公开/公告号CN104911196A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-09-16
原文格式PDF
申请/专利权人 中国科学院上海有机化学研究所;
申请/专利号CN201410093394.X
申请日2014-03-13
分类号C12N15/52(20060101);C12N9/00(20060101);C12N15/63(20060101);C12N1/21(20060101);C12N1/20(20060101);C12P19/60(20060101);C12P17/16(20060101);C07K14/36(20060101);C12R1/465(20060101);
代理机构31266 上海一平知识产权代理有限公司;
代理人崔佳佳;刘真真
地址 200032 上海市徐汇区零陵路345号
入库时间 2023-12-18 11:04:47
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-28
授权
授权
2017-02-01
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/52 申请日:20140313
实质审查的生效
2015-09-16
公开
公开
技术领域
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗菌抗疟及抗肿瘤抗生素三欣卡辛（Trioxacarcin）的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用，三欣卡辛的产量提高以及中间体化合物的结构阐明。
背景技术
三欣卡辛类化合物(Trioxacarcins，结构如图1所示)，是1981年由日本科学家Fusao Tomita从北海道札幌市土壤中分离得到。这类化合物呈现淡黄色到黄色，在366nm下发出淡绿色荧光[J.Antibiot.(Tokyo)12,1519-1524(1981)]。Rajendra P.Maskey等人随后在2004年也对这类化合物在另外一个海洋来源的链霉菌Streptomyces sp.isolateB86523进行分离[J.Antibiot.(Tokyo)57,71(2004)]。
三欣卡辛类化合物它是由链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45所产生的一类化合物，具有良好的抗菌、抗疟及抗肿瘤活性。其中对于革兰氏阳性菌(Bacillus subtilis,Staphylococcus aureus)均有一定的活性，对革兰氏阴性菌(Escherichia coli)也具有中等的活性。trioxacarcin A,trioxacarcin D具有非常高的抗疟活性，与青蒿素(artemisinin)活性相当；对于肺癌肿瘤细胞，有良好的活性(IC90=0.74ng/ml)。[Nucleic Acids Research,2008,36,3508–3514]
人们在随后的发酵中分离发现七种三欣卡辛类似物，包括trioxacarcins A-F[58]及gutingimycin，它们具有共同的蒽醌骨架结构，其中含氧三元环是最重要的活性位点，同时糖苷配基上的乙酰基也是非常重要的活性基团，它的药效作用机理可能是与DNA结合，最终鸟嘌呤核苷酸中含氮碱基七位氮原子亲核进攻三元含氧环，发生开环后鸟嘌呤碱基留在三欣卡辛分子结构上形成gutingimycin。[Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,1281–1281]
三欣卡辛分子由三部分组成：蒽环骨架、三并含氧螺环结构以及两个不同的酰基化修饰的脱氧己糖单元。其中的蒽环骨架是以II型PKS的方式合成的。II型PKS由miniPKS以及相关的负责折叠、环化、氧化还原以及其他修饰的后修饰酶组成。人们认为miniPKS一般由丙二酰-ACP经过脱羧产生的乙酸单元转移至KS活性位点而起始，而后KS催化ACP上丙二酰硫酯脱去二氧化碳形成碳负离子与KS上酰基发生Claisen缩合在ACP上形成相应的硫酯结构，接着转移至KS活性位点而完成两碳单元的延伸。当聚酮通道充满时，聚酮酰-ACP离开体系发生随后的酮基还原、环化、氧化等后修饰。阐明蒽环骨架的合成机理对于丰富人们对蒽环类天然产物的认识、改造蒽环类天然产物的合成路径以产生价值更高的“非天然”天然产物都有重要意义。
