糖链加成连接子、含有糖链加成连接子与生理活性物质的化合物或其盐、以及其制造方法

摘要

本发明的目的是提供载体连接子，所述载体连接子能够使生理活性物质的水溶性提高，而且，能够在不依赖于光或酶的切断下，于特定条件下使生理活性物质更快速地释放。本发明提供新颖的糖链加成连接子，其加成有糖链作为载体。

说明书

技术领域

本发明关于糖链加成连接子(linker)、含有糖链加成连接子及生理活 性物质的化合物或其盐、及其制造方法。

背景技术

近年，进行使用生理活性物质的各种疫苗的开发。然而，在这些生理 活性物质中，由于水溶性低，存在着例如无法进行(充分)过滤器灭菌的问 题。而且，使生理活性物质溶解于水溶液或由水溶液所制备的乳液，而施 用至人体等生物体存在着困难。

为了使生理活性物质等药物的水溶性提高，正尝试各种方法。已知， 例如，将水溶性高的载体(carrier)以人工方式直接加成于药物的载体-药物 偶联物(conjugate)(即所谓的药物衍生物)。就载体而言，已知有亲水性氨基 酸序列或聚乙二醇(PEG)等。

然而，在使载体与药物直接键合的药物衍生物时，该药物衍生物的立 体结构与原来药物的立体结构不同。结果，药物衍生物与原来药物分子相 比，显示不同的药代动力学的特性、免疫原性(immunogenicity)的特性、毒 物学或药理学的特性等。已熟知，例如，在将药物衍生物作为疫苗时，与 原有的药物分子相比，其药物衍生物的抗原性通常降低。

而且，加成有作为载体的PEG(PEG化)的药物具有抗生物分解性。因 此，若将PEG化药物持续施用至生物体内，则其会蓄积于生物体内，而有 对生物体产生药害的危险性，其生物适应性仍然是不充分的(专利文献1)。 此外，PEG具有分子量分布(多分散的性质(polydisperse nature))。若将药物 PEG化，由于所加成的PEG的结合位置或分子量不同，则生成多种活性不 同的单体异构体(many different monomeric isoforms：结构不同但功能相同 的蛋白质)。所生成的这些异构体在与药物的受体分子的结合方面，有可能 彼此竞争(非专利文献1)。

亦正开发将药物与载体经由连接子部分键合而成的载体连接子-药物 偶联物。这些偶联物可被设计成在目标部位(血中等)作用时，载体-连接子 部分与药物的间的键会被切断，而释放药物本身。在利用此种载体连接子- 药物偶联物时，在载体连接子部分与药物间的键的切断上，使用光或酶作 为触发物(trigger)。然而，在使用光的情况，难以对目标部位照射光，亦 担心光对生物体造成损伤。而且，在酶性切断的情况，已知酶量在个体间、 施用部位均有很大差异。所以，会有药物治疗的效果在患者间发生差异的 问题。

对于这些问题，就载体连接子-药物的偶联物而言，报告指出载体连接 子部分经由酰胺基与生理活性物质部分键合(专利文献2)。专利文献2所公 开的技术为了可控制载体-连接子部分与药物之间键的切断，利用通过载体 连接子内的分子内催化作用而自动水解(autohydrolysis)。载体连接子部分与 生理活性物质部分之间键的切断机制基于：通过形成环状酰亚胺的环化- 活化而切断酰胺键。

[现有技术文献]

[专利文献]

[专利文献1]日本特表第2007-530569号公报

[专利文献2]国际公开第2009/095479号小册子

[非专利文献]

[非专利文献1]Barry Byrne等,Drug Discovery Today,(2007),Vol.12, 319-326页

发明内容

[发明所要解决的问题]

鉴于如上所述的课题，本发明提供可使生理活性物质的水溶性提高， 而且，于特定条件下能够更迅速释放生理活性物质的载体连接子。

[用于解决问题的手段]

专利文献2不过是确认大量的具有各种结构的载体连接子-药物偶联 物通过切断酰胺键而释放药物本身。由于专利文献1的多数实施例系使用 PEG作为载体，其并未着眼于载体的生物分解性。此外，由于专利文献1 的多数实施例使用难以溶于水的高级脂肪酸作为载体，其亦未言及有关载 体连接子-药物的偶联物、或载体连接子本身的溶解性。

本发明人等专心研究的结果，发现了载体连接子，所述载体连接子使 生理活性物质的水溶性提高，并且不依存于光或酶的切断，于特定条件下， 能够释放生理活性物质。

亦即，本发明在其一方面中，提供与至少具有1个羧基的生理活性物 质键合用的糖链加成连接子，

该糖链加成连接子以下述式(A)表示：

X-R¹-Y-R²  (A)

[式(A)中，

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)；

R¹意指经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、经取代或未经取代的 C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，或者R¹意指-R³-R⁴-、 -R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵各自为经取代或未经取代的C₁至 C₅烷基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，R⁴为经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代 的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²意指糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，或者R²意指 -R⁶-R⁷，其中，R⁶为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，R⁷为 氢原子(H)、-NH₂、经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代 的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、或PEG]。

该糖链加成连接子的特征为，通过位于该氧原子(O)或硫原子(S)处的 离去基团的脱离，可与该生理活性物质的羧基键合。

而且，在本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，其是以下述式(A)表示的糖链加成连接子：

X-R¹-Y-R²  (A)

[式(A)中，

X意指具有离去基团的硫原子(S)，

R¹意指-R³-R⁴-、-R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵为经取代或未 经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或 未经取代的C₂至C₅炔基，R⁴为经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取 代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽]。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，其是以下述式(A)表示的糖链加成连接子：

X-R¹-Y-R²  (A)

[式(A)中，

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)；

R¹意指-R³-R⁴-、或-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵为经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的 C₂至C₅炔基，R⁴为经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、或经取代或未经 取代的C₅至C₁₆杂芳基；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽]。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，在该R²或R⁶的「糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽」 中，糖链与氨基酸或多肽中的Asn或Cys键合。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，该R²或R⁶的「糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多 肽」中的糖链由4个以上的糖残基组成。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，该R²或R⁶的「糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多 肽」中的糖链是双触角复合型糖链、3触角复合型糖链、或4触角复合型 糖链。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，该糖链是选自由二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、无唾液酸糖 链、二(N-乙酰葡糖胺)糖链及二甘露糖糖链所构成的族的双触角复合型糖 链。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，该R²或R⁶的「糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多 肽」中的糖链是以下述式表示的糖链：

[式中，R¹⁰及R¹¹系相同或不同，且各自表示

；Ac表示乙酰基]。

而且，于本发明的糖链加成连接子的一实施方案中，该糖链加成连接 子的特征为，该「糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽」中的糖链不经 由连接子而与氨基酸或多肽键合。

上述的本发明的特征的一个或多个特征的任意组合不用说也包括在 本发明的糖链加成连接子的范围内。

而且，根据本发明的其他方面，提供化合物或其盐，所述化合物含有 来自该糖链加成连接子的糖链加成连接子部分及生理活性物质部分，

其中，该生理活性物质至少具有1个羧基，

该糖链加成连接子部分通过位于该氧原子(O)或硫原子(S)处的离去基 团的脱离，与该生理活性物质部分的羧基形成酯键或硫酯键，而与该生理 活性物质部分键合。

而且，在本发明的化合物或其盐的一实施方案中，该化合物或其盐的 特征为，该生理活性物质是低分子生理活性物质或生物高分子。

而且，在本发明的化合物或其盐的一实施方案中，该化合物或其盐的 特征为，该生物高分子选自由蛋白质、多肽、多核苷酸、及肽核酸所构成 的组。

而且，在本发明的化合物或其盐的一实施方案中，其特征为，与无修 饰的生理活性物质相比，该化合物或其盐具有提高的水溶性。

而且，在本发明的化合物或其盐的一实施方案中，该化合物或其盐的 特征为，该提高的水溶性，以摩尔浓度计，为该「无修饰的生理活性物质」 的10至1,000,000倍。

而且，在本发明的化合物或其盐的一实施方案中，该化合物或其盐的 特征为，该糖链加成连接子部分中的该氧原子(O)或硫原子(S)，与该生理 活性物质部分中的羧基之间所形成的酯键或硫酯键以依赖于pH及/或温度 的方式而切断。

上述的本发明的特征的一个或多个特征的任意组合不用说也包括在 本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐的 范围内。

而且，根据本发明的其他方面，提供组合物，所述组合物含有该化合 物或其盐，其中，该化合物或其盐中的糖链实质上为均一的。

而且，根据本发明的其他方面，提供医药组合物，其含有：

(I)权利要求10所记载的化合物或其盐、及

(II)药理学上可接受的载体。

而且，在本发明的医药组合物的一实施方案中，该医药组合物的特征 为，该生理活性物质于施用至对象后发挥活性。

而且，在本发明的医药组合物的一实施方案中，其特征为该医药组合 物用于疫苗接种。

上述的本发明的特征的一个或多个特征的任意组合不用说也包括在 本发明的医药组合物的范围内。

而且，根据本发明的其他方面，提供制造方法，其是含有糖链加成连 接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐的制造方法，

其中，糖链加成连接子以下述式(A)表示：

X-R¹-Y-R²  (A)

[式(A)中，

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)；

R¹为经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至 C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基，或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，或者R¹意指-R³-R⁴-、 -R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵为经取代或未经取代的C₁至C₅烷 基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，R⁴为经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，或者R²意指-R⁶-R⁷， 其中，R⁶为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，R⁷为氢原子(H)、 经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、 经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、或PEG]；

该生理活性物质至少具有1个羧基；

该方法包含以下的步骤：

(a)使该糖链加成连接子中的具有离去基团的氧原子(O)或硫原子(S)与 该生理活性物质的羧基之间形成酯键或硫酯键，而进行缩合反应的步骤。

而且，在本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化 合物或其盐的制造方法的一实施方案中，该制造方法的特征为，该缩合反 应的步骤是于该糖链加成连接子与固相合成用树脂键合的状态进行(但是， 仅限于该糖链加成连接子具有糖链加成的氨基酸或糖链加成的多肽之时)。

而且，在本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化 合物或其盐的制造方法的一实施方案中，该制造方法的特征为，进一步包 括在步骤(a)的前的制备以下述式(A)表示的糖链加成连接子的步骤(a’)：

X-R^1-Y-R²  (A)

[式(A)中，

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)，

R¹为经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至 C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，或者R¹意指-R³-R⁴-、 -R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵为经取代或未经取代的C₁至C₅烷 基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，R⁴为经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，或者R²意指-R⁶-R⁷， 其中，R⁶为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽，R⁷为氢原子(H)、 经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、 经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、或PEG]。

而且，在本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化 合物或其盐的制造方法的一实施方案中，该制造方法的特征为该步骤(a’) 及/或该步骤(a)于树脂上进行。

而且，在本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化 合物或其盐的制造方法的一实施方案中，该制造方法的特征为，

该生理活性物质至少具有1个羧基；

该方法包含以下的步骤：

(a)将以下述式(B)表示的连接子键合于树脂的步骤；

该连接子以下述式(B)表示：

X-R¹-Y-R²  (B)

[式(B)中，

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)；

R¹是经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至 C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，或者R¹意指-R³-R⁴-、 -R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中R³及R⁵是经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、 经取代或未经取代的C₂烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，R⁴是经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳 基、或硫原子(S)；

Y可存在或不存在，Y存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与 R¹键合，N与R²键合)；

R²是氨基酸、或多肽，或者R²意指-R⁶-R⁷，其中，R⁶是氨基酸、或多 肽，R⁷是氢原子(H)、-NH₂、经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或 未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、 或PEG]；

在此步骤中，该连接子中的R²的氨基酸或多肽的羧基与该树脂结合；

(b)使键合于该树脂的该连接子与该生理活性物质键合的步骤，其中， 该连接子通过该氧原子(O)或硫原子(S)的离去基团的脱离，与该生理活性 物质的羧基形成酯键或硫酯键，而与该生理活性物质键合；

(c)将糖链加成于该连接子中的R²的氨基酸或多肽的侧链的步骤。

而且，根据本发明的其他方面，提供通过上述的含有糖链加成连接子 部分及生理活性物质部分的化合物或其盐的制造方法所得到的化合物或其 盐。

上述的本发明的特征的一个或多个特征的任意组合不用说也包括在 本发明的化合物或其盐的制造方法的范围内。

[发明的效果]

由于本发明的糖链加成连接子，具有羟基多、极性高的糖链结构部分， 通过与生理活性物质键合，可使该生理活性物质的水溶性提高。

而且，本发明的糖链加成连接子，不依赖于光或酶的切断，而可在特 定条件下(例如，活体内)，释放与该糖链加成连接子键合的生理活性物质。

而且，根据本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的 化合物或其盐具有水溶性。

此外，根据本发明的糖链加成连接子部分中的糖链，由于具有可生物 分解性的性质，所以是有利的。

而且，根据本发明的糖链加成连接子部分中的糖链，使生理活性物质 的抗原性降低，所以是有利的。

附图说明

[图1]图1A及图1B是展现本发明的一实施方案的硫代烷基型糖链加 成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)的水解试验结果的图。该图以起始 物质的相对浓度对培育时间作图。

[图2]图2A及图2B是展现本发明的一实施方案的硫代芳基型糖链加 成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物2)的水解试验结果的图。该图以起始 物质的相对浓度对培育时间作图。

[图3]图3是展现对具有硫酯键的硫代烷基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)、具有硫酯键的硫代芳基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物2)，及具有酯键的糖链加成连接子-HER2(8-16) 偶联物(化合物6)进行水解试验时的结果的图。该图以起始物质的相对浓度 对培育时间作图。

[图4]图4是展现对糖链加成(Cys(二唾液酸)型)连接子-趋化素 (chemerin)9偶联物(化合物8)进行水解试验时的结果的图。该图以起始物质 的相对浓度对培育时间作图。

具体实施方式

在本说明书中，「糖链加成连接子」意指具有作为载体的糖链的连接 子，其中，该连接子通过与至少具有1个羧基的生理活性物质键合，可使 该生理活性物质的水溶性提高。而且，与该生理活性物质键合的糖链加成 连接子的特征为在特定条件下，例如生物体内，以期望的速度水解。通过 该水解，糖链加成连接子从该生理活性物质脱离，从而可释放该生理活性 物质。所释放的该生理活性物质回到糖链加成连接子加成前的状态。

在本发明的一实施方案中，糖链加成连接子以下述式(A)表示。

X-R¹-Y-R²  (A)

其中，上述式(A)中的X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基 团的硫原子(S)。

在本说明书中，「具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子 (S)」，意指在以式(A)：X-R¹-Y-R²表示的糖链加成连接子的X位置所存在 的原子，其是通过与该原子键合的离去基团脱离而可与生理活性物质键合 的原子。该原子与生理活性物质的键合可经由生理活性物质中的羧基而进 行。

其中，就离去基团而言，其只要于生理活性物质的羧基与具有离去基 团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)键合时能够脱离即可，并无限 定，例如，氢原子或锂、钠、钾、铷、铯、钫、银等的一价阳离子。

此外，本发明的糖链加成连接子在上述式(A)中的X为具有离去基团 的氧原子(O)时，通过与生理活性物质形成酯键而键合。而且，本发明的糖 链加成连接子在上述式(A)中的X为具有离去基团的硫原子(S)时，通过与 生理活性物质形成硫酯而键合。

