无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用

摘要

本发明提供了一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；2)向第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶的第二溶液；3)向的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体。本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶催化油脂转酯化反应较强，重复使用多次后仍保持较强活性。

说明书

技术领域

本发明涉及无载体固定化脂肪酶及其制备方法和应用，尤其是无 载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)，即三酰基甘油酰基水解酶，是一类 既可以催化油脂水解又可以进行转酯化反应的酶。脂肪酶广泛存在于 许多动植物及微生物中，尤其在微生物中有着广泛的分布。目前已知 有细菌、放线菌、酵母、丝状真菌共计65个属的微生物产脂肪酶。绝 大多数脂肪酶可以用来催化油脂水解，但只有部分脂肪酶可以用来催 化油脂的转酯化反应。脂肪酶水解油脂后生成游离脂肪酸和甘油、甘 油单酯或二酯，其转酯化反应则是催化甘油三酯与短链醇之间的酯交 换反应，生成甘油酯和单链脂肪酸酯(即生物柴油)的过程。由于脂 肪酶催化反应高效、反应条件温和且无毒副产物，所以作为一种重要 的工业用酶广泛应用于食品工业、皮革工业、洗涤工业、医药饲料工 业及生物能源等方面。

与液体脂肪酶相比，载体固定化脂肪酶具有稳定性强、易于控制 和分离、便于运输和贮存、可实现反复多次使用并且有利于自动化生 产等明显优势。

中国专利申请CN104087571A以含氢硅油疏水改性的二氧化硅为 载体固定脂肪酶，在具有较高催化活力及良好稳定性的条件下，其重 复使用性得到有效提高，重复使用12次以后，酶活力仍能保持最初的 80％以上。

中国专利申请专利CN103882004A以纤维素生物质碳化成生物炭 基质，采用油酸分子修饰的纳米凝胶对生物炭基质表面包被，包被后 的生物炭基质与脂肪酶溶液接触进而对脂肪酶进行界面活化与交联固 定，冷冻干燥后获得固定化脂肪酶，该方法进行处理的脂肪酶的催化 活性得到大幅度的提高。

美国专利申请US5817493利用脂肪酶与含有不可水解有机物成分 之间的Si-C化学键将酶分子固定在一种硅基质上，实现了脂肪酶的稳 定高效催化和重复利用。

美国专利申请US5508185使用酸性溶液溶解低分子可溶的壳聚糖 形，然后使这种壳聚糖与一种多元醇的缩水甘油醚和酸卤化物反应形 成一种多孔的固定化酶载体，脂肪酶分子通过共价结合与这种载体交 联，获得了比游离脂肪酶高出50-60倍的催化效率。

目前研究开发出的这些载体固定化脂肪酶通常具有稳定性好、回 收率高和可重复使用等优点，但是不能很好地满足机械强度高、价格 低且易于制备和活化的要求。

基于此，技术人员一直在致力于研究新的脂肪酶固定化方法，以 弥补上述不足。

中国专利申请CN102154256A公开了一种无载体固定化脂肪酶的 制备方法，将扩展青霉脂肪酶(PEL-CLEA)在硫酸铵沉淀后利用交联剂 戊二醛把酶分子交联聚集，来实现脂肪酶固定化目的。这种无载体固 定化脂肪酶虽然具有成本低、易于操作的优点，但是效率和可重复使 用性表现较差。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种无载体固定化米 根霉脂肪酶及其制备方法和应用，通过本发明的制备方法得到的无载 体固定化米根霉脂肪酶成本低、催化效率和可重复使用性表现优异， 特别适用于生物柴油的制备。

本发明提供的无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法包括以下步 骤：

1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一 溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；

2)向步骤1)得到的第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉 脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶沉淀的第二溶液；

3)向步骤2)制得的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然 后将该混合溶液孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二 醛；

4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体， 即为无载体固定化米根霉脂肪酶。

根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤1)中，所述米根霉 脂肪酶为米根霉脂肪酶基因转化表达培养液的冻干粉，所述米根霉脂 肪酶转化表达培养液通过将米根霉脂肪酶基因转化到表达载体上培养 表达而得。

