的计算方法为：

V=(Q_t2-Q_t1)/(t₂-t₁)，其中Q为反应体系中生成的产物浓度，t₁和 t₂为反应在线性范围内的两个时间点。

根据以上条件，发明人对中国医学科学院医药生物技术研究所化合 物库中的7万余个化合物进行了初筛，选择IR≥50%的样品作为活性样 品，并按照初筛的反应条件和反应方法进行复筛，根据复筛的结果确定 化合物对ALR的抑制率。

目前广泛使用的HTS模型的稳定性和可靠性评估参数是Z’因子， 它是一个统计学参数，与筛选源无关，仅与筛选方法本身有关。一般认 为，如果1>Z’>0.5,说明该筛选模型是比较理想的适合于HTS的方法； 如果Z’<0.5，则说明筛选方法还需要调整。本实验中HTS的Z’因子值 为0.76。因此，所建立的筛选方法是一种稳定性和灵敏度都较好的HTS 方法。

实施例5抑制剂的特异性评价及半数抑制浓度（IC₅₀）测定

该模型的反应体系中存在两步酶促反应，所以对具有抑制活性的化 合物进行特异性评价，以排除假阳性样品。反应中直接加入L-丙氨酸作 为反应底物，加入级联反应酶ALD与筛选得到的抑制剂进行作用，利 用优化后的反应条件进行抑制活性的评价。

采用优化后的反应条件测定抑制剂对ALR的IC₅₀值，化合物浓度 为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0μg/ml，计算出抑 制率后使用origin8.1分析各抑制剂的IC₅₀。

采用建立的HTS筛选模型，对中国医学科学院医药生物技术研究 所化合物库内的7万余个化合物进行筛选，得到5个抑制率≥50%的化 合物，且对二级酶联反应中ALD抑制活性<30%，分别测定它们对ALR 的IC₅₀。化合物编号、对ALR和ALD的抑制率及IC₅₀见表1。

表1各活性化合物的酶抑制率和IC₅₀及抗结核活性MIC

实施例6抑制剂的抗结核活性测定、活性化合物的细胞毒性及抗菌 谱初步评价

于96微孔板中进行，用7H9培养基(含10%的BCG培养增强剂 （albumindextrosecatalase，ADC），0.05%的吐温80)对抑制剂进行二 倍稀释，终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/ml，结核分枝杆菌H37Rv的接种量约为2×10⁵cfu/ml，稀释菌液于 15min内接种完毕，于37℃孵育10d观察结果。

选择具有抗结核活性的化合物检测对小鼠巨噬细胞J774A.1的细胞 毒性。将新鲜传代的J774A.1细胞接种至96孔板中，每孔约2×10⁴个细 胞，37℃、5%CO₂环境下孵育至细胞贴壁，加入活性化合物至终浓度 为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μg/ml，孵育24h，分 别加入10μl MTS检测液孵育2h，480nm条件下检测吸光度，使用 origin8.1分析化合物的TC₅₀。

选取抗结核活性较好的化合物IMB-XZ5对42株不同的菌株进行抗 菌谱测定，其中抗结核活性测定选用了三株结核分枝杆菌分别为， H37Rv为标准株，FJ05349和FJ05060为临床分离株。经过三次重复试 验，对各菌株的MIC如表2所示。同时，化合物IMB-XZ5的细胞毒性 较低，100μg/ml浓度下仍未达到50%的细胞致死率，所以该化合物对 J774A.1的TC₅₀值>100μg/ml。

IMB-XZ5的分子式为C₂₀H₁₆N₄O，分子量为328.38，结构式如式Ⅰ 所示：

表2活性化合物IMB-XZ5对不同菌株的MIC

菌种 菌株号 MIC(μg/mL) 金黄色葡萄球菌 29213 >64 金黄色葡萄球菌 33591 >64 金黄色葡萄球菌 15 >64 金黄色葡萄球菌 12-28 >64

金黄色葡萄球菌 12-33 >64 表皮葡萄球菌 12228 >64 表皮葡萄球菌 12-6 >64 表皮葡萄球菌 12-8 >64 粪肠球菌 29212 >64 粪肠球菌 51299 >64 粪肠球菌 12-5 >64 粪肠球菌 09-9 >64 屎肠球菌 700221 >64 屎肠球菌 12-1 >64 屎肠球菌 12-3 >64 大肠埃希菌 25922 >64 大肠埃希菌 1515 >64 大肠埃希菌 12-14 >64 大肠埃希菌 12-15 >64 肺炎克雷伯杆菌 700603 >64 肺炎克雷伯杆菌 7 >64 肺炎克雷伯杆菌 BAA-2146 >64 肺炎克雷伯杆菌 12-4 >64 肺炎克雷伯杆菌 12-8 >64 铜绿假单胞菌 27853 >64 铜绿假单胞菌 PAO1 >64 铜绿假单胞菌 12-16 >64 鲍曼不动杆菌 19606 >64 阴沟肠杆菌 43560 >64 产气肠杆菌 13048 >64 粘质沙雷氏菌 21074 >64 摩根摩根氏菌 25830 >64 雷极普鲁菲登杆菌 31052 >64 普通变形杆菌 29905 >64 奇异变形杆菌 12-6 >64 嗜麦芽假单孢菌 13636 >64 弗劳地枸橼酸菌 43864 >64 耻垢分枝杆菌 MC²155 >64 海分枝杆菌 BAA-535 64 结核分枝杆菌 H37Rv 4-8 结核分枝杆菌 FJ05349 4-8 结核分枝杆菌 FJ05060 4-8

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。

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