而且，上述式(A)中的R¹为经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取 代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、经 取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基， 或者R¹意指-R³-R⁴-、-R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-。其中，R³及R⁵意指经取代或 未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代 或未经取代的C₂至C₅炔基。而且，R⁴意指经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)。

在本说明书中，「经取代或未经取代的C₁至C₅烷基」包含直链状或支 链状的烷基。就「C₁至C₅烷基」之例而言，虽不限定于以下者，然而可 列举：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、异戊基、新戊基、叔戊基等。这些「C₁至C₅烷基」可经1个或 多个「取代基」分别独立地取代。就「取代基」之例而言，可列举：C₁至 C₄烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、氨基、羟基、巯 基、羧基、硝基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、或卤素原子(例如，氟、氯、溴、 碘)等。

在本发明中，就「经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基」而言，虽不限 定于以下者，然而可列举如：苯基、联苯基、萘基、蒽基(anthranyl)、菲基、 蒽基(anthryl)、邻-甲苯基、间-甲苯基、对-甲苯基、二甲苯基、乙基苯基或 苯甲基等。

而且，「经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基」虽不以上述为限，然而 亦包括其中的1个或多个氢原子分别独立地经「取代基」取代的那些「C₅至C₁₆芳基」。就「取代基」之例而言，可列举：C₁至C₄烷基、C₁至C₄烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、氨基、羟基、巯基、 羧基、硝基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、卤素原子(例如，氟、氯、溴、碘)、 C₁至C₄卤烷基(例如氯甲基)、苯基、邻-甲苯基、间-甲苯基、对-甲苯基、 二甲苯基、乙基苯基或苯甲基等。

而且，在本发明中，就「经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基」而言， 虽不限定于以下者，然而可列举碳原子经氮原子或氧原子置换而形成的环 结构，更具体而言，可列举：吲哚、喹啉、色烯(chromene)等。

而且，「经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基」虽不以上述为限定， 然而包括其中与形成环结构的碳原子键合的1个或多个氢原子分别独立地 经「取代基」取代的「C₅至C₁₆杂芳基」。就「取代基」之例而言，可列举： 烷基、烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、羟基、羧基、 硝基、甲磺酰基、卤素原子(例如，氟、氯、溴、碘)、卤烷基(例如氯甲基) 等。

而且，在本说明书中，「经取代或未经取代的C₂至C₅的烯基」包括直 链状或支链状的烯基。就「经取代或未经取代的C₂至C₅的烯基」之例而 言，可列举：乙烯基、丙烯基、丁烯基等。而且，「经取代或未经取代的 C₂至C₅的烯基」不以上述为限，亦包含经1个或多个「取代基」分别独 立地取代的「C₂至C₅烯基」。就「取代基」之例而言，可列举：C₁至C₄烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、氨基、羟基、巯基、 羧基、硝基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、或卤素原子(例如，氟、氯、溴、碘) 等。

而且，在本说明书中，「经取代或未经取代的C₂至C₅炔基」包括直链 状或支链状的炔基。就「经取代或未经取代的C₂至C₅的炔基」之例而言， 可列举：乙炔基、丙炔基、丁炔基等。而且，「经取代或未经取代的C₂至 C₅炔基」不以上述为限，亦包含经1个或多个「取代基」分别独立地取代 的「C₂至C₅炔基」。就「取代基」之例而言，可列举：C₁至C₄烷氧基(例 如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、氨基、羟基、巯基、羧基、硝 基、甲磺酰基、甲苯磺酰基、或卤素原子(例如，氟、氯、溴、碘)等。

而且，上述式(A)中的Y可于式(A)中存在，亦可不存在。Y在式(A) 中存在时，Y意指-CO-、或-CONH-(但是，C与式(A)中的R¹键合，N与式 (A)中的R²键合)。

而且，上述式(A)中的R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的 多肽，或者R²意指-R⁶-R⁷。其中，R⁶意指糖链、糖链加成的氨基酸、或糖 链加成的多肽。而且，R⁷意指氢原子(H)、-NH₂、经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、或PEG。

在本说明书中，所谓的「糖链」意指1个以上的单元糖(单糖及/或其 衍生物)所连成的化合物。2个以上单元糖连接时，各个单元糖彼此之间可 通过脱水缩合而经由糖苷键键合。就这样的糖链而言，虽无限定，但可列 举如：生物体中所含有的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻 糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸及它们的复合物或衍 生物)之外，尚可列举被分解的多糖等广范围的糖链，以及从糖蛋白质、蛋 白多糖、糖胺聚醣(glycosaminoglycan)、糖脂等复合生物体分子所分解或衍 生的糖链。糖链可为直链型，亦可为支链型。

而且，在本说明书中，「糖链」亦包含糖链的衍生物，就糖链的衍生 物而言，虽可列举如：由为下述糖的糖所构成的糖链：具有羧基的糖(例如， C-1位置被氧化而成为羧酸的醛糖酸(aldonic acid)(例如，D-葡萄糖被氧化 而成的D-葡萄糖酸)、末端的C原子成为羧酸的糖醛酸(uronic acid)(D-葡萄 糖被氧化而成的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基的衍生物(例如，乙酰基 化的氨基)的糖(例如，N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、 同时具有氨基及羧基二者的糖(例如，N-乙酰基神经胺酸(唾液酸)、N-乙酰 基胞壁酸等)、脱氧化的糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含有硫酸基团的硫酸化 糖、含有磷酸基团的磷酸化糖，不过不限于这些糖。

在本发明中，优选的糖链，是在作为糖链加成连接子加成于生理活性 物质时，使该生理活性物质的水溶性提高的糖链。

而且，在本发明中，优选的糖链，是在作为糖链加成连接子加成于生 理活性物质时，使该生理活性物质的抗原性降低的糖链。

这样的本发明的糖链加成连接子中的糖链，无特别限定，可为在生物 体内以复合糖质(糖肽(或糖蛋白质)、蛋白多糖、糖脂等)存在的糖链，亦可 为在生物体内不以复合糖质存在的糖链。

在生物体内以复合糖质存在的糖链，从所谓的将本发明的糖链加成连 接子施用至生物体内的观点而言是优选的。就此类糖链而言，可列举：为 在生物体内键合于蛋白质而形成糖蛋白质的糖链的N-连接型糖链、O-连接 型糖链等。优选使用N-连接型糖链。就N-连接型糖链而言，可列举如： 高甘露糖(high mannose)型、复合(complex)型、混成(hybrid)型，优选为复 合型。

就在本发明中所使用的优选复合型糖链而言，可列举如下述式所示的 糖链：

[式中，R¹⁰及R¹¹是相同或不同的，表示

；Ac表示乙酰基]。

在本发明的一优选实施方案中，本发明的糖链加成连接子中的糖链是 复合型糖链。复合型糖链的特征为，包含2种以上的单糖，具有以下所示 的基本结构及以Galβ1-4GlcNAc所示的乳糖胺结构。

而且，在本发明中，复合型糖链中包含双触角复合型糖链。双触角复 合型糖链意指在基本结构末端的2个甘露糖上，分别键合有包含0至3个 糖的1个糖链的糖链。就双触角复合型糖链而言，优选为例如示于以下的 二唾液酸糖链：

；单唾液酸糖链：

无唾液酸糖链：

二(N-乙酰葡糖胺)糖链：

二甘露糖糖链：

等。就双触角复合型糖链而言，优选为二唾液酸糖链或无唾液酸糖链，最 优选为二唾液酸糖链。

而且，本发明的复合型糖链中，除上述的双触角复合型糖链(2分支型 复合型糖链)的外，亦包含3触角复合型糖链(3分支型复合型糖链)、4触角 复合型糖链(4分支型复合糖链)。例如，就3触角、4触角复合型糖链而言， 亦可列举以下的结构式所示的三唾液酸糖链：

以下述结构式所示的四唾液酸糖链：

而且，就3触角复合型糖链及4触角复合型糖链而言，可列举从这些 三唾液酸糖链及四唾液酸糖链的非还原末端失去1个或多个糖残基而成的 的糖链。

此外，本发明的复合型糖链亦包括加成岩藻糖的复合型糖链。就加成 岩藻糖的复合型糖链而言，可列举以下的结构式所示的含有岩藻糖的复合 型糖链：

而且，亦可列举从这些含有岩藻糖的复合型糖链的非还原末端失去1个或 多个糖而成的糖链。

而且，在本说明书中，「双触角复合型糖链」、「二唾液酸糖链」、「单 唾液酸糖链」、「无唾液酸糖链」、「二(N-乙酰葡糖胺)糖链」、「二甘露糖糖 链」、「3触角复合型糖链」、「4触角复合型糖链」、「含有岩藻糖的复合型 糖链」，除上述化学式所示的那些之外，亦包含与化学式所示之例的结合样 式不同的糖链，亦可优选地使用该糖链作为本发明的糖链。就该糖链而言， 可列举如：其中唾液酸与半乳糖经(α2→3)键而键合的二唾液酸糖链或单 唾液酸糖链等。

而且，本发明的复合型糖链中，亦包含下述式所表示的具有聚乳糖胺 结构或唾液酸化聚乳糖胺结构的糖链。

(式中，n为2至3的整数)、

(式中，n为2至3的整数)。

而且，本发明中所使用的高甘露糖型糖链，为在上述的复合型糖链的 基本结构中，进一步键合有2个以上甘露糖而成的糖链。高甘露糖型糖链 系由于庞大，因此可使与高甘露糖型糖链键合的肽的血液中稳定性变得更 高。高甘露糖型糖链优选为如哺乳类的高甘露糖型糖链，含有5至9个甘 露糖，且可以为如酵母的高甘露糖型糖链，含有更多个甘露糖。就在本发 明中优选使用的高甘露糖型糖链而言，可列举如：

高甘露糖-5(M-5)：

高甘露糖-9(M-9)：

等。

在本发明中，就优选糖链而言，亦可列举如，与在人类体内与蛋白质 键合而以糖蛋白质存在的糖链(例如，「FEBS LETTERS Vol.50，No.3， Feb.1975」中记载的糖链)具有相同结构的糖链(构成糖的种类及它们的键合 样式均相同的糖链)或从其的非还原末端失去1个或多个糖而成的糖链。具 体而言，可列举下述所列举的糖链。

而且，在本发明的一实施方案中，优选的糖链为具有直链结构的糖链。 就该糖链而言，可列举如：寡透明质酸。在本说明书中，寡透明质酸意指 N-乙酰葡糖胺与葡萄糖醛酸交互地以2至32个糖、优选2至16个糖、更 优选4至8个糖呈直链键合的糖链。

用于本发明中的寡透明质酸的特别优选的实例在将由N-乙酰葡糖胺 及葡萄糖醛酸所构成的单元当作1单元时，可列举2单元(4个糖)以上8单 元(16个糖)以下的糖链，更优选的是2单元(4个糖)至4单元(8个糖)的糖 链，最优选的是2单元(4个糖)的糖链。

就本发明中优选使用的透明质酸而言，可列举如：

4个糖的寡透明质酸：

8个糖的寡透明质酸：

等。

而且，对于上述具体地列举的糖链，构成各糖链的各糖残基的羟基及 /或羧基，可通过保护基保护。就保护基而言，为例如将糖残基的羟基及/ 或羧基通过化学反应以保护为目的而导入的本领域技术人员所公知的保护 基。更具体而言，虽不限定于以下，然而可列举如：烷基(甲基、乙基等)、 苯甲基、酰基(乙酰基、苯甲酰基、三甲基乙酰基等)、叔丁基二甲基硅基、 叔丁基二苯基硅基、苯甲酰甲基、烯丙基等。

在本说明书中，所谓「糖链加成的氨基酸」意指键合有糖链的氨基酸。 此外，在本说明书中，所谓的「氨基酸」，以其最广的意义来使用，不仅包 含：天然的氨基酸，例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨 酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸 (Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰 胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、 色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，亦包含氨基酸变异体及衍生物的所谓的非天然 氨基酸。考虑到其广泛的定义，本领域技术人员当然可理解在本说明书中 的氨基酸，可列举如：L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体、氨基酸衍生 物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸(norleucine)、β-丙氨酸、鸟氨酸等并 非生物体内蛋白质的构成成分的氨基酸；及本领域技术人员公知的具有氨 基酸特性的化学合成的化合物等。就非天然氨基酸的例子而言，可列举： α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸(D-天冬氨酸、D-谷氨酸等)、 类组氨酸氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、 α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸等)、于侧链具有额外亚甲基的氨基酸 (「高(homo)」氨基酸)及侧链中的羧酸官能图案经磺酸基置换的氨基酸(磺 基丙氨酸(cysteic acid)等)。

本说明书中的「糖链加成的氨基酸」中的糖链与氨基酸的键合部位虽 无特别限制，然而优选地，氨基酸键合于糖链的还原末端。糖链所键合的 氨基酸的种类无特别限定，可使用天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸 的任一种。从糖链加成的氨基酸在结构上与生物体内的糖肽(糖蛋白质)相 同或类似的观点言，糖链加成的氨基酸优选是如在N-连接的糖链中的糖链 加成Asn；如在O-连接的糖链中的糖链加成Ser及糖链加成Thr。

而且，糖链与氨基酸可不经由连接子而键合，或亦可经由连接子键合。 在糖链与氨基酸经由连接子键合时，从「与连接子容易键合」的观点而言， 糖链加成的氨基酸的氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸等分子内具有2个以 上羧基的氨基酸；赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸、色氨酸等分子内 具有2个以上氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等分子内具有羟基 的氨基酸；半胱氨酸等分子内具有巯基的氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺等 分子内具有酰氨基的氨基酸。尤其，从反应性的观点而言，糖链加成的氨 基酸的氨基酸，优选为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，更优选为半胱氨酸或天冬酰胺。

在糖链及氨基酸经由连接子键合时，就连接子而言，可广泛使用在 该领域中所使用的任意连接子。可列举如：

-NH-(CH₂)_a-(CO)-CH₂-

(式中，a是整数，虽然只要不会阻碍目标的连接子功能便无限定，不过优 选表示0至4的整数)；C_1-10聚亚甲基；

-CH₂-R-；(其中，R表示从选自由下述所构成的组的基团中消除一个氢原 子而形成的基团：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经 取代的炔基、芳基、经取代的芳基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基及 经取代的杂环基)；

-(CO)-(CH₂)_a-(CO)-

(式中，a是整数，虽然只要是不会阻碍目标的连接子功能便无限定，不过 优选表示0至4的整数)；等。

在本发明中的糖链加成的氨基酸的中，就糖链与氨基酸未经由连接子 而键合的一实施方案而言，例如，天冬酰胺侧链氨基上的氢原子可经糖链 的还原末端部分取代。此时，存在于糖链的还原末端的离去基团，虽然无 限定，不过可为：例如，氯、溴或氟等。

在本发明中的糖链加成的氨基酸的中，就糖链与氨基酸经由连接子而 键合而成的一实施方案而言，可列举如：半胱氨酸的侧链的巯基上的氢原 子经由连接子键合于糖链的还原末端(例如，连接子为-CH₂-CONH-时，糖 链的还原末端键合于该连接子中的氮原子上)。此时，键合于糖链的还原末 端的连接子中的离去基团，虽无限定，不过可为例如：氯、溴或氟等。