所述米根霉脂肪酶的上述来源为一种优选来源，也可以为现有技 术中的已有产品。上述米根霉脂肪酶基因优选为米根霉 Rhizopusoryzae IFO 4697的脂肪酶ROL的基因，优选地，转化过程 中，使用EcoRI和KpnI两个酶切位点将ROL基因连接到载体上。利 用该基因转化表达而制备米根霉脂肪酶的一个优选的实施方式为：提 取Rhizopusoryzae IFO 4697的总RNA，以总RNA为模板反转录得到 cDNA，设计引物扩增cDNA上的脂肪酶ROL的基因，然后使用 EcoRI和KpnI两个酶切位点将ROL基因连接到毕赤酵母表达载体 pPICZα上面，电转化进入毕赤酵母Pichia pastoris X33胞内重组表 达。在含橄榄油的培养基上挑取确定有脂肪酶表达的菌落进行发酵产 酶培养；收集含有脂肪酶的毕赤酵母发酵培养液，然后对发酵液进行 冻干处理；所述冻干粉即为米根霉脂肪酶冻干粉。

根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤1)中，每毫升缓冲 液中含有的米根霉脂肪酶为30～70mg，所述米根霉脂肪酶与所述蛋白 交联助剂的质量比为5～20:1。

血清白蛋白，即Serum albumin，常缩写为ALB，是脊椎动物血 浆中含量最丰富的球蛋白。优选为牛血清白蛋白(BSA)，其含607 个氨基酸残基，分子量为66.446kDa，等电点为4.7。血清白蛋白可 以在米根霉脂肪酶转酯化反应中降低醇对于脂肪酶酶活的影响。每毫 升缓冲液中溶入的脂肪酶更优选为40～60mg，进一步优选为 45～55mg，所述脂肪酶与所述蛋白交联助剂的重量比更优选为 6～15:1，进一步优选为8～12:1；所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液 (K₂HPO₄-KH₂PO₄)，优选的浓度为50mM，pH＝7.0(米根霉脂肪酶最 适pH)。

根据本发明所述的制备方法，步骤2)中，乙二醇二甲醚的滴加 体积与步骤1)中所述缓冲液体积的比值为1～3:1，优选为 1.5～2.5:1。

根据本发明所述的制备方法的一个优选实施方式，步骤2)中， 4℃条件下搅拌的同时逐滴加入乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀，静 置20-50min。

根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤3)中，所述交联剂 以20～60％(v/v)的交联剂水溶液加入，所述交联剂的终浓度为 15～40mM。

步骤3)中，更优选地，所述交联剂水溶液的浓度为25％～50％ (v/v)，进一步优选为30％～40％(v/v)；所述交联剂的终浓度更优选为 20～30mM；将混合溶液放入摇床中孵育的优选条件为：36～38℃摇床 中150～250rpm孵育3～5h。

根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤4)中，沉淀得到交 联酶聚体的方法为：加入丙酮沉淀，离心除去上清液，再用丙酮洗沉 淀而得。

步骤4)中，丙酮的加入量与步骤1)中所用缓冲液的体积比为 0.5～3:1，更优选为0.7～1.5:1。优选地，用丙酮多次清洗沉淀。

上述方法制得的交联酶聚体即为本发明的无载体固定化米根霉脂 肪酶。

本发明提供的所述无载体固定化米根霉脂肪酶的应用涉及脂肪酶 在食品工业、皮革工业、洗涤工业、医药饲料工业及生物能源等方面 各种用途，特别涉及在制备生物柴油中的应用。

根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中 的应用，优选地，原料为油脂和醇，制备生物柴油的原料为油脂和 醇，所述油脂和醇在所述无载体固定化米根霉脂肪酶催化作用下发生 转酯化反应而生成生物柴油。

所述油脂可以为动物油脂、植物油脂或微生物油脂，也可以为混 合油脂和废弃油脂。根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在 制备生物柴油中的应用，优选地，所述无载体固定化米根霉脂肪酶与 所述油脂的质量比为0.3～3：1，更优选为0.5～2:1，所述醇包括甲醇 和叔丁醇。

