一种快速增加细胞膜通透性的细胞内液及其方法

摘要

本发明公开了一种快速增加细胞膜通透性的细胞内液及其方法。先将两性霉素B溶解于DMSO中，配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，然后将两性霉素B的DMSO溶液、质量分数0.3％的Triton X-100溶液和常规细胞内液按照体积比50：10：1000的比例混合均匀，由此得到快速增加细胞膜通透性的细胞内液。本发明的快速增加细胞膜通透性的细胞内液，并结合伊维菌素快速增加细胞膜通透性从而在膜片钳实验中快速破膜形成高阻封接进行实验。

说明书

技术领域：

本发明属于生物领域，具体涉及一种快速增加细胞膜通透性的细胞内液及其方法。

背景技术：

全细胞膜片钳技术是用玻璃微电极贴附在细胞表面，施加负压使电极与细胞之间形成高 阻封接(即GΩ级的紧密封接)。在实验中，向玻璃电极内液中加入特定的抗生素，如两性霉 素B，可以使细胞膜穿孔，细胞内液和电极内液连通，这样记录到的玻璃电极内和细胞所处 浴液之间的电势差即为细胞的膜电位。抗生素穿孔形成的孔道，分子直径大于0.8nm的离子 和分子不能通过，而所有单价离子都可通过，这些孔道没有电压依赖性，同时使得记录过程 不受电极钳制电位的影响。

两性霉素B是一种具有抑菌或杀菌作用的抗霉菌剂。主要是通过作用于细胞膜上的麦角 甾醇而改变细胞膜通透性。虽然全细胞膜片钳技术需要两性霉素B打孔，但是两性霉素B基 本不溶于水溶液，易形成固体悬浮颗粒，极易堵塞玻璃微电极尖端；两性霉素B打孔效果不 好，从电极贴附形成高阻封接到细胞破膜往往要30min以上。因此对穿孔膜片钳实验带了一 定难度。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种快速增加细胞膜通透性的细胞内液。

本发明的快速增加细胞膜通透性的细胞内液，其特征在于，先将两性霉素B溶解于DMSO 中，配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO溶液，然后将两性霉素B的DMSO溶液、质量 分数0.3％的Triton X-100溶液和常规细胞内液按照体积比50：10：1000的比例混合均匀，由 此得到快速增加细胞膜通透性的细胞内液。

所述的快速增加细胞膜通透性的细胞内液优选通过以下方法制备：

将每0.01g的两性霉素B溶解于1mL DMSO，置于涡旋振荡器上以3200rpm转速震荡 2min，混匀后放置在超声仪中以40KHz的频率超声10min，最终配制成10mg/mL两性霉 素B的DMSO溶液，再按每吸取50μL两性霉素B的DMSO溶液、10μL质量分数0.3％的 的Triton X-100溶液溶于1mL的常规细胞内液中，置于涡旋振荡器上震荡1min，然后以40 KHz的频率超声10min，最后在以500rpm的转速离心30s发现无悬浮颗粒沉降，因为悬浮 颗粒的存在可能堵塞玻璃电极微米级的开口导致电流回路不畅，记录数据不稳定，由此得到 快速增加细胞膜通透性的细胞内液。

所述的常规细胞内液为含有130mM CsMeth,24mM CsCl,10mM HEPES,1mM CaCl₂,1 mM MgCl₂，溶剂为水。其配制方法是将上述成分混合均匀灭菌备用。

本发明的第二个目的是提供一种快速增加细胞膜通透性从而快速破膜形成高阻封接的方 法，其特征在于，将含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将上述快速增加细胞膜通 透性的细胞内液灌入微电极中，然后利用含快速增加细胞膜通透性的细胞内液的微电极钳制 细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口，打开快速加药管，使细胞在含伊维菌 素的细胞外液中孵育，使细胞在电生理测试状态下Ra值降至10MΩ，再停止孵育。

将伊维菌素溶于常规细胞外液(含有154mM NaCl，10mM D-glucose，10mM HEPES， 1mM CaCl₂，溶剂为水，其配制方法是将上述成分按其含量混合均匀即可)中，使伊维菌素 的浓度为2μM，由此得到含伊维菌素的细胞外液。

两性霉素B对细胞膜通透性的影响具有浓度依赖性，如何最大限度的让两性霉素B溶解 于细胞内液的同时结合伊维菌素快速增加细胞膜的通透性，达到最短时间且最佳的穿透效果 以此解决穿孔膜片钳应用的主要问题。本发明解决两性霉素B在细胞内液中的溶解度，利用 Triton X-100作为非离子型表面活性剂能促进两性霉素B溶解，使其较好的溶解于细胞内液 中，在整个实验过程中两性霉素B处于水溶解状态，同时结合伊维菌素增加细胞膜通透特性， 实验开始前孵育细胞辅助两性霉素B一起在短时间内破膜，在此浓度下的Triton X-100溶液 可以破坏细胞膜上的脂质在细胞膜表面打孔，促进细胞膜穿孔形成，且对细胞无毒副作用， 不影响细胞的状态。破膜后停止抚育，同时在两性霉素B的帮助下稳定细胞膜处于稳定通透 状态，从而使细胞能够在1-2h内处于稳定的电流记录状态。

因此本发明的快速增加细胞膜通透性的细胞内液，并结合伊维菌素快速增加细胞膜通透 性从而在膜片钳实验中快速破膜形成高阻封接进行实验。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

将0.01g的两性霉素B溶解于1mL DMSO，置于涡旋振荡器上以高速震荡2min，混匀 后放置在超声仪中以40KHz的频率超声10min，最终配制成10mg/mL两性霉素B的DMSO 溶液。吸取50μL两性霉素B的DMSO溶液、10μL质量分数0.3％的Triton X-100溶液(将 0.3g的Triton X-100溶于100ml的水中，得到质量分数0.3％的Triton X-100溶液)溶于1mL 细胞内液(含有130mM CsMeth,24mM CsCl,10mM HEPES,1mM CaCl₂,1mM MgCl₂，溶 剂为水)中，置于涡旋振荡器上高速震荡1min，然后以40KHz的频率超声10min，最后再 以500rmp的转速离心30s发现无悬浮颗粒沉降，由此得到快速增加细胞膜通透性的细胞内 液。

然后将伊维菌素溶于常规细胞外液(含有154mM NaCl，10mM D-glucose，10mM HEPES， 1mM CaCl₂，溶剂为水)中，使伊维菌素的浓度为2μM，由此得到含伊维菌素的细胞外液。

将10ml本实施例的含伊维菌素的细胞外液灌入快速加药管中，再将本实施例的快速增加 细胞膜通透性的细胞内液灌入微电极中，然后利用含快速增加细胞膜通透性的细胞内液的微 电极钳制细胞达到高阻封接后，提起贴壁细胞至快速加药管口(含伊维菌素的细胞外液的加 药管口)，打开快速加药管。细胞在含伊维菌素的细胞外液中孵育2min后细胞在电生理测试 状态下Ra值降至10MΩ，停止孵育。依此方法得到的细胞可以在2min内快速溶解细胞膜， 同时电极内部的两性霉素B继续与细胞膜中的麦角甾醇相互作用维持细胞膜长期处于稳定的 通透状态，可以在1-2h内记录到稳定的电流结果，不会因为细胞膜在记录过程中反复的闭合 造成记录中断，并且在此过程中对细胞的状态无影响，无毒副作用。