在本说明书中，「糖链加成的多肽」只要为于蛋白质(或多肽或肽)上加 成至少1个糖链而成的化合物，则无限定。糖链加成的多肽，在本说明书 中，可与「糖蛋白质」或「糖肽」互换使用。糖链加成的多肽可为包含该 糖链加成的氨基酸的多肽。糖链加成的多肽中的糖链与氨基酸的键合方及 构成多肽的氨基酸的种类等，可与本发明中的糖链加成的氨基酸同样地被 规定。多肽中键合于糖链的氨基酸(残基)，对于多肽的N末端、C末端没 有限定，若适当，可为构成多肽的氨基酸(残基)的任一种。本发明中的糖 链加成的多肽中的氨基酸残基优选为2至100个氨基酸残基，更优选可以 为2至10个氨基酸残基。而且，在本发明中的糖链加成的多肽中，多肽中 与糖链键合的氨基酸以外的氨基酸，可较自由地选择。就一实施方案而言， 糖链与多肽键合的部分的氨基酸为例如：天冬酰胺、半胱氨酸、赖氨酸、 谷氨酰胺，另一方面，本领域技术人员当理解糖链与多肽键合的部分的氨 基酸以外的氨基酸(例如，与(糖链加成)连接子部分键合的氨基酸)无特殊限 制。

从将本发明的化合物或其盐施用至生物体内的观点而言，构成本发明 中的糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽的氨基酸优选是存在于生物体 内的氨基酸。

本发明的糖链加成连接子，于一实施方案中，可以是硫代烷基型的糖 链加成连接子。

在本说明书中，所谓的硫代烷基型的糖链加成连接子意指可经由硫酯 键与生理活性物质键合的糖链加成连接子，且在其结构内具有烷基的结构 的糖链加成连接子。

而且，在本说明书中，在硫代烷基型的糖链加成连接子之中，亦包含 可经由硫酯键与生理活性物质键合，且在其结构内具有炔基、或烯基的结 构的糖链加成连接子。

更具体而言，硫代烷基型的糖链加成连接子是上述式(A)所表示的如下 述的糖链加成连接子：

上述式(A)中的X表示具有离去基团的硫原子(S)；

上述式(A)中的R¹是经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代或未 经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未经取代的C₂至C₅炔基，或者R¹意 指-R³-R⁴-、-R⁴-R⁵-、或-R³-R⁴-R⁵-，其中，R³及R⁵各自表示经取代或未经 取代的C₁至C₅烷基、经取代或未经取代的C₂至C₅烯基、或经取代或未 经取代的C₁至C₅炔基，R⁴表示经取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取 代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、或硫原子(S)；

上述式(A)中的Y，可存在于式(A)中，亦可不存在，在Y存在于式(A) 中时，Y表示-CO-、或-CONH-(但是，C与式(A)中的R¹键合，N与式(A) 中的R²键合)；

上述式(A)中的R²是糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽、 或者R²意指-R⁶-R⁷，其中，R⁶表示糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成 的多肽，R⁷表示氢原子(H)、-NH₂、经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经 取代或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、 核酸、或PEG。

本发明的糖链加成连接子，于一实施方案中，可成为硫代芳基型的糖 链加成连接子。

在本说明书中，硫代芳基型的糖链加成连接子意指可经由硫酯键与生 理活性物质键合的糖链加成的连接子，且其结构内具有芳基结构的糖链加 成的连接子。

更具体而言，硫代芳基型的糖链加成连接子为式(A)所表示的如下述的 糖链加成连接子：

上述式(A)中的X为具有离去基团的硫原子(S)；

上述式(A)中的R¹为经取代或未经取代的C₁至C₅芳基、或经取代或 未经取代的C₅至C₁₆杂芳基；

上述式(A)中的Y可存在于式(A)中，亦可不存在，在Y存在于式(A) 中时，Y为-CO-、或-CONH-(但是，C与式(A)中的R¹键合，N与式(A)中 的R²键合)；

上述式(A)中的R²为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的多肽， 或者R²意指-R⁶-R⁷，其中，R⁶为糖链、糖链加成的氨基酸、或糖链加成的 多肽，R⁷为氢原子(H)、-NH₂、经取代或未经取代的C₁至C₅烷基、经取代 或未经取代的C₅至C₁₆芳基、经取代或未经取代的C₅至C₁₆杂芳基、核酸、 或PEG。

在本发明的一优选实施方案中，本发明的含有糖链加成连接子部分及 生理活性物质部分的化合物或其盐中所含的糖链优选是均一的。在本说明 书中，“糖链是均一的”意指当比较糖链加成连接子部分彼此之间的糖链时， 糖链加成部位、构成糖链的各个糖的种类、键合顺序、及糖之间的键合样 式在糖链加成连接子部分彼此之间是相同的。而且，意图制作在糖链加成 连接子部分之中加成多个相同糖链时，“糖链是均一的”意指当比较糖链加 成连接子部分内所加成的多个糖链的结构时，构成糖链的各个糖的种类、 键合顺序、及糖之间的键合样式是相同的。具体而言，“糖链是均一的”意 指当比较糖链加成连接子部分彼此之间或糖链加成连接子部分中的糖链 时，至少90％以上、优选95％以上、更优选99％以上的糖链在结构上是均 一的。

均一的糖链的比例或均一的糖链加成连接子的比例可通过使用例如， HPLC、毛细管电泳、NMR、质谱分析等的方法而测定。

本发明中所使用的氨基酸序列及/或糖链实质上是均一的的糖链加成 的氨基酸或糖链加成的多肽，可通过固相合成、液相合成、基于细胞的合 成、分离提取天然产物的方法等本领域技术人员公知的肽制造方法，结合 糖链加成步骤而制造。关于这样的糖链加成的多肽的制造方法，可参照例 如，国际公开第2010/021126号小册子、国际公开第2004/005330号小册子 等。

而且，关于糖链加成的步骤中所用的糖链的制造方法，可参照例如， 国际公开第03/008431号小册子、国际公开第2004/058984号小册子、国际 公开第2004/008431号小册子、国际公开第2004/058824号小册子、国际公 开第2004/070046号小册子、国际公开第2007/011055号小册子等。

虽无限定，然而在一实施方案中，本发明所使用的糖链加成的多肽亦 可包括：将未键合氨基酸的糖链直接或经由连接子键合于氨基酸、或多肽 上的氨基酸而成的糖链加成的氨基酸或糖链加成的多肽；在糖链加成的氨 基酸或糖链加成的多肽中，通过在加成的糖链上进一步加成糖或糖链来使 已加成的糖链伸长而得的糖链加成的多肽；使1个或多个(例如，2个至30 个，优选为2个至10个)氨基酸键合于糖链加成的氨基酸的例如，氨基及/ 或羧基上，而使其与氨基酸或多肽进一步连接而成的糖链加成的多肽；使 氨基酸所键合的糖链经由连接子而键合于多肽上的氨基酸而成的糖链加成 的多肽等。

而且，通过用糖转移酶将各种糖(例如，岩藻糖等)转移至本发明中的 糖链加成的氨基酸或糖链加成的多肽，可有效率地得到具有所期望的糖链 结构的糖链加成的氨基酸或糖链加成的多肽。例如，通过用糖转移酶(岩藻 糖转移酶)将岩藻糖转移，可得到含有岩藻糖的具有所期望的糖链结构的糖 链加成的氨基酸或糖链加成的多肽。而且，依赖于所使用的糖转移酶，可 得到结合样式不同的具有期望糖链结构的糖链加成的氨基酸或糖链加成的 多肽。

就岩藻糖而言，可使用一般市售的岩藻糖或化学合成的岩藻糖。

就岩藻糖转移酶而言，可使用一般市售的、天然存在的、通过基因重 组所生产的岩藻糖转移酶，且可依照转移的岩藻糖种类而适宜选择岩藻糖 转移酶。具体而言，可列举：使岩藻糖转移至糖链天冬酰胺的非还原末端 侧的N-乙酰葡糖胺的酶，即岩藻糖转移酶V(Fucosyltransferase V)(人类， 重组物、来自血浆、来自血清、来自乳汁、来自肝脏)等。而且，通过使用 岩藻糖水解酶、经由pH调整等使平衡移动，亦可使岩藻糖转移。

在本说明书中，「核酸」意指包含碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶、尿嘧啶)、糖残基、及磷酸的核苷酸以磷酸酯键键合而成的DNA 或RNA，其具有2至2000个核苷酸残基。

而且，在本说明书中，「PEG」为乙二醇的聚合物，例如，可以以 「(-CH₂-CH₂-O-)_n」(n为2至10000的整数)表示。

在本发明的一实施方案中，糖链加成连接子优选为以式(A)：X-R¹-Y-R²所表示的糖链加成连接子，其中：

X意指具有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)；

R¹为诸如苯甲基、或甲苯基等芳基，或者R¹意指-R³-R⁴-R⁵-，R³为 -CH₂CH₂-，R⁴为硫原子(S)，R⁵为-CH₂-(亦即，R¹为以-CH₂CH₂SCH₂-所示 的硫醚)；

Y意指-CO-；

R²意指NH-糖链、糖链加成的Asn、糖链加成的Cys、或其中于C末 端加成1个或多个(例如，2个、3个、4个、5个)氨基酸的糖链加成的Asn 或糖链加成的Cys。

本发明的糖链加成连接子可通过固相合成、液相合成等而制造。

例如，在通过固相合成制造式(A)：X-R¹-Y-R²所示的糖链加成连接子 时，依照于树脂上R²、Y(只于存在时)、R¹、X的顺序，使适当的化合物 键合于树脂上。此时，R²、Y、R¹、X可分别在组分(constituent)的基础 上而依序键合于树脂上，亦可使相当于多个连续组分的化合物键合于树脂 上。就使相当于多个连续组分的化合物键合于树脂上的实例而言，例如， 首先，在树脂上使具有离去基团的R²键合。继而，通过使一个式X-R¹-Y 的化合物(其中，在Y的末端具有离去基团)与树脂上的R²缩合，使R²及Y 的离去基团脱离，以在树脂上制作式(A)：X-R¹-Y-R²所示的糖链加成连接 子。此外，相当于多个连续组分的化合物不限于X-R¹-Y，亦包含从X、R¹、 Y、R²的4个组分所选出的2个以上组分的其他组合。

在下文中展示固相合成法的更具体的制造例。

亦即，通过固相合成法的制造方法包括：

使具有离去基团的R²的化合物(糖链、糖链加成的氨基酸、糖链加成 的多肽等)键合于树脂的步骤；

使至少具有2个离去基团的Y键合于树脂上的R²的步骤，其中，通 过R²及Y的离去基团脱离，而使R²与Y结合；

使相当于至少具有2个离去基团的R¹部分的化合物键合于树脂上的 Y-R²的步骤，其中，通过Y及R¹的离去基团脱离，而使Y与R¹键合；

使相当于至少具有2个离去基团的X部分的化合物键合于树脂上的 R¹-Y-R²的步骤，其中，通过R¹及X的离去基团脱离，而使R¹与X键合；

将于树脂上所合成的X-R¹-Y-R²从树脂切离的步骤。

而且，例如，通过固相合成法制造糖链加成连接子的方法中，在利用 一相当于X-R¹-Y部分的化合物，并使其键合于树脂上的制造例中，通过 包括下述步骤的制造方法，可制作糖链加成连接子，这些步骤为：

使具有离去基团的R²的化合物(糖链、糖链加成的氨基酸、糖链加成 的多肽等)键合于树脂上的步骤；

使式X-R¹-Y的化合物(其中，在Y的末端具有离去基团)键合于树脂上 的R²的步骤，其中，通过R²及Y的离去基团的脱离，使得R²与Y缩合， 而在树脂上形成X-R¹-Y-R²；

将在树脂上合成的X-R¹-Y-R²从树脂切离的步骤。

此外，在固相合成法中的糖链加成连接子的制造方法中，可在未将于 树脂上所形成的糖链加成连接子从树脂切断下，进一步连接氨基酸(更具体 而言，可使氨基酸进一步连接于X所示的具有离去基团的氧原子或具有离 去基团的硫原子)。由此，不必将糖链加成连接子从树脂切离，即可在树脂 上制造含有生理活性物质部分及糖链加成连接子部分的化合物。

关于使用于固相合成的树脂，就树脂(resin)而言，只要为通常使用于 固相合成的树脂(resin)即可，可使用例如，用氯官能化的2-氯三苯甲基氯 树脂(Merck公司制)、用氨基官能化的Amino-PEGA树脂(Merck公司制)、 具有羟基的NovaSyn TGT醇树脂(Merck公司制)、Wang树脂(Merck公司 制)、HMPA-PEGA树脂(Merck公司制)、Link Amide树脂(Merck公司制) 等。而且，Amino-PEGA树脂与氨基酸之间可存在连接子，就这样的连接 子而言，可列举如：4-羟基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧 基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。亦可使用C末端的氨基酸预先键合于树脂 上而成的H-Cys(Trt)-三苯甲基NovaPEG树脂(Merck公司制)等。

而且，在将通过固相合成制造的糖链加成连接子内所存在的氨基酸或 肽的C末端酰胺化时，可使用例如，用氨基官能化的Rink-Amide-PEGA 树脂(Merck公司制)。通过将该树脂与肽用酸切断，可将糖链加成连接子中 的氨基酸或肽的C末端氨基酸酰胺化。

此外，从于固相合成中延长肽链时，可防止末端的Cys的消旋化的观 点而言，优选的是2-氯三苯甲基氯树脂。

使相当于R²部分的化合物(糖链、糖链加成的氨基酸、糖链加成的多 肽等)键合于树脂上的步骤中，在使糖链加成的氨基酸键合于树脂上时，使 以脂溶性保护基保护氨基酸的糖链加成的氨基酸键合于树脂。而且，在使 糖多肽键合于树脂上时，可以使所需的氨基酸及糖链加成的氨基酸依序键 合于树脂上，以在树脂上合成糖链加成的多肽。

就脂溶性保护基而言，可列举如：9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔丁 基氧基羰基(Boc)基、苯甲基、烯丙基、烯丙基氧基羰基、乙酰基等碳酸酯 类或酰胺类的保护基等。在将脂溶性保护基导入氨基酸时，例如在导入 Fmoc基时，通过添加9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯及碳酸氢钠进行 反应而可导入。反应可于0至50℃，优选为室温，进行约1至5小时。

就以脂溶性保护基保护的氨基酸而言，亦可使用市售的产品。例如， 可列举：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、 Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、 Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、 Fmoc-Pro-OH、Boc-Ser-OH、Boc-Asn-OH、Boc-Val-OH、Boc-Leu-OH、 Boc-Ile-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Tyr-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Lys-OH、 Boc-Arg-OH、Boc-His-OH、Boc-Asp-OH、Boc-Glu-OH、Boc-Gln-OH、 Boc-Thr-OH、Boc-Cys-OH、Boc-Met-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Trp-OH、 Boc-Pro-OH。

而且，就于侧链导入保护基的以脂溶性保护基保护的氨基酸而言，可 列举如：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、 Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Boc-Arg(二 Z)-OH、Fmoc-Asp(OBzl)-OH、Boc-Cys(Bzl)-OH、Boc-Glu(OBzl)-OH、 Boc-His(Dnp)-OH、Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH、 Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Trp(For)-OH、Boc-Tyr(Bzl)-OH。