根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中 的应用的一个优选实施方式，操作步骤如下：将油脂和甲醇以醇油摩 尔比为2～5:1的比例进行混合，溶解于其混合溶液1～4倍体积的叔丁 醇中，加入上述无载体固定化脂肪酶，摇床中反应。反应中期可以加 入与初始添加量相同的甲醇。10～30h(进一步优选为12～24h)反应 结束后将混合溶液置于分液漏斗中静置分层，取上层相在旋转蒸发仪 中，使生物柴油与甲醇和叔丁醇分离，将蒸馏后的生物柴油置于分液 漏斗中收集。其中旋转蒸发仪的温度控制在63～68℃(例如为 65℃)。

本发明的有益效果为：本发明的方法制备的无载体固定化米根霉 脂肪酶催化油脂转酯化反应较强，可以用来作为生产生物柴油较为理 想的酶制剂。此外，本发明大大增加了在生物柴油制备过程中脂肪酶 在甲醇溶液中的稳定性，并且固定化酶的重复利用率显著提高。这些 有益的效果有赖于本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法的 整体优化，其中涉及的重要技术手段举例如下：使用BSA作为蛋白 交联助剂和保护剂，大大增加了在生物柴油制备过程中脂肪酶在甲醇 溶液中的稳定性，并且固定化酶的重复利用率显著提高；该固定化酶 制备方法使用乙二醇二甲醚作为沉淀剂使脂肪酶充分沉淀，比常规使 用硫酸铵沉淀效果更好，能够保持酶活性90％以上；以乙酸酐、甲醛 或戊二醛作为交联剂将脂肪酶交联固定化，与传统固定化酶方法相比 优势明显，无需使用固定载体，制备过程简单。

附图说明

图1为使用实施例2制得的固定化脂肪酶重复实验的结果。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发 明的保护范围并不限于此。

材料和条件说明如下：

米根霉Rhizopusoryzae IFO 4697和毕赤酵母Pichia pastoris X33 都为科学研究领域流通使用的菌种，在我国本领域相关的主要科研单 位(例如福建师范大学)都能获得并进行培养。文献中也经常提及， 例如如下文献：Ting Sun,Wei Du,Dehua Liu,Lingmei Dai.Improved  catalytic performance of GA cross-linking treatedRhizopus oryzae IFO 4697whole cell for biodiesel production.2010,45(7):1192–1195.

缓冲液为磷酸盐缓冲液(K₂HPO₄-KH₂PO₄)，浓度为50mM， pH＝7.0。

交联剂的终浓度为20～30mM。

离心条件为4℃，8000×g。

总RNA提取试剂、反转录试剂以及EcoRI和KpnI均购于赛默飞 世尔科技公司；磷酸盐K₂HPO₄和KH₂PO₄、乙二醇二甲醚购于北京 化学试剂公司；丙酮、乙酸酐、甲醛和戊二醛购于北京化工厂；BSA 购于中国医药(集团)上海化学试剂公司。

生物柴油得率计算公式如下：

实施例1

制备无载体固定化米根霉脂肪酶：提取Rhizopusoryzae IFO 4697 的总RNA，以总RNA为模板反转录得到cDNA，设计引物扩增 cDNA上的脂肪酶ROL的基因，然后使用EcoRI和KpnI两个酶切位 点将ROL基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上面，电转化进入毕 赤酵母Pichia pastoris X33胞内重组表达。在含有橄榄油的培养基上 挑取确定有脂肪酶表达的菌落进行发酵产酶培养。收集含有脂肪酶的 毕赤酵母发酵培养液，然后对发酵液进行冻干处理。将毕赤酵母 Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液进行纯化，收集纯化后含有 脂肪酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶冻干粉100mg溶解于2mL的磷 酸盐缓冲液中，离心10mim，取上清液加入10mg小牛血清白蛋白 (BSA)；4℃条件下逐滴加入2mL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀， 静置30min后得到含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入 30％(v/v)的乙酸酐以形成混合溶液，然后将该混合溶液放入37℃摇 床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入1mL的丙酮，离心10min， 弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶交联酶聚体。

转酯化制备生物柴油：取0.8g菜籽油，加入6g叔丁醇，装于 50mL锥形瓶中，振荡均匀；加入制备好的脂肪酶交联酶聚体1g；于 0h和8h分别加入1mL和0.5mL甲醇，置于45℃恒温摇床中，转 速200rpm的条件下反应24h。反应结束后将混合溶液置于分液漏斗 中静置5～10min分层，取上层相在65℃旋转蒸发仪中旋蒸20min， 使生物柴油与甲醇和叔丁醇分离，将蒸馏后的生物柴油置于分液漏斗 中收集。离心取上清用气相色谱-质谱联用法检测。检测结果显示， 利用本方法制备的固定化脂肪酶转化油脂生产生物柴油的得率达到 86％。