就以脂溶性保护基保护氨基酸的糖链加成的氨基酸而言，可列举： Fmoc-糖链加成Asn、Boc-糖链加成Asn等。

此外，加成具有相同糖链结构的糖链的氨基酸用作这些糖链加成的氨 基酸。就此种糖链而言，可依照本领域任何公知的方法而得到。就具体方 式而言，虽无限定，不过可利用例如，化学合成糖链(例如，参照J.Seifert  et al.Angew Chem Int.Ed.2000,39,p531-534)，或从天然或人工的糖链供应 源分离的糖链或市售产品。在该方式中，就加成具有相同结构的糖链的氨 基酸而言，并无限定，可通过例如，WO第2004/058789号中记载的方法， 进行从天然或人工的糖链供应源相同结构的糖链的分离。具体而言，从鸡 蛋等天然糖链供应源，以Seko et al.,Biochim Biophys Acta.1997；1335(1-2): 23-32等记载的方法，将含有糖链天冬酰胺的混合物(唾液酸糖肽(SGP))分 离，在该糖链天冬酰胺中导入脂溶性保护基(例如，Fmoc)，以得到糖链天 冬酰胺衍生物的混合物，通过将该混合物进行层析，可将该混合物中所含 的各种结构的糖链依照其结构分离。而且，具有各种保护基或不具有保护 基的特定结构的糖链天冬酰胺，可从例如，糖链工学研究所股份有限公司 取得。

使树脂与氨基酸或糖链加成的氨基酸键合的反应，优选通过以下进行 例如，将树脂置入固相管柱中，将该树脂用溶剂洗净，然后添加氨基酸的 溶液。就洗净用溶剂而言，可列举如：二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二 氯甲烷等。就溶解氨基酸的溶剂而言，可列举如：二甲基亚砜(DMSO)、 DMF、二氯甲烷等。树脂与氨基酸或糖链加成的氨基酸的键合反应可于0 至50℃，优选于室温，进行约10分钟至30小时，优选约15分钟至24小 时。

此时，就缩合剂而言，可使用如：二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮基磷酸二苯酯 (DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基膦酸二乙酯(DEPC)、1,3-二异丙基碳二亚 胺(DIC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基鏻盐(PyBOP)、3-二乙 氧基磷酰基氧基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、1-羟基苯并三唑 (HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮 杂苯并三唑(HOAt)、3-羟基-4-氧代-3,4-二氢-5-氮杂苯并-1,2,3-三嗪 (HODhbt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并 三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(6-氯-1H-苯并三唑 -1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HCTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1- 基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟膦酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲 基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)等。氨基酸或糖链加成氨基酸与脱水缩合剂的使 用比例是相对于前者的1重量份，后者通常为1至10重量份，优选为2 至5重量份。

此外，使用于非还原末端具有唾液酸的糖链时，从树脂切断的步骤中 通过酸处理，而可以使唾液酸被解离。因此，在使用酸进行切断步骤之前， 将具有唾液酸的糖链导入连接子部分时，优选使用所要导入的糖链上的唾 液酸的羧基是以保护基保护的糖链。就唾液酸的羧基的保护基而言，可列 举：包含苯甲基(Bn)基等的芳基；包含乙基(Et)或甲基(Me)等的烷基；二苯 基甲基；苯甲酰甲基；形成环结构的碳上所键合的氢原子经硝基等取代的 苯甲酰甲基等。更具体而言，例如，优选将唾液酸的羧基用如-COOBn、 -COOEt、-COOMe、-COOCH(Ph)₂、-COOCH₂COPh、-COOCH₂PhOMe、 -COOCH₂Ph(OMe)₂、-COOCH₂PhNO₂、或-COOCH₂Ph(NO₂)₂所示的方式保 护的保护基。如此种方式，通过将唾液酸的羧基以苯甲基等保护，可防止 在酸中不稳定的唾液酸的脱离。

糖链上的唾液酸的羧基的保护反应可依照本领域技术人员所周知的 方法进行。通过例如，苯甲基、二苯基甲基、苯甲酰甲基所保护的唾液酸 的羧基的保护基亦可依照本领域技术人员所公知的方法进行脱保护。例如， 脱保护的反应，虽不限定以下者，但可通过于碱性条件下水解而进行。脱 保护的反应通常可于0至50℃，优选于0至40℃，更优选于0至30℃进 行。反应时间优选通常为约5分钟至5小时。反应结束后，通过磷酸或乙 酸等弱酸中和，之后，可用适宜、公知的方法(例如，高效液相色谱(HPLC)) 纯化。

而且，R²为核酸、PEG时，本领域技术人员亦可依照公知的方法，使 相当的化合物适当地键合于树脂上。

而且，R²为糖链时，可通过于树脂上合成未加成糖链的连接子的结构， 并将糖链加成于从树脂切断·分离后的连接子的末端上而制造。在将要加 成糖链的连接子的末端以具有巯基的方式来设计。由此，使存在于从树脂 分离后的连接子末端的巯基与卤乙酰化的复合型糖链衍生物(或卤乙酰胺 化的复合型糖链衍生物)键合，以于连接子末端导入糖链。

而且，R²为核酸或PEG时，亦可于树脂上合成未加成核酸或PEG的 连接子结构，并可以将核酸或PEG加成于从树脂切断·分离后的连接子末 端，以制造核酸或PEG加成的连接子。在将要加成核酸或PEG的连接子 的末端以具有例如巯基的方式来设计。由此，使存在于从树脂分离后的连 接子末端的巯基与卤乙酰化体(或卤乙酰胺化体)等的核酸或PEG键合，以 导入核酸或PEG。

而且，即使R²可为糖链加成的氨基酸或糖链加成的多肽，亦可先在树 脂上仅合成未加成糖链的连接子的结构，然后使糖链键合于R²处。使糖链 键合于R²的反应，可继固相合成之后在树脂上进行，或亦可在从树脂切离 后进行。在继固相合成之后于树脂上使糖链键合时，可于合成至生理活性 物质部分后进行糖链加成的步骤，亦可于合成生理活性物质部分前进行糖 链加成的步骤。

为了加成糖链至合成的连接子或具有连接子部分及生理活性物质部 分的化合物，如上述，可以使卤乙酰化复合型糖链衍生物(或卤乙酰胺化复 合型糖链衍生物)与该连接子(包含无保护的Cys)或具有该连接子部分及生 理活性物质部分的化合物(包含无保护的Cys)反应，从而使糖链与无保护的 Cys的巯基反应，而与肽键合。上述反应优选于磷酸缓冲液、Tris盐酸缓 冲液、柠檬酸缓冲液、乙腈、DMSO、或它们的混合溶液中，通常于0至 80℃，优选于10至60℃，更优选于15至35℃进行。反应时间通常为10 分钟至24小时，优选通常为约30分钟至5小时。反应结束后可用适宜、 公知的方法(例如，HPLC)纯化。

卤乙酰化复合型糖链衍生物(或卤乙酰胺化复合型糖链衍生物)为例如 以下这样的化合物：将键合于复合型天冬酰胺连接型糖链的还原末端第1 位的碳的羟基经-NH-(CH₂)_a-(CO)-CH₂X(X为卤素原子，a为整数，只要不 阻碍目标连接子的功能便没有限定，不过优选表示0至4的整数)置换的化 合物。

就更具体的卤乙酰化复合型糖链衍生物与含Cys的肽的反应例而言， 可于磷酸缓冲液中，于室温反应。反应结束后，通过以HPLC纯化，可得 到经糖链加成的Cys置换的糖链加成的多肽。

而且，亦可于诸如DMSO、DMF、甲醇、乙腈等有机溶剂与上述缓冲 液的混合溶液中进行反应。此时，可以有机溶剂的比率为0至99％(v/v)的 范围，添加于上述缓冲液中。对于在缓冲液中溶解性低的含无保护Cys的 肽，优选添加这样的有机溶剂，因为可使在反应溶液中的溶解性提高。

而且，亦可于诸如DMSO、DMF、甲醇、乙腈的有机溶剂，或它们的 混合溶液中进行反应。此时，优选于碱存在下进行反应。就碱而言，可列 举如：DIPEA、三乙基胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。

而且，亦可于将胍盐酸盐或尿素添加于缓冲溶液的混合溶液中进行反 应。此外，胍盐酸盐或尿素可以以最终浓度成为1M至8M的方式添加于 上述缓冲液中。胍盐酸盐或尿素的添加也是优选的，因为可使在缓冲液中 溶解性低的肽的溶解性提高。

而且，关于作为卤乙酰化体(或卤乙酰胺化体)等的核酸或PEG、与含 有Cys的肽的反应，本领域技术人员亦可依照公知的方法适宜实施。

对于使相当于Y部分的化合物键合于树脂上的R²的步骤、使相当于 R¹部分的化合物键合于树脂上的Y-R²的步骤、使相当于X部分的化合物 键合于树脂上的R¹-Y-R²的步骤中，本领域技术人员可适当设计·选择相 当于各组分的化合物，以与树脂上的R²缩合。

而且，本领域技术人员在使相当于多个连续组分的化合物键合于树脂 上时，亦可适当设计·选择化合物及反应条件。

此外，相当于糖链加成连接子的X的部分(具有离去基团的氧原子或 具有离去基团的硫原子)，于合成上可能需要保护基。就氧原子的保护基而 言，可列举：三苯甲基、甲氧基三苯甲基、叔丁基、苯甲基等；就硫原子 的保护基而言，可列举：三苯甲基、甲氧基三苯甲基、叔丁基、叔丁硫基、 Acm基等。保护基的导入可依照先前公知的方法进行。

将树脂上所合成的糖链加成连接子(式(A)：X-R^1-Y-R²)从树脂切离的步 骤，优选用酸处理来进行。就酸而言，可列举如：三氟乙酸(TFA)、三异丙 基硅烷、乙二硫醇及水的混合溶液(90：5：2.5：2.5)、乙酸与三氟乙醇的 混合溶液(50：50)、HCl等。

而且，在树脂上合成糖链加成连接子与生理活性物质键合而成的化合 物时，从树脂切离该化合物的步骤，亦优选用酸进行处理。所用的酸或反 应条件，可以以与将糖链加成连接子从树脂切离的条件同样的方式进行。

以此种方式制造的糖链加成连接子，于具有离去基团的氧原子或具有 离去基团的硫原子处，与生理活性物质结合。如此，糖链加成连接子通过 与生理活性物质结合，可提高该生理活性物质的水溶性。而且，糖链加成 连接子优选降低该生理活性物质的抗原性。

而且，与生理活性物质键合的糖链加成连接子可依赖于其结构，于特 定的温度及pH条件下，使该生理活性物质于一定时间内游离。此外，该 游离的生理活性物质保持原本的功能，例如，在生物体内，从糖链加成连 接子游离的生理活性物质可发挥原本的功能。

而且，糖链加成连接子部分与生理活性物质部分的键是硫酯键时，与 酯键相比，硫酯键可加快水解速度。而且，硫酯键之中，具有硫代芳基结 构的糖链加成连接子比具有硫代烷基结构的糖链加成连接子更快速地水 解。

本领域技术人员可通过适当变更糖链加成连接子部分的结构，而设计 具有所期望的生理活性物质释放时间的糖链加成连接子。

在本发明中，生理活性物质可通过其结构的一部分变化(通过被修饰)， 而与糖链加成连接子部分键合。不过，一旦糖链加成连接子部分被切断， 生理活性物质将游离出。优选地，该游离的生理活性物质的结构与键合于 糖链加成连接子部分之前(被修饰前)的化合物结构相同。在本说明书中， 将未键合于糖链加成连接子的生理活性物质称为「未修饰的生理活性物 质」。优选地，未修饰的生理活性物质虽然具有生理活性物质本身原有的药 代动力学特性、免疫原性特性、毒物学或药理学的特性，不过其特性亦可 被改变、修饰等。优选地，本发明的「含有糖链加成连接子部分及生理活 性物质部分的化合物或其盐」通过在规定的条件下切断糖链加成连接子部 分，而释放出未修饰的生理活性物质。

优选地，本发明的糖链加成连接子不会对成为键合伙伴的生理活性物 质所具有的药代动力学特性、免疫原性特性、毒物学或药理学的特性等产 生不良影响。

在本说明书中，「生理活性物质」虽无限定，但意指对于生物体的生 理活动会直接或间接带来任何作用/影响的物质。生理活性物质可意图在试 管内及活体内使用。该生理活性物质可以本身在生物体内无法发挥功能。 该生理活性物质，在某些实施方案，可以以与药物相同的意义来使用。该 生理活性物质不仅包括可用作疫苗或医药品的物质，亦可包括对于生物体 的生理活动不会造成直接作用/影响的物质，例如诊断药。而且，该生理活 性物质不仅包括天然存在的物质，亦可包括部分缺失、修饰或置换的产物 (亦称为衍生物)。此外，亦可包含人工合成的物质(例如，通过重组DNA 技术等生物学途径、或肽固相合成法等化学合成途径所制造的物质)、或天 然存在的物质的部分与人工合成物质的部分的融合产物。因此，在本发明 的生理活性物质中，亦包含，例如，融合有GFP(绿色荧光蛋白质)等报告 (reporter)蛋白质或荧光素等荧光色素的物质。

本发明中的生理活性物质至少具有1个羧基。本发明中的生理活性物 质于生理活性物质所具有的至少1个羧基处与糖链加成连接子键合。而且， 本发明中的生理活性物质，优选为至少具有1个羧基的低分子生理活性物 质或生物高分子。

在本说明书中，「生物高分子」可意指生理活性物质之中的高分子的 有机化合物。另一方面，「低分子生理活性物质」可意指生理活性物质之中 的低分子的有机化合物。生物高分子，可为，例如，蛋白质、核酸或多糖 类等高分子化合物或其部分，或亦可以被人工合成。而且，低分子生理活 性物质可为，例如，在生物体内可与生物高分子相互作用的物质，亦可为 人工合成的物质。不过，在本说明书中，生物高分子与低分子生理活性物 质，视情况可以是彼此相同的。

本发明中的生物高分子，于一实施方案中，优选是至少具有1个羧基 的蛋白质、多肽、多核苷酸、或肽核酸，或者于其结构的一部分含有该「蛋 白质、多肽、多核苷酸、或肽核酸」。在本说明书中，将来自蛋白质或多肽 的部分亦称为「肽部分」。

在本说明书中，「蛋白质」，只要包含通过酰胺键而键合的多个氨基酸 即可，则无特殊限定，其包括已知的蛋白质、新颖蛋白质、或它们的变体。 在本说明书中，所谓的「变体」，是将蛋白质以天然或人工的方式部分改变 而成的化合物。就这样的改变而言，可列举如：蛋白质的1个或多个氨基 酸残基的烷基化、酰基化(例如乙酰基化)、酰胺化(例如，蛋白质的C末端 的酰胺化)、羧基化、酯化、二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、羟基 化、脱水缩合或标识成分的键合等。或者，关于该变体，可列举已知蛋白 质或新颖蛋白质的结构的部分缺失、置换或融合产物等。在作为生理活性 物质的生物高分子是蛋白质的情况，蛋白质，可通过使用但并不限于例如： 固相合成、液相合成、基于细胞的合成、天然存在的蛋白质的分离提取的 方法等本技术领域人员公知的方法来合成。

在本说明书中，「多肽」及「肽」，原则上可以以与蛋白质相同的意义 来使用。但是，多肽及肽，可被用于指称蛋白质的结构的部分的情况，或 没有采取高级结构的较短氨基酸链的情况(亦即，蛋白质的片段)。在本发 明中的多肽或肽中，亦可包含，例如：2个氨基酸键合而成的二肽、3个氨 基酸键合而成的三肽、4个氨基酸键合而成的四肽、以数目通常为10个以 下的氨基酸键合而成的寡肽。

在本说明书中的「多核苷酸」中，虽无限定，但可包含：具有2至2000 核苷酸残基的单链或双链的DNA或RNA；单链或双链的siRNA、miRNA 或核酸(DNA或RNA)适体(aptamer)；或它们的经化学修饰的化合物。在这 样的修饰中，虽无限定，但可列举：用对该多核苷酸的全部或部分进一步 赋予电荷、极化性(polarizability)、氢键、静电相互作用、或流动性(fluxionality) 的其他化学基团进行的修饰。多核苷酸可为具有20个碱基对或更小尺寸的 寡核苷酸。

在本说明书中，「肽核酸」，虽无限定，但意指将核酸(DNA或RNA) 的糖磷酸骨架变换成N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架而成的经修饰的核酸。此 肽核酸，可通过本技术领域人员公知的方法进一步修饰。

在本发明中的生物高分子中，虽非限定于以下，但于一实施方案中， 包括：例如促肾上腺皮质激素(ACTH)、催产素(oxytocin)、腺苷脱氨酶、半 乳糖苷酶(agalsidase)、α1抗胰蛋白酶、α1蛋白酶抑制剂、阿替普酶 (alteplase)、胰淀素(amylin)、普兰林肽(symlin)、阿尼普酶(anistreplase)、安 克洛丝氨酸蛋白酶(ancrod serine protease)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑 肽酶(aprotinin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿托西班(atosiban)、阿片肽 (biphalin)、比伐卢定(bivalirudin)、骨形成蛋白质、胰腺胰蛋白抑制剂、钙 黏素(cadherin)片段、降钙素(calcitonin)(例如来自鲑鱼)、胶原酶、补体C1 酯酶抑制剂、芋螺毒素(conotoxin)、细胞因子(cytokin)受体片段、DNase、 强啡肽A(dynorphin A)、内啡肽(endorphin)、恩夫韦肽(enfuvirtide)、脑啡 肽(enkephalin)、促红细胞生成素(erythropoietin)、艾塞那肽(exendin)(艾塞 那肽-3或艾塞那肽-4等)、第VII因子(第VIIa因子)、第VIII因子(第VIIIa 因子)、第IX因子、纤溶酶(fibrinolysin)、成纤维细胞生长因子(FGF)、生 长激素释放肽2(GHRP-2)、促卵泡激素、短杆菌肽(gramicidin)、葛瑞林 (ghrelin)、去酰基型葛瑞林、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶 (galactosidase)、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素样肽(艾塞那肽 (exenatide)、GLP-1、GLP-2等)、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、热休克蛋白质(HSP)、磷脂酶 (phospholipase)活化蛋白质(PLAP)、绒毛膜促性腺激素、血红素、水蛭素 (hirudin)、人类丝氨酸蛋白酶抑制剂、透明质酸酶(hyaluronidase)、艾杜糖 苷酸酶(iduronidase)、免疫球蛋白(IgG Fc区等)、白细胞介素(1α、1β、2、3、 4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18或21等)、IL-1受体 拮抗剂(IL-1ra)、胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样成长因子结合蛋白 质(IGFBP)、干扰素(α(α2a、α2b、α2c等)、β(β1a、β1b)、γ(γ1a、γ1b)、λ、 ω、ε、κ等)、细胞内粘附分子、角质形成细胞生长因子(KGF)、P-选择素 (selectin)糖蛋白质配体(PSGL)、转化生长因子、乳糖酶(lactase)、瘦素 (leptin)、亮丙瑞林(leuprolide)、促黄体激素、利尿肽钠(ANP、BNP或CNP、 或其片段)、神经肽Y、胰脂酶(pancrelipase)、胰多肽、木瓜蛋白酶(papain)、 甲状旁腺素(甲状旁腺激素(parathormon)等)、来自血小板的生长因子 (PDGF)、胃蛋白酶(pepsin)、肽YY、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)、 催乳素(prolactin)、蛋白质A、蛋白质C、胸腺肽(thymosin)α1、奥曲肽 (octreotide)、胰泌素(secretin)、舍莫瑞林(sermorelin)、可溶性肿瘤坏死因子 受体、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase)(SOD)、促生长激素(生长激 素)、类生长抑素(somatoprim)、生长抑素(somatostatin)、链激酶 (streptokinase)、蔗糖酶(sucrase)、特利加压素(terlipressin)、破伤风毒素C 片段、半乳糖苷酶(tilactase)、凝血酶(thrombin)、胸腺肽(thymosin)、促甲 状腺激素、促甲状腺素(thyrotropin)、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体、组 织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator)(tPA)、甲状腺激素(降钙素 (calcitonin)等)、尿扩张素(urodilatin)、尿酸氧化酶、尿激酶(urokinase)、半 抗原(hapten)、含有抗原等的疫苗(癌疫苗、HIV抗原、A型肝炎疫苗、B 型肝炎疫苗(HBs抗原等)、流感疫苗、莱姆病(Lyme)疫苗等)、血管内皮生 长因子(VEGF)、趋化素(Chemerin))、HER2蛋白质(人类上皮生长因子受 体)、上皮生长因子(EGF)、血管活性肠肽、抗利尿激素(vasopressin)、齐考 诺肽(ziconotide)、凝集素(lectin)、胆碱脂酶(cholinesterase)、淀粉酶(amylase)、 或胃蛋白酶(pepsin)、或其变体和其片段。

在本发明中的低分子生理活性物质中，于一实施方案中，可列举如： 至少具有1个羧基的中枢神经系统刺激剂、抗感染剂、抗过敏剂、免疫调 节剂、抗肥胖剂、抗凝血剂、抗糖尿病剂、抗癌剂、抗肿瘤剂(antineoplastic  agent)、抗菌剂、抗真菌剂、镇痛剂、避孕药、抗炎症剂、类固醇剂、血管 扩张剂、血管收缩剂或心血管促效药。

在本发明中的低分子生理活性物质中，虽无限定，但就一实施方案而 言，包括，例如，阿卡波糖(acarbose)、阿拉丙酯(alaproclate)、阿仑膦酸盐 (alendronate)、金刚烷胺(amantadine)、丁胺卡那霉素(amikacin)、阿米庚酸 (amineptine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨磺必利(amisulpride)、氨氯 地平(amlodipine)、氨托沙林(amotosalen)、阿莫沙平(amoxapine)、阿莫西林 (amoxicillin)、安非他命(amphetamine)、两性霉素B(amphotericin B)、安比 西林(ampicillin)、安普那韦(amprenavir)、氨利酮(amrinone)、阿尼利定 (anileridine)、阿可乐宁(apraclonidine)、安普霉素(apramycin)、阿替卡因 (articaine)、阿替洛尔(atenolol)、托莫西汀(atomoxetine)、阿维扎封 (avizafone)、巴氯芬(baclofen)、贝那普利(benazepril)、苄丝肼(benserazide)、 苯佐卡因(benzocaine)、倍他洛尔(betaxolol)、博来霉素(bleomycin)、溴芬酸 (bromfenac)、溴法罗明(brofaromine)、卡维地洛(carvedilol)、去甲伪麻黄碱 (cathine)、卡西酮(cathinone)、磺胺丁脲(carbutamide)、头孢氨苄(cephalexin)、 克林沙星(clinafloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、去铁胺(deferoxamine)、 地拉韦啶(delavirdine)、地昔帕明(desipramine)、柔红霉素(daunorubicin)、 右哌甲酯(dexmethylphenidate)、氨苯砜(diaphenylsulfone)、地卓西平 (dizocilpine)、多巴胺(dopamine)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多佐胺 (dorzolamide)、多柔比星(doxorubicin)、度洛西汀(duloxetine)、依氟鸟氨酸 (eflornithine)、依那普利(enalapril)、肾上腺素(epinephrine)、表柔比星 (epirubicin)、麦角灵(ergoline)、厄他培南(ertapenem)、艾司洛尔(esmolol)、 依诺沙星(enoxacin)、乙胺丁醇(ethambutol)、芬氟拉明(fenfluramine)、非诺 多泮(fenoldopam)、非诺特罗(fenoterol)、芬戈莫德(fingolimod)、氟卡胺 (flecainide)、氟伏沙明(fluvoxamine)、福沙那韦(fosamprenavir)、夫罗曲坦 (frovatriptan)、速尿(furosemide)、氟西汀(fluoxetine)、加巴喷丁(gabapentin)、 加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、庆大霉素(gentamicin)、格 帕沙星(grepafloxacin)、海克卡因(hexylcain)、肼苯哒嗪(hydralazine)、氢 氯噻嗪(hydrochlorthiazide)、艾芬净喷(icofungipen)、伊达比星(idarubicin)、 咪喹莫特(imiquimod)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、伊拉地平(isradipine)、 卡那霉素A(kanamycin A)、氯胺酮(ketamine)、拉贝洛尔(labetalol)、拉米夫 定(lamivudine)、左布诺洛尔(levobunolol)、左旋多巴(levodopa)、左旋甲状 腺素(levothyroxine)、赖诺普利(lisinopril)、洛美沙星(lomefloxacin)、氯碳头 孢(loracarbef)、麦普替林(maprotiline)、甲氟喹(mefloquine)、美法仑 (melphalan)、美金刚(memantine)、美罗培南(meropenem)、美沙拉嗪 (mesalazine)、三甲氧苯乙胺(mescaline)、甲基多巴(methyldopa)、亚甲二氧 基甲基苯丙胺、美托洛尔(metoprolol)、米那普仑(milnacipran)、米托蒽醌 (mitoxantrone)、莫西沙星(moxifloxacin)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、 诺氟沙星(norfloxacin)、去甲替林(nortriptyline)、新霉素B(neomycin B)、制 霉菌素(nystatin)、奥斯他韦(oseltamivir)、帕米膦酸(pamidronate)、帕罗西 汀(paroxetine)、帕珠沙星(pazufloxacin)、培美曲塞(pemetrexed)、培哚普利 (perindopril)、苯甲吗啉(phenmetrazine)、苯乙肼(phenelzine)、普瑞巴林 (pregbalin)、普鲁卡因(procaine)、伪麻黄碱(pseudoephedrine)、普罗替林 (protriptyline)、瑞波西汀(reboxetine)、利托君(ritodrine)、萨巴比星 (sabarubicin)、沙丁胺醇(salbutamol)、血清素(serotonin)、舍曲林(sertraline)、 西他列汀(sitagliptin)、索他洛尔(sotalol)、壮观霉素(spectinomycin)、磺胺嘧 啶(sulfadazine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、舍曲林(sertraline)、磺胺林 (sulfalene)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、他克林(tacrine)、坦索罗辛 (tamsulosin)、特布他林(terbutaline)、噻吗洛尔(timolol)、替罗非班(tirofiban)、 妥布霉素(tobramycin)、妥卡尼(tocainide)、托氟沙星(tosufloxacin)、群多普 利(trandolapril)、氨甲环酸(tranexamic acid)、反苯环丙胺(tranylcypromine)、 三甲曲沙(trimetrexate)、曲伐沙星(trovafloxacin)、伐昔洛韦(valacyclovir)、 缬更昔洛韦(valganciclovir)、万古霉素(vancomycin)、紫霉素(viomycin)、维 洛沙嗪(viloxazine)、扎西他滨(zalcitabine)、青霉素(penicillin)、头孢菌素 (cephalosporin)、链霉素(streptomycin)、越霉素(destomycin)、春雷霉素 (kasugamycin)、泰乐菌素(tylosin)、红霉素(erythromycin)、竹桃霉素 (oleandomycin)、螺旋霉素(spiramycin)、林可霉素(lincomycin)、黏菌素 (colistin)、杆菌肽(bacitracin)、盐霉素(salinomycin)、莫能菌素(monensin)、 拉沙里菌素(lasalocid)、四环素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)、维 吉尼亚霉素(virginiamycin)、磺胺地索辛(sulfadimethoxine)、恶喹酸(oxolinic  acid)、吡咯米酸(piromidic acid)、双呋脒腙(difurazone)、玉米烯酮 (zearalenone)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)、棒曲霉素(patulin)、 烟曲霉毒素(fumonisin)、赭曲霉毒素(ochratoxin)、河豚毒素(tetrodotoxin)、 冈田酸(okadaic acid)、石房蛤毒素(saxitoxin)或膝沟藻毒素(gonyautoxin)等。

本发明的糖链加成连接子与生理活性物质键合而成的化合物的制造 可通过使依照上述方法合成及分离的糖链加成连接子与生理活性物质键合 而进行。

糖链加成连接子与生理活性物质的键合是通过糖链加成连接子的具 有离去基团的氧原子(O)或具有离去基团的硫原子(S)与生理活性物质的至 少1个羧基进行缩合反应，经由酯键或硫酯键而键合的。

该缩合反应的条件可以由本领域技术人员适宜设定。例如，缩合反应 的缩合剂可使用PyBOP、DMAP、HCTU等。而且，就缩合反应的溶剂而 言，可使用例如：DMF、DMSO、二氯甲烷等。缩合反应可通过使例如氨 基酸侧链经保护的肽与具有巯基的糖链加成连接子溶解于DMF，并添加 PyBOP及DIPEA而进行。此时，在生理活性物质为肽时，优选在低温(-15 ℃至-30℃)进行反应，因为可抑制肽的C末端氨基酸的异构化。

而且，在生理活性物质为肽时，优选该肽的侧链通过保护基保护。保 护肽的侧链的保护基可在糖链加成连接子与该肽键合后进行脱保护。保护 肽的侧链的保护基可使用本领域技术人员所公知的保护基，例如，可使用 上述固相合成中所用的氨基酸的保护基。而且，关于肽的保护基导入或脱 保护，本领域技术人员亦能适当地实施。

而且，在生理活性物质为多肽等时，在固相合成中，通过将构成生理 活性物质的氨基酸等依序直接键合于键合于树脂上的糖链加成连接子，而 可制造含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物。关于在树 脂上通过固相合成法合成生理活性物质部分的反应条件，本领域技术人员 能适当地设定。

在一实施方案中，本发明优选提供通过上述的任一制造方法可得到的 化合物或其盐。可得到的化合物或其盐并不限于通过上述的任一项制造方 法所制造的那些，亦包括通过其他制造方法所制造的那些。

在其他实施方案中，本发明优选提供通过上述的任一制造方法可得到 的(obtained)化合物或其盐。

于一优选实施方案中，通过利用本发明的糖链加成连接子，不论生理 活性物质是否为难溶性的，就本发明的含有糖链加成连接子部分及生理活 性物质部分的化合物或其盐而言，可容易地将生理活性物质溶解于水溶液、 或从水溶液所制备成的乳液中。溶解后，通过该糖链加成连接子部分被切 断，而可以释出放未修饰的生理活性物质。

本发明中的糖链加成连接子部分从「含有糖链加成连接子部分及生理 活性物质部分的化合物或其盐」通过水解反应而切断。而且，在一优选实 施方案中，该糖链加成连接子部分可通过其分子内催化作用，从该「含有 糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」通过自身水解 而切断。然而，该切断并不意图排除例如通过生物体内所存在的酶的切断 (酶可列举如：切断酯键的酯酶)等生物学性切断。