实施例2

制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到毕赤 酵母Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液，收集纯化后含有脂肪 酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶冻干粉60mg溶解于1.5mL的磷酸 盐缓冲液中，离心10mim，取上清液加入6mg小牛血清白蛋白 (BSA)；4℃条件下逐滴加入2mL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀， 静置30min后形成含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入 30％(v/v)的甲醛溶液以形成混合溶液，然后将该混合溶液放入37℃ 摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入1mL的丙酮，离心 10min，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶交联酶聚 体。

转酯化制备生物柴油：取一种高产油脂的圆红冬胞酵母 (Rhodosporidiumtoruloides)作为微生物油脂来源，培养、富集和油 脂提取；称取这种微生物油脂0.2g加入50mL锥形瓶中，加入5mL 叔丁醇，装于50mL锥形瓶中，振荡均匀；加入前述制备好的固定化 脂肪酶交联酶聚体1g和甲醇1mL，置于45℃恒温摇床中，转速 200rpm的条件下反应12h，离心取上清用气相色谱-质谱联用法进行 检测。检测结果显示，利用本方法制备的固定化脂肪酶转化来源于R. toruloides的油脂生产生物柴油的得率达到82％。重复使用实验表 明，使用10次之后固定化酶水解酶活保持在80％左右，转酯化酶活 保持在50％左右，结果见图1。

实施例3

制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到毕赤 酵母Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液，收集纯化后含有脂肪 酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶冻干粉50mg溶解于1mL的磷酸盐 缓冲液中，离心10mim，取上清液加入5mg小牛血清白蛋白 (BSA)；4℃条件下逐滴加入1mL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀， 静置30min后形成含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入 30％(v/v)的戊二醛溶液以形成混合溶液，然后将该混合溶液放入 37℃摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入1mL的丙酮，离心 10min，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶交联酶聚 体。

转酯化制备生物柴油：取潲水油2g加入250mL锥形瓶中，以醇 油摩尔比2:1(油以所含的脂肪酸计)加入甲醇3.2mL，再在混合溶 液中添加5mL叔丁醇和前述制备好的固定化脂肪酶交联酶聚体 1.5g。将反应的锥形瓶置于45℃恒温摇床中，在转速200rpm的条件 下反应6h，之后再次添加入0.5mL的甲醇继续反应，6h后离心取上 清用气相色谱-质谱联用法进行检测。检测结果显示，利用本方法制 备的固定化脂肪酶转化潲水油生产生物柴油的得率达到80％，使用 10次之后的脂肪酶交联酶聚体转酯化反应的活性保持在62％～65％。

对比例1

制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到由重 组毕赤酵母表达的脂肪酶发酵液，收集纯化后含有脂肪酶的溶液进行 冻干处理，脂肪酶冻干粉50mg溶解于1mL的磷酸盐缓冲液中，离 心10mim，取上清液加入5mg小牛血清白蛋白(BSA)，以不加BSA 的脂肪酶作为对照组；4℃条件下逐滴加入1mL乙二醇二甲醚进行 脂肪酶的沉淀，静置30min后形成含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶 液中逐滴加入30％(v/v)的戊二醛溶液以形成混合溶液，然后将该混 合溶液放入37℃摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入1mL的 丙酮，离心10min，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，分别得到含 有BSA的脂肪酶交联酶聚体A和不含BSA的脂肪酶交联酶聚体B。

转酯化制备生物柴油：以A和B分别转化实施例1中的菜籽油 制备生物柴油，反应和制备条件均与实施例1相同。实验结果显示， 使用交联酶聚体A制备生物柴油的得率达到86％，而使用交联酶聚 体B制备生物柴油的得率只有73％；使用10次之后的交联酶聚体A 的转酯化反应的活性保持在70％以上，而交联酶聚体B的活性只能 达到63％。由此可知，BSA作为蛋白助剂能够显著提高脂肪酶交联 酶聚体的活性和生物柴油得率。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情 况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发 明的范围。