于一优选实施实施方案中，本发明的化合物或其盐溶解于水溶液或乳 液中后，具有依赖于pH及/或温度，糖链加成连接子部分的切断加速的特 征(pH及/或温度依赖性切断)。本发明的化合物或其盐、及本发明的糖链加 成连接子，例如，可于低温(例如-80℃至4℃)及/或低pH(例如pH 1至pH 4) 保存。而且，使糖链加成连接子部分键合于生理活性物质，而制备「含有 糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」的步骤，可于， 例如，低温(例如0℃至25℃)及/或低pH(例如pH 1至pH 7)进行。通过将 糖链加成的氨基酸的N末端的氨基用C₁～C₁₆酰基、Fmoc基、或Alloc基 等保护，亦可使本发明的含有「糖链加成连接子部分及生理活性物质部分 的化合物或其盐」及糖链加成连接子稳定化。

本发明的化合物或其盐优选在接近生理条件的温度及pH(例如，哺乳 动物的生物体内的生理环境或接近其的环境，例如35℃至43℃，pH6.8至 7.8等)使用。

于一优选实施方案中，通过使用本发明的化合物或其盐，可使生理活 性物质有效率地溶解于水溶液、或从水溶液所制备的乳液。因此，于一优 选实施方案中，通过使用本发明的化合物或其盐，即使水溶性低(难溶性) 的生理活性物质，也可进行过滤器灭菌。此外，于另一优选实施方案中， 通过使用本发明的化合物或其盐，即使水溶性低的生理活性物质，亦可施 用至生物体。

于另一优选实施实施方案中，通过使用本发明的化合物或其盐，纵使 是水溶性高的生理活性物质，亦可以高效率溶解于水溶液、或从水溶液制 备成的乳液。因此，本发明的优点在于：在制备含有昂贵的生理活性物质 的制剂或施用这样的制剂过程中，可降低因物质的不溶性等所导致的「损 失」

而且，于一其他优选实施实施方案中，通过适当选择事先已知在溶剂 中的半衰期的本发明的糖链加成连接子，而可控制在体外环境或在活体内 环境中被释出的未修饰生理活性物质的释出的持续时间、时机(timing)。例 如，本发明的糖链加成连接子有利于生理活性物质的递送，该生理活性物 质在施用至生物体内后被期望在期望部位迅速发挥效果。

于一特别优选实施方案中，本发明的「含有糖链加成连接子部分及生 理活性物质部分的化合物或其盐」与未修饰的生理活性物质相比，可提供 提高的水溶性。该提高的水溶性，虽无限定，不过以摩尔浓度计，优选为 2倍至1,000,000倍，更优选为10倍至1,000,000倍，进一步优选为100倍 至1,000,000倍，又进一步优选为500倍至1,000,000倍。本领域技术人员 依照生理活性物质的用途及目的，可适当选择具有必要溶解性的「含有糖 链加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」、或糖链加成连接 子。

对于确定本发明的「含有糖链加成连接子部分及生理活性物质部分的 化合物或其盐」、或未修饰的生理活性物质的溶解度所需要的摩尔吸光系数 (比吸光度)，可通过将已知蛋白质浓度的溶液用作样品通过将紫外可见光 谱(例如，于280nm等紫外线可见光区域的波长)来确定，该已知蛋白质的 浓度可通过本技术领域人员公知的方法，例如，以用氨基酸组成分析或氮 定量法等方法测定。

而且，就本发明的一方面而言，还提供组合物，其包含：含有糖链加 成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐。

本发明的「组合物」除了包含1种以上的本发明的化合物或其盐以外， 亦包含任何1种以上的其他成分(活性成分或非活性成分)。本发明的组合 物的使用，无特别限定，可使用于例如，测定分析系统(例如在体外的测定 分析系统等)。

如上所述，在本发明的一实施方案中，糖链加成连接子部分的糖链的 结构可以是均一的。此时，优选在包含具有该糖链加成连接子部分及生理 活性物质部分的化合物或其盐的组合物中所含的糖链加成连接子部分，不 仅糖链结构是均一的，而且糖链加成连接子部分全体的结构是均一的。糖 链加成连接子部分的结构是均一的，意指在比较该组合物所含的糖链加成 连接子部分彼此的糖链及连接子部分时，糖链加成连接子部分中的糖链加 成部位、构成糖链的各个糖的种类、糖链的键合顺序、糖间的键合样式、 构成连接子部分的结构均为相同的。具体而言，意指组合物中所含的糖链 加成连接子部分中，至少90％以上，优选95％以上，更优选99％以上，糖 链的结构及连接子部分是均一的。

尤其，含有糖链为均一的的糖链加成连接子部分的组合物等质量恒 定，且于医药品的制造、测定等领域中是特别优选的。均一的糖链的比率 或均一的糖链加成连接子的比率可通过使用例如，HPLC、毛细管电泳、 NMR、质谱分析等的方法而测定。

而且，本发明的「医药组合物」是适于医药用途的组合物，其是使用 通常所用的填充剂、膨胀剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润 滑剂等稀释剂或赋形剂，而制剂化成通常的医药组合物的形式的组合物。 就这些医药组合物而言，虽无限定，但可列举如：片剂、丸剂、散剂、液 剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂等。医药组合物的医 药用途可以靶向组合物中所含的生理活性物质(作为生理活性物质部分)涉 及的疾患、疾病。例如，生理活性物质是GLP-1或其衍生物的情况，该医 药用途可以靶向糖尿病等。关于其他医药用途，在也考虑到各生理活性物 质所涉及的疾患、疾病的种类下，本技术领域人员应当可以以同样方式理 解。

在本说明书中，所谓的「药理学上可接受的载体」，没有特殊限制。 通过添加药理学上可接受的载体，可影响本发明的「含有糖链加成连接子 部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」的吸收性及血中浓度，而可带 来体内动态的变化。

特别优选地，在使用抗原作为生理活性物质的情况，本发明的化合物 或其盐及含有其的本发明医药组合物亦可被用作为疫苗。于一优选实施方 案中，例如，纵使为难溶性的抗原，做成本发明的化合物或其盐则也可溶 解于水溶液或乳液中；而且，在活体内，切断糖链加成连接子部分后，可 释出未修饰的抗原。优选地，本发明的化合物或其盐及糖链加成连接子可 用于肽疫苗等各种疫苗的开发。

于本说明书中，「疫苗」(亦被称为「免疫原性组合物」)意指在接种于 动物之时，可产生免疫应答(response)的物质。疫苗含有抗原或可表达抗原， 由此，可诱导针对抗原的免疫应答。本发明的医药组合物用做疫苗的情况， 不仅可用于病毒感染、细菌感染(败血症等)、传染病的预防或治疗，亦可 用于与免疫应答有关的任何疾患，例如癌症、自体免疫疾患(例如，I型糖 尿病、多发性硬化症、风湿关节炎等)的治疗等。

所谓「抗原」是含有1个以上的抗原表位的分子，可以是能够通过刺 激宿主的免疫系统而诱导抗原特异性免疫应答的任何分子。免疫应答可为 体液性免疫应答及/或细胞性免疫应答。虽然即使约3个至数个(例如5个、 6个)的氨基酸，即可成为1个抗原表位，不过，蛋白质中的1个抗原表位 通常包含7至15个氨基酸、例如8、9、10、12或14个氨基酸。抗原，于 一实施方案中，优选为肽或抗原表位。在将抗原用于癌症的治疗的情况， 该肽亦被称为癌肽。

而且，可将本发明的医药组合物(包含用做疫苗的情况)施用至生物体。 就该施用方法而言，没有特殊限制，可以根据各种制剂形态、患者的年龄、 性别、疾患的状态、其他条件以适合的方法来施用。就片剂、丸剂、液剂、 混悬剂、乳剂、颗粒剂及胶囊剂的情况的施用方法而言，可列举如：经口 施用。而且，在注射剂的情况，可单独，或与葡萄糖、氨基酸等通常的补 液混合，施用至静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内。在栓剂的情况， 施用至直肠内。本发明的医药组合物，在作为疫苗使用时，可皮下注射、 肌肉内注射、经口、残端(stump)式、皮内注射等。

本发明的医药组合物(包含作为疫苗使用的情况)的施用量，可依据用 法、患者的年龄、性别、疾患的程度、其他条件而适当选择。施用次数， 可依据用法、患者的年龄、性别、疾患的程度、其他条件而适宜选择，例 如，3次/1日、2次/1日、1次/1日、此外，依据其血中稳定性，亦可选择 较少频率的施用次数(例如，1次/周，1次/月等)。本发明的医药组合物， 通过糖链连接子部分的切断的慢慢发生，可赋予生理活性物质缓释性。或 者，本发明的医药组合物，通过糖链连接子部分的切断的迅速发生，可赋 予生理活性物质速效性。

而且，在某一方面中，本发明亦关于糖链加成连接子、或「含有糖链 加成连接子部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」在制造用于生理活 性物质所靶向的疾患、疾病的治疗或预防的医药的用途。或者在另外一实 施方案中，本发明亦关于用于糖链加成连接子、或「含有糖链加成连接子 部分及生理活性物质部分的化合物或其盐」在生理活性物质所靶向的疾患、 疾病的治疗或预防上的用途。例如，在生理活性物质为HER2或其衍生物 时，所靶向的疾病可为癌症(例如，乳腺癌)等。关于其他各生理活性物质 所靶向的疾患、疾病的种类，本领域技术人员亦可同样地理解。

本发明的构造为含有生物分解性的性质的加成糖链的糖链加成连接 子，与构造为含有加成PEG的连接子相比，可减轻对于生物体的不良影响。 其结果，可期待在作为医药组合物对生物体施用时的长期间施用。

在本说明书中的水溶液，可以为溶解于作为溶剂的水的物质(例如乙酸) 的任意液体，并包括本技术领域人员公知的或新颖的全部水溶液。

在本说明书中的乳液没有被限定，可以为自水溶液制备的任意制剂。 就乳液而言，虽然没有限定，但可为水包油(O/W型)乳液或油包水(W/O型) 乳液。在水溶液中分散乳化的方法，可使用本技术领域人员公知的方法。

所谓施用(适用)本发明的化合物或其盐、或本发明的医药组合物的对 象，虽无限定，不过包括动物(人类、非人类哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、 犬、猫、兔、牛、马、绵羊、山羊、猪等)或非哺乳动物(例如，鱼类、爬 虫类、两栖类或鸟类))、植物、昆虫、细菌、或来自它们的细胞(包括培养 的细胞)、组织或器官等。或者，该对象可为人造环境(例如体外反应系统 等)。优选地，本发明中的对象为人类。

在本说明书中所使用的用语「方面」、「实施方案」(例如，「一方面」、 「一实施方案」、「其他实施方案」)是表示本发明的优选方面，并非意图解 释本发明的范围仅限定于既定的实施方案的方面。而且，本领域技术人员 应当理解，只要在技术上不发生矛盾，本发明可为上述方面及实施方案的 所有组合。例如，本领域技术人员应当理解，只要在技术上不发生矛盾， 取代基的所有组合的实施方案皆被公开。

在本说明书中所用的用语是用于说明特定的实施实施方案，而非意图 限定发明。

而且，在本说明书中所用的「含有」用语，排除上下文语意上应做明 显不同理解的情况，而意图表示所记载事项(构件、步骤、要素或数字等) 的存在，但不排除其以外的事项(构件、步骤、要素或数字等)的存在。

除非有不同的定义，本文所用的全部用语(包含技术用语及科学用语)， 与本发明所属技术领域的人员所广泛理解的具有相同意义。在本文中所用 的用语，除非明示不同的定义，否则应被解释成与本说明书及关连技术领 域中的含义一致的含义，而不应被解释成理想化、或过度形式化的含义。

本发明的实施方案，有时会参照示意图来说明，不过在为示意图的情 况，为了明确地说明，有时会被夸张表达。

第1、第2等用语是用于表达多种要素，不过这些要素应被理解成不 受这些用语限定。这些用语仅用于将一个要素与其他要素区别，例如，将 第1要素记载成第2要素，同样地，将第2要素记载成第1要素，均不会 脱离本发明的范围。

在下文中，通过参照实施例而详细地说明本发明。然而，本发明可通 过各式各样的方面而被体现，不可被解释成受限于本文所记载的实施例。

[实施例]

本实施例中所用的简称的一部分如以下说明：

Ac：乙酰基

AcOH：乙酸

Asn：天冬酰胺

Boc：叔丁基氧基羰基

BrAc：溴乙酰胺

Cys：半胱氨酸

DIC：二异丙基碳二亚胺

DIPEA：N,N-二异丙基乙胺

DMAP：4-二甲基氨基吡啶

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亚砜

DTT：二硫苏糖醇(dithiothreitol)

ESI-MS：电喷雾电离(Electro Spray Ionization)质谱

Fmoc(基)：9-芴基甲基氧基羰基

HCL：盐酸

HCTU：O-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HMPB：4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸

HMBA：4-羟基甲基苯甲酸

HOBt：1-羟基苯并三唑

HPLC：高效液相色谱

H₂O：水

MSNT：1-(均三甲苯-2-磺酰基)-3-硝基-1,2,4-三唑

PBS：磷酸缓冲生理食盐水

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

SPPS：肽固相合成

tBu：叔丁基

TFA：三氟乙酸

Trt：三苯甲基

而且，在下述的实施例中，将糖链加成连接子与生理活性物质键合的 化合物记载为偶联物。例如，连接子中的半胱氨酸上具有无唾液酸糖链的 糖链加成连接子，与为生理活性物质的HER2的部分(包含HER的氨基酸 序列中的第8至16号氨基酸的部分)键合的偶联物，记载为糖链加成(Cys (无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物。

此外，HER2(8-16)是相当于HER(人类上皮生长因子受体：Human  Epidermal Growth Factor Receptor)家族之一，即HER2/neu蛋白质的氨基酸 序列中的第8至16个氨基酸残基的肽。该HER2(8-16)具有与HLA(人类白 细胞抗原分子：Human Leukocyte Antigen)之一(即HLA-A24)结合的能力， 其通过HLA介导的抗原呈递而呈现诱导细胞毒性T细胞(CTL)的能力，该 肽片段已被鉴定作为肿瘤疫苗候选肽(Tanaka,H.,et al.,Brit.J.Cancer,84(1), 94-99,2001)。

(实施例1-1：糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物 (化合物1)的合成)

式中，R表示以下的化学式：

于固相合成用管柱中，放入Rink-Amide-PEGA树脂(100μmol)，并以 二氯甲烷及DMF洗净。洗净后，添加含Fmoc-Cys(Trt)-OH(234mg， 0.399mmol)、HCTU(157mg，0.380mmol)、及2,4,6-三甲基吡啶(79.6μL， 0.600mmol)的DMF(2.5mL)溶液，并于室温振动10分钟。10分钟后，以 DMF洗净，之后，将此缩合操作再重复1次。第2次的缩合操作结束后， 将树脂用DMF及二氯甲烷洗净。洗净后，通过以DMF中的20％哌啶处理， 除去Fmoc保护基，得到键合有Cys(Trt)的树脂2。将树脂2用DMF洗净 后，添加4-羟基甲基苯甲酸(61.1mg，0.402mmol)、HCTU(157.8mg，0.381 mmol)、DIPEA(104.5μL，0.600mmol)的DMF(2.5mL)溶液，并于室温振荡。 1小时后，以DMF及二氯甲烷洗净，得到于树脂上键合有HMBA-Cys(Trt) 的化合物3。

于固相合成用管柱中，放入键合有化合物3(100μmol)的树脂的等分试 样，添加含Fmoc-Leu-OH(176.7mg，0.500mmol)、MSNT(148.2mg， 0.500mmol)、及N-甲基咪唑(27.9μL，0.350mmol)的二氯甲烷(5.0mL)溶液， 并于于室温振荡1小时。振荡1小时后，以二氯甲烷及DMF洗净。洗净 后，将Fmoc保护基通过20％哌啶的DMF溶液处理而除去，于树脂上得到 Leu-HMBA-Cys(Trt)4。以DMF洗净后，使用Prelude(商标名)肽合成机， 通过利用Fmoc法的肽固相合成法，于树脂上合成化合物5： Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(Trt)(序 列编号1)。固相合成法中的缩合反应，使用HCTU作为缩合剂，使用N- 甲基吗啉作为碱，于DMF中进行。

将化合物5上的Fmoc保护基通过20％哌啶的DMF溶液处理而除去。 以DMF及二氯甲烷洗净树脂后，添加TFA：三异丙基硅烷：乙二硫醇： 水(＝90：5：2.5：2.5)，于室温振荡3小时。在滤液中添加冷却的醚，得 到为沉淀的粗产物肽6：Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu- Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(序列编号2)。

将所得到的粗产物肽6(15.5mg)溶解于含50mM DTT的DMSO-0.1M 磷酸缓冲液(pH 7.4)混合溶液(9/1，v/v，240μL)中，并添加溶解有30mM 无唾液酸基-BrAc7的DMSO-0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)混合溶液(9/1，v/v， 946μL)，于室温振荡2小时。

使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％TFA水溶液，B： 0.09％TFA/10％水/90％乙腈；以梯度A：B＝60：40→40：60(20分钟)进行 线性浓度梯度洗脱]纯化反应溶液，得到含糖链加成(Cys(无唾液酸基)型) 连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)：Arg-Trp-Gly -Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连接子：HMBA-Cys(无唾液酸基))(序 列编号3)的级分。

使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％AcOH水溶液，B： 0.09％AcOH/10％水/90％乙腈；以梯度A：B＝75：25→60：40(30分钟)进 行线性浓度梯度洗脱]进一步纯化该级分，得到糖链加成(Cys(无唾液酸基) 型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)(17.2mg，5.79μmol)。

ESI-MS：C₁₂₇H₂₀₄N₂₀O₅₈S，计算值：[M+2H]²⁺1485.7、[M+3H]³⁺990.8、 [M+4H]⁴⁺743.3；实测值：1485.7、990.8、743.3。

(实施例1-2：糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物 (化合物8)的合成)

式中，R表示以下的化学式：

将实施例1-1中所得的粗产物肽6(15.5mg)溶解于含50mM DTT的 DMSO-0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)混合溶液(9/1，v/v，240μL)中。在该混合 溶液中，添加含7.5mM二唾液酸基-BrAc9的DMSO-0.1M磷酸缓冲液 (pH7.4)混合溶液(9/1，v/v，3.8mL)，并于室温振荡5小时。

使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％TFA水溶液，B： 0.09％TFA/10％水/90％乙腈；以梯度A：B＝62：38→52：48(30分钟)进行 线性浓度梯度洗脱]纯化反应溶液，得到含糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连 接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)： Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连基团：HMBA-Cys(二唾 液酸基))(序列编号4)的部分。

使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％AcOH水溶液，B： 0.09％AcOH/10％水/90％乙腈，以梯度A：B＝70：30→50：50(30分钟)进 行线性浓度梯度洗脱]进一步纯化该级分，得到糖链加成(Cys(二唾液酸基) 型)的连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)(21.8mg，6.13μmol)。

ESI-MS：C₁₄₉H₂₃₈N₂₂O₇₄S的计算值：[M+2H]²⁺1776.8、[M+3H]³⁺1184.8、[M+4H]⁴⁺888.9；实测值：1776.8、1184.8、888.9。

(实施例1-3：溶解度测定)

对上述的实施例1-1及实施例1-2所得到的糖链加成(Cys(无唾液酸基) 型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成(Cys(二唾液酸)型)连接 子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)，与无糖链加成连接子的未修饰的 HER2-(8-16)肽(化合物10)(Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu)(序列编 号5)，测定在水溶液中的溶解度。

更具体而言，将作为测试对象的糖链加成(Cys(无唾液酸)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)、糖链加成(Cys(二唾液酸)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物8)、或未修饰的HER2(8-16)肽(化合物10)各取 约4.5mg置于微量管中，并添加30μL的水。将微量管于25℃振荡15分 钟后，以25℃，16100×g离心10分钟。离心后，对微量管的上清部分测 定于280nm的吸光度，从所得到的值算出浓度，而求得溶解度。糖链加成 (Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成 (Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)于280nm的摩尔 吸光系数通过以下方式求得：将糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)或糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物8)中的肽链部分于280nm的吸光度，除以通过 氨基酸分析所得的浓度。未修饰的肽于280nm的摩尔吸光系数ε₂₈₀，使用 本领域技术人员所公知的以下式算出。

[算式1]

ε₂₈₀(L·mol^-1·cm^-1)＝n_Trp×5500+n_Tyr×1490+n_SS×125

其中，n_Trp表示色氨酸残基的数目，n_Tyr表示酪氨酸残基的数目，n_SS表示二 硫键的数目。

(参考文献：C.N.Pace et al.,Prot.Sci.,1995,4,2411-2423)。

其结果，未键合糖链加成连接子的HER2(8-16)肽在水中的溶解度为 0.22mg/mL(2.1×10²μM))。此时，能以目视确认微量管中HER2(8-16)肽 的沉淀。另一方面，确认糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16) 偶联物(化合物1)在水中的溶解度为144mg/mL以上。令人惊讶地，即使在 144mg/mL的浓度，亦无法确认糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)的沉淀。而且，确认糖链加成(Cys(二唾液酸 基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)在水中的溶解度为121mg/mL以 上。令人惊讶地，即使在121mg/mL的浓度，亦无法确认糖链加成(Cys(无 唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)的沉淀。从这些结果，可 知糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖 链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)在水溶液 中的溶解度，与未修饰的HER2(8-16)肽(化合物10)比较，以摩尔浓度计， 两者的溶解度皆提高190倍以上(表1A)。

[表1A]

糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物在水中的溶解度

而且，通过与上述在水溶液中的溶解度测定同样的方法，对糖链加成 (Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成 (Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)，及无糖链加成 连接子的未修饰的HER2-(8-16)肽(化合物3)，测定在0.1％乙酸(AcOH)水 溶液中的溶解度。

其结果，未键合糖链加成连接子的HER2(8-16)肽在乙酸水溶液中的溶 解度为0.52mg/mL(4.9×102μM))。此时，可用目视确认微量管中 HER2(8-16)肽的沉淀。另一方面，确认糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接 子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)在乙酸水溶液中的溶解度为110mg/mL以 上。令人惊讶地，即使在110mg/mL的浓度，仍无法确认糖链加成(Cys(无 唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)的沉淀。而且，确认糖链 加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)在乙酸水溶 液中的溶解度为104mg/mL以上。令人惊讶地，即使在104mg/mL的浓度， 仍无法确认糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合 物8)的沉淀。从这些结果，可知糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物8)在水溶液中的溶解度，与未修饰的HER2(8-16) 肽(化合物10)比较，以摩尔浓度计，两者的溶解度皆提高69倍以上(表1B)。

[表1B]

糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物在乙酸水溶液(0.1％AcOH)中 的溶解度

(实施例1-4：水溶液中的水解行为的追踪)

追踪在实施例1-1及实施例1-2中所得到的糖链加成(Cys(无唾液酸基) 型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成(Cys(二唾液酸基)型) 连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)于水解时的行为。通过对冷冻干燥的 糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链 加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)添加预先调 至反应温度(25℃或37℃)的缓冲溶液(乙酸缓冲液(pH 4.0)或PBS(pH 7.4))， 而启动水解反应。而且，反应中的温度使用Block恒温箱维持于恒定温度 (25℃或37℃)。以适当的时间间隔，将一定量的各溶液注射于HPLC，追 踪水解反应。从相当于起始物质的HPLC的峰面积求得相对的起始物质浓 度。以起始物质的相对浓度相对于培育时间作图。其结果，由于可得到直 线状图形，因此显示水解反应为一次反应。而且，从式t_1/2＝ln(2)/k(k为直 线图形的斜率)算出起始物质的消失半衰期t_1/2。将各条件下的糖链加成 (Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成 (Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)的半衰期显示于 表2及表3。

[表2]

糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物 1)的水解半衰期

[表3]

糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物 8)的水解半衰期

确认糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物 1)及糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)的 任一者均慢慢水解，而生成无修饰的HER2(8-16)肽(化合物10)。而且，如 表2及表3所示，确认pH越高，则水解速度越快(编号1与3的比较(25 ℃)，编号2与4的比较(37℃))。而且，确认在pH 7.4的条件下，温度越高， 则水解越快(编号3与编号4的比较)。此外，在pH 4.0，37℃的条件下， 化合物1及化合物8的任一者均非常稳定，于48小时的追踪后，所生成的 水解物10为起始物质的1％以下，可知这些化合物在这些条件下几乎未水 解。而且，在pH7.4，25℃的条件下，具有二唾液酸糖链加成连接子的肽 比具有无唾液酸糖链加成连接子的肽水解速度快。另一方面，在pH7.4， 37℃的条件下，变成具有二唾液酸糖链加成连接子的肽比具有无唾液酸糖 链加成连接子的肽水解速度慢的结果。如此，通过选择要加成的糖链的种 类，可调整特定条件下的优选水解速度。

(实施例2：于固相上的糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物1)的合成)

式中，R表示以下的化学式：

于固相合成用管柱中，放入Rink-Amide-PEGA树脂(100μmol)，以二 氯甲烷及DMF洗净。洗净后，添加含Fmoc-Cys(叔丁基硫基)-OH(173.4mg， 0.402mmol)、HCTU(157mg，0.380mmol)、及2,4,6-三甲基吡啶(79.6μL， 0.600mmol)的DMF(2.5mL)溶液，并于室温振荡10分钟。10分后，将树 脂用DMF洗净。洗净后，通过以20％哌啶的DMF溶液处理，除去Fmoc 保护基，得到于树脂上键合有Cys(StBu(叔丁基硫基))的化合物11。将树脂 上的化合物11用DMF洗净后，添加含4-羟基甲基苯甲酸(60.8mg， 0.400mmol)、HCTU(157mg，0.380mmol)、DIPEA(104.5μL，0.600mmol) 的DMF(2.5mL)溶液，并于室温振荡混合物。10分钟后，用DMF及二氯 甲烷洗净，得到于树脂上键合有HMBA-Cys(StBu)的化合物12。于树脂上 的化合物12中，添加含Fmoc-Leu-OH(176.3mg，0.499mmol)、MSNT(149.0 mg，0.503mmol)、及N-甲基咪唑(27.9μL，0.350mmol)的二氯甲烷(5.0mL) 溶液，并于室温振荡混合物3小时。以二氯甲烷及DMF洗净树脂后，通 过将Fmoc保护基以20％哌啶的DMF溶液处理而除去，得到于树脂上键合 有Leu-HMBA-Cys(StBu)的化合物13。用DMF洗净后，使用Prelude(商标 名)肽合成机，通过Fmoc法的肽固相合成法，在键合有经保护的肽的树脂 上，合成氨基酸侧链经保护的化合物14： Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(StBu) (序列编号6)。缩合反应使用HCTU作为缩合剂，使用N-甲基吗啉作为碱， 于DMF中进行。

于键合有化合物14的树脂的等分试样(10μmol)中，添加含有0.2M碳 酸氢铵水溶液(500μL)及溶解有0.1M DTT的DMF溶液(1mL)，并于室温 振荡。6小时后，用DMF洗净树脂，于树脂上得到化合物15： Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(序列编 号7)。于化合物15中，添加溶解有无唾液酸基-BrAc7(52.8mg，30.0μmol) 及DIPEA(10.5μL，60.3μmol)的DMSO-DMF混合溶液(1/1，v/v，500μ L)，并于室温振荡12小时，于树脂上得到化合物16： Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连接子： HMBA-Cys(无唾液酸基))(序列编号8)。用DMF洗净后，通过将Fmoc保 护基以20％哌啶的DMF溶液处理而除去。用DMF及二氯甲烷洗净树脂后， 添加三氟乙酸：三异丙基硅烷：乙二硫醇：水(＝90：5：2.5：2.5)，并于 室温振荡3小时。于滤液中添加冷却的醚，得到为沉淀的粗产物肽1。使 用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％TFA水溶液，B： 0.09％TFA/10％水/90％乙腈，以梯度A：B＝65：35→53.4：46.6(24分钟) 进行线性浓度梯度洗脱]纯化所得到的粗产物肽1(15.5mg)，得到糖链加成 (Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)： Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连接子：HMBA-Cys(无唾 液酸基))(5.0mg，1.7μmol)。

(实施例3-1：具有硫代烷基结构的糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联 物(化合物20)的合成)

<具有巯基的糖链加成连接子(化合物17)的合成>

将溶解于磷酸缓冲液(0.1M，pH 6.72，4.0mL)的无唾液酸基- BrAc7(131.7mg，75μmol)缓慢地滴加至溶解于磷酸缓冲液(0.1M，pH 6.72，4.0mL)的乙二硫醇(63μL，750μmol，10eq)中，并使其于室温反应 40分钟。通过HPLC确认反应结束后，使用HPLC[管柱：SHISEIDO  CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗 脱液A：0.1％TFA水溶液，B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，梯度A：B＝99： 1(0-1分钟)→80：20(30分钟)]纯化反应产物，得到作为具有巯基的糖链加 成连接子的目标化合物17(118.3mg，产率：89％)。

ESI-MS：C₆₆H₁₁₁N₅O₄₆S₂的计算值：[M+2H]²⁺888.36；实测值：888.34。

<硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)的合成>

式中，R表示以下的化学式：

通过Prelude(商标名)肽合成机，将于树脂上合成的氨基酸侧链经保护 的肽，通过以AcOH-TFE(1/1，v/v)溶液处理而从树脂切出。将滤液于减压 下浓缩干燥，得到氨基酸侧链经保护的肽(化合物18)： Boc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu(序列编号9)。

使所得到的肽(化合物18)(63.5mg，41.8μmol)、具有巯基的糖链加成 连接子(化合物17)(41.5mg，23.4μmol)、PyBOP(121.8mg，234μmol)溶解 于DMF(1mL)，在氮气环境下，冷却至-15℃。在此溶液中添加DIPEA(40.0 μL，40.7μmol)，并于-15℃搅拌。3小时后，添加TFA(100μL)，并于减 压下浓缩干燥。在所得到的残余物中，添加TFA-H₂O(95/5，v/v)溶液(1mL)， 并搅拌3小时。于溶液中添加醚，得到为沉淀的粗产物肽。使用HPLC[管 柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ20x250mm，流速： 7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％TFA水溶液，B：0.09％TFA/10％水/90％乙 腈，以梯度A：B＝65：35→35：55(30分钟)进行线性浓度梯度洗脱]纯化 所得到的粗产物肽，得到硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物 (化合物20)：Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连接子： SCH₂CH₂SCH₂CONH(无唾液酸基))(序列编号10)(6.9mg，产率：10.5％)。

ESI-MS：C₁₁₈H₁₉₆N₁₈O₅₅S₂的计算值：[M+2H]²⁺1406.52、[M+3H]³⁺938.01；实测值：1406.10、937.73。

(实施例3-2：具有硫代芳基结构的糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联 物(化合物21)的合成)

式中，R表示以下的化学式：

于二氯甲烷中，使4-巯基苯基乙酸(化合物22)(1.0g，6.1mmol)与三 苯甲基氯(2.0g，7.1mmol)反应，得到化合物23(2.8g)。在Rink-Amide-PEGA 树脂上，对键合有由2个氨基酸残基组成的糖肽(Asn(无唾液酸基)-Gly)的 化合物24(62μmol)，添加含化合物23(320μmol)、HOBt(50.7mg，375μ mol)、及DIC(54μL，522μmol)的DMF(2.0mL)溶液，于室温振荡1小时， 于树脂上得到化合物25。用DMF及二氯甲烷洗净树脂后，添加TFA：三 异丙基硅烷：水(＝92.5：5：2.5)溶液，并于室温振荡混合物3小时后，将 滤液于减压下浓缩，得到作为糖链加成连接子的化合物26(19.6mg，10μ mol，产率：16％)。

ESI-MS：C₇₆H₁₂₀N₈O₄₉S的计算值：[M+2H]²⁺981.34；实测值：981.37。

使作为糖链加成连接子的化合物26(8.6mg，4.4μmol)、氨基酸侧链 经保护的肽(化合物18)(35.0mg，23.0μmol)、及PyBOP(22.8mg，43.8μ mol)溶解于DMF(0.4mL)中，在氮气环境下，冷却至-15℃。在此溶液中添 加DIPEA(7.5μL，76.4μmol)，并于-5℃至-10℃搅拌混合物。2.5小时后， 添加TFA(50μL)，并于减压下浓缩干燥。在所得到的残余物中添加 TFA-H₂O(95/5，v/v)溶液(1mL)，并搅拌3小时。在溶液中添加醚，得到为 沉淀的粗产物肽。

使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ 20x250mm，流速：7.0mL/分钟；洗脱液A：0.1％TFA水溶液，B： 0.09％TFA/10％水/90％乙腈，以梯度A：B＝65：35→35：55(30分钟)进行 线性浓度梯度洗脱]纯化所得到的粗产物肽，得到硫代芳基型糖链加成连接 子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)： Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(糖链加成连接子：4-硫代苯甲酸 -Asn(无唾液酸基)-Gly)(序列编号11)(2.3mg，产率：17.5％)。

ESI-MS：C₁₂₈H₂₀₅N₂₁O₅₈S₁的计算值：[M+2H]²⁺1500.09、[M+3H]³⁺1000.39；实测值：1499.67、1000.08。

(实施例3-3：溶解度测定)

除了使用硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20) 及硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)代替糖链加 成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成 (Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物7)以外，以与实施 例1-3同样的方式测定硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化 合物20)及硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)在水 中的溶解度。此外，测定未修饰的HER2-(8-16)肽(化合物10)的溶解度作为 比较组。其结果，未键合糖链加成连接子的HER2(8-16)肽在水中的溶解度 为0.22mg/mL(2.1×10²μM))。此时，可用目视确认于微量管中HER2(8-16) 肽的沉淀。另一方面，确认硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联 物(化合物20)在水中的溶解度为77.4mg/mL以上。令人惊讶地，即使在 77.4mg/mL的浓度，仍无法确认硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16) 偶联物(化合物20)的沉淀。而且，确认硫代芳基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物21)在水中的溶解度为76.7mg/mL以上。令人惊 讶地，即使在76.7mg/mL的浓度，仍无法确认硫代芳基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物8)的沉淀。从这些结果，可知硫代烷基型糖链 加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)及硫代芳基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物21)在水溶液中的溶解度，与未修饰的 HER2-(8-16)肽(化合物10)比较，以摩尔浓度计，两者的溶解度均提高100 倍以上。

[表4]

硫代烷基型或硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物在水溶液中的溶解度

(实施例3-4：于水溶液中的水解行为的追踪)

追踪实施例3-1及实施例3-2中所得到的硫代烷基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物20)及硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16) 偶联物(化合物21)于水解时的行为。具体而言，除了使用冷冻干燥的硫代 烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)及硫代芳基型糖链 加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)代替冷冻干燥的糖链加成 (Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)及糖链加成 (Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)，并将反应温度 调成4℃、25℃、或37℃以外，以与实施例1-4同样的方式追踪水解的行 为。

结果，对硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20) 进行水解试验，在进行HPLC分析时，确认未修饰的HER2(8-16)肽(化合 物10)的生成。下述化学式表示硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶 联物(化合物20)的水解反应；化合物27表示通过化合物20的水解反应所 生成的糖链加成连接子。

式中，R表示以下的化学式：

对于硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)，以与 实施例1-4同样的方式，将起始物质的相对浓度对培育时间作图。所得的 图显示于图1A及图1B。而且，将各条件下的硫代烷基型糖链加成连接子 -HER2(8-16)偶联物(化合物20)的半衰期显示于表5。

[表5]

硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)的水解半衰期

如表5所示，PBS中(pH7.4)的水解半衰期，于25℃为5日，相对地， 于37℃为32小时。从此结果可知，硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16) 偶联物(化合物20)是温度越高，则水解速度越快(编号1与2之间的比较(pH 4.0)，编号3、4及5的比较(pH 7.4))。而且，观察37℃的pH的影响时， 由于在乙酸缓冲液(pH4.0)中的水解半衰期为24日，因此确认pH越高，则 越促进水解(编号2与5的比较)。如此，确认与具有酯键的糖链加成连接 子-HER2(8-16)偶联物(化合物1、8)同样地，具有硫酯键的硫代烷基型糖链 加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)亦是温度及/或pH越高，水解速 度越快。

而且，将硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21) 水解，进行HPLC分析时，与硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联 物(化合物20)同样地，确认未修饰的HER2-(8-16)肽(化合物10)的生成。下 述化学式表示硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21) 的水解反应；化合物28表示通过化合物21的水解反应所生成的糖链加成 连接子。

式中，R表示以下的化学式：

而且，对于硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物 21)，亦将起始物质的相对浓度对培育时间作图，所得的图显示于图2A及 图2B。而且，将各条件下的硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联 物(化合物21)的半衰期显示于表6。

[表6]

硫代芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)的水解半衰期

而且，如表6所示，PBS中(pH7.4)的水解半衰期，于4℃为66小时， 于25℃为25小时，相对地，于37℃为4.0小时。从此结果可知，硫代芳 基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)是温度越高，则水解速 度越提高(编号1与2的比较(pH 4.0)，编号3、4及5的比较(pH 7.4))。而 且，观察于37℃的pH的影响时，由于乙酸缓冲液(pH4.0)中的水解半衰期 为10日，因此确认pH越高则越促进水解(编号2与5的比较)。如此，确 认与具有酯键的糖链加成连接子-HER2-(8-16)偶联物同样地，具有硫酯键 的糖链加成连接子-HER2-(8-16)偶联物是温度及/或pH越高，水解速度越 快。

此外，加成无唾液酸糖链的连接子-HER2(8-16)偶联物的化合物20、 21、及1于37℃，PBS中(pH7.4)的水解速度的顺序为：具有硫酯键的硫代 芳基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物21)(4.0小时)>具有硫酯 键的硫代烷基型糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物20)(32小时)> 具有酯键的糖链加成连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物1)(78小时)(图3)。 这些结果显示硫酯型比酯型水解速度快。而且，这些结果还表明在硫酯型 中，硫代芳基型比硫代烷基型水解更快。

(实施例4-1.糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化 合物29)的合成)

此趋化素9由于具有针对G蛋白偶联受体的ChemR23的激动活性， 可作为免疫疾患、炎症性疾患、糖尿病的治疗及/或预防剂。不过，已知趋 化素9由于在活体内会被蛋白质分解酶分解，所以非常不稳定(专利文献日 本特开第2010-229093号)。于此，评估在该趋化素9中导入本发明的一实 施方案的糖链加成连接子而制造的偶联物的水解半衰期。首先，经由酯键， 合成糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子与趋化素9(序列编号12： YFPGQFAFS，相当于专利文献美国公开第2003096299号所公开的序列编 号31-36的氨基酸序列)键合而成的偶联物。

式中，R表示以下的化学式：

于固相合成用管柱中，放入Rink-Amide-PEGA树脂(100μmol)，并以 二氯甲烷及DMF洗净。洗净后，添加含Fmoc-Cys(Trt)-OH(234mg， 0.399mmol)、HCTU(157mg，0.380mmol)、及2,4,6-三甲基吡啶(79.6μL， 0.600mmol)的DMF(2.5mL)溶液，并于室温振荡10分钟。10分钟后，以 DMF洗净后，再重复此缩合操作1次。第2次缩合操作结束后，将树脂用 DMF及二氯甲烷洗净。洗净后，通过以20％哌啶的DMF溶液处理，将Fmoc 保护基除去，得到于树脂上键合有Cys(Trt)的化合物2。将树脂上的化合物 2以DMF洗净后，添加含4-羟基甲基苯甲酸(61.1mg，0.402mmol)、 HCTU(157.8mg，0.381mmol)、DIPEA(104.5μL，0.600mmol)的DMF(2.5mL) 溶液，并于室温振荡。1小时后，用DMF及二氯甲烷洗净，得到于树脂上 键合有HMBA-Cys(Trt)的化合物3。

在所得到的键合有化合物3的树脂的等分试样(50μmol)中，添加含 Fmoc-Ser(tBu)-OH(96.9mg，0.253mmol)、MSNT(74.1mg，0.250mmol)、及 N-甲基咪唑(14.0μL，0.177mmol)的二氯甲烷(2.5mL)溶液，于室温振荡1 小时。振荡1小时后，以二氯甲烷及DMF洗净。洗净后，将Fmoc保护基 通过以20％哌啶的DMF溶液处理而除去，得到于树脂上键合有 Ser(tBu)-HMBA-Cys(Trt)的化合物30。以DMF洗净后，使用Prelude(商标 名)肽合成机，通过利用Fmoc法的肽固相合成法，合成于树脂上键合有氨 基酸侧链经保护的肽的化合物31： Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Pro-Gly-Gln(Trt)-Phe-Ala-Phe-Ser(tBu)-HMBA-Cys(Trt) (序列编号13)。固相合成法中的缩合反应，使用HCTU作为缩合剂，使用 N-甲基吗啉作为碱，于DMF中进行。

将化合物31上的Fmoc保护基通过以20％哌啶的DMF溶液处理而除 去。以DMF及二氯甲烷洗净树脂后，添加TFA：三异丙基硅烷：乙二硫 醇：水(＝90：5：2.5：2.5)，并于室温振荡3小时。于滤液中添加冷却的 醚，得到为沉淀的粗产物肽32： Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser-HMBA-Cys(序列编号14)。

将所得到的粗产物肽32(14.2mg)、二唾液酸基-BrAc9(41.6mg，17.7μ mol)、及TCEP(16.0mg，55.8μmol)溶解于含7M胍盐酸盐的0.2M磷酸缓 冲液(pH6.8，1.15mL)中，使其于室温反应。3小时后，使用HPLC[管柱： SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ20x250mm，流速：7.0mL/ 分钟；洗脱液A：0.1％AcOH水溶液，B：0.09％AcOH/10％水/90％乙腈， 以梯度A：B＝70：30→55：45(10分钟)进行线性浓度梯度洗脱]纯化反应 溶液，得到糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合物 29)：Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser-(糖链加成连接子：HMBA-Cys(二 唾液酸基))(序列编号15)(19.0mg，5.33μmol)。

ESI-MS：C₁₅₁H₂₁₇N₁₉O₇₇S的计算值：[M+3H]³⁺1187.8、[M+4H]⁴⁺891.1、 [M+5H]⁵⁺713.1；实测值：1187.8、891.1、713.1。

(实施例4-2：水溶液中的水解行为的追踪)

追踪在实施例4-1中所得到的糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋 化素9偶联物(化合物29)于水解时的行为。具体而言，除了使用冷冻干燥 的糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合物29)代替冷 冻干燥的糖链加成(Cys(无唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物 1)及糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-HER2(8-16)偶联物(化合物8)，使 用乙酸缓冲液(pH4.0)、PBS(pH7.4)、硼酸缓冲液(pH9.0)作为缓冲液以外， 以与实施例1-4同样的方式，追踪水解的行为。

将糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合物29)水 解，随后进行HPLC分析时，确认具有趋化素9的氨基酸序列的未修饰的 趋化素9的肽：Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser(化合物33)的生成。 下述化学式表示糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化 合物29)的水解反应。

式中，R表示以下的化学式：

对于糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合物 29)，以与实施例1-4同样的方式，将起始物质的相对浓度对培育时间作图， 所得的图显示于图4。而且，将各条件下的糖链加成(Cys(二唾液酸基)型) 连接子-趋化素9偶联物(化合物29)的半衰期显示于表7。

[表7]

糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合物29)于缓冲液中的水解半 衰期

如表7所示，在乙酸缓冲液(0.1M，pH4.0)中，在37℃的条件下，追 踪49小时后所生成的水解物(化合物33)仅为起始物质(化合物29)的1％以 下，可知几乎未水解(此外，观察到糖链结构中的非还原末端所存在的唾液 酸的脱离。脱唾液酸体的含量在水解的行为试验的开始前后，从4.7％增加 至8.7％)。另一方面，发现在PBS中(pH7.4)及硼酸缓冲液中(pH9.0)进行水 解反应，可得到具有趋化素9的氨基酸序列的未修饰的肽(化合物33)。从 所得到的曲线所求得的半衰期在PBS中、37℃下为45.0小时(1.9日)。而 且，追踪于硼酸缓冲溶液(0.1M，pH9.0)中37℃下的水解行为的结果是，半 衰期为0.83小时(50分钟)。

而且，使糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化合 物29)溶解于50mM氢氧化钠水溶液时，于2分钟完全消失，生成具有趋 化素9的氨基酸序列的未修饰的肽(化合物33)。如文献报道，在碱性条件 中，确认水解非常快速。

而且，确认糖链加成(Cys(二唾液酸基)型)连接子-趋化素9偶联物(化 合物29)，与其他化合物同样地随着提高pH而使水解速度提高(编号1、2、 及3)。而且，确认在相同pH的情况，温度越高，越促进水解(编号3及4)。

进行水解行为试验后，将反应液进行HPLC[管柱：SHISEIDO  CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm)，φ4.6x250mm，流速：0.7mL/分钟； 洗脱液A：0.1％TFA水溶液，洗脱液B：0.09％TFA/10％水/90％乙腈，以 梯度A：B＝95：5→50：50(20分钟)进行线性浓度梯度洗脱]分析。其结果， 确认保持时间为10.2分钟时为糖链加成连接子部分(化合物34)的峰。

化合物34的ESI-MS：C₉₇H₁₅₃N₉O₆₅S的(m/z)计算值：[M+2H]²⁺1258.93、[M+3H]³⁺839.62；实测值：1258.98、839.65。

从这些结果，可期待本发明的具有键合的糖链加成连接子的偶联物在 施用前，可以于室温在具有低pH的溶液中制备，而不引起化合物的水解， 并且在施用后可以于生物体条件下水解，而发挥肽原本的活性。