分子的三元含氧螺环和脱氧糖基均是药效基团，而且结构比较新颖，但是目前的对其合成途径还不甚了解，推测其合成机制是比较独特的。因此，阐明这两个基团的合成过程，理解其生物合成的酶学机制，将大大提升人们对抗菌抗肿瘤天然产物构效关系及生物 合成原理的认识。在阐明了三欣卡辛生物合成的酶学机制的基础上，人们还可以通过敲除和添加相关的生物合成基实现对三欣卡辛分子的改造，以期获得活性更高、专一性更强、毒性更低的中间体和衍生物。同时，三欣卡辛生物合成机理的阐明，对人们深入理解芳香聚酮类化合物、理解复杂的氧化后修饰作用必然会起到很大的帮助。进一步还可以将三欣卡辛生物合成基因簇中负责含氧杂环和负责脱氧糖基合成的基因应用到现有的某些药物的生物合成过程中，通过组合生物合成改造现有的某些药物，提高其生理活性或降低其对人体的毒性。
发明内容
本发明的目的是提供三欣卡辛生物合成相关的基因簇及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种三欣卡辛的生物合成基因簇，所述基因簇包括以下三欣卡辛生物合成所涉及的56个基因：
1)13个II型聚酮合成酶PKS相关基因：即txn5-8，txn13，txn17，txn19，txn27，txn36，txn39，txn41，txn43，txn46：
txn5位于基因簇核苷酸序列第19560-17875位，编码酰基转移酶，长度为562个氨基酸；
txn6位于基因簇核苷酸序列第19990-19718位，编码酰基承载蛋白，长度为91个氨基酸；
txn7位于基因簇核苷酸序列第21275-20055位，编码链延伸因子，长度为407个氨基酸；
txn8位于基因簇核苷酸序列第22534-21272位，编码酮基合成酶，长度为421个氨基酸；
txn13位于基因簇核苷酸序列第28909-27953位，编码芳香化酶，长度为319个氨基酸；
txn17位于基因簇核苷酸序列第33234-34016位，编码酮基还原酶，长度为261个氨基酸；
txn19位于基因簇核苷酸序列第35711-36748位，编码脱氢酶，长度为346个氨基酸；
txn27位于基因簇核苷酸序列第45439-44318位，编码环氧水解酶，长度为374个氨基酸；
txn36位于基因簇核苷酸序列第55665-55138位，编码芳香环羟化双加氧酶亚基，长度为176个氨基酸；
txn39位于基因簇核苷酸序列第57618-58403位，编码短链脱氢酶，长度为262个氨基酸；
txn41位于基因簇核苷酸序列第58987-59901位，编码环化酶，长度为305个氨基酸；
txn43位于基因簇核苷酸序列第61547-61101位，编码芳香环羟化双加氧酶亚基，长度为149个氨基酸；
txn46位于基因簇核苷酸序列第64276-63554位，编码氧化还原酶，长度为241个氨基酸；
2)4个负责起始单元合成相关基因；即txn12，txn14-16；
txn12位于基因簇核苷酸序列第27815-26076位，编码苹果酸辅酶A(CoA)合成酶，长度为580个氨基酸；
txn14位于基因簇核苷酸序列第30020-28986位，编码3-氧代酰基-酰基承载蛋白(ACP)合成酶，长度为345个氨基酸；
txn15位于基因簇核苷酸序列第31680-30049位，编码2-异苹果酸合酶，长度为544个氨基酸；
txn16位于基因簇核苷酸序列第33014-31761位，编码酰基辅酶A转移酶，长度为418个氨基酸；
3)13个负责边链糖基合成相关基因，即txn1-4，txn28-32，txn42，45，49，50；
txn1位于基因簇核苷酸序列第12861-13853位，编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶，长度为331个氨基酸；
txn2位于基因簇核苷酸序列第14848-13976位，编码dTDP葡萄糖合酶，长度为291个氨基酸；
txn3位于基因簇核苷酸序列第15503-16486位，编码丙酮酸脱氢酶α亚基，长度为328个氨基酸；
txn4位于基因簇核苷酸序列第16520-17557位，编码丙酮酸脱氢酶β亚基，长度为346个氨基酸；
txn28位于基因簇核苷酸序列第46543-45557位，编码NAD-己糖-4-酮基还原酶，长度为329个氨基酸；
txn29位于基因簇核苷酸序列第47181-46540位，编码dTDP-4-脱氧葡萄糖-3,5-异构酶，长度为214个氨基酸；
txn30位于基因簇核苷酸序列第48428-47187位，编码NDP-己糖-3碳-甲基转移酶，长度为414个氨基酸；
txn31位于基因簇核苷酸序列第48662-50128位，编码NDP-脱氧葡萄糖-2,3-脱水酶，长度为489个氨基酸；
txn32位于基因簇核苷酸序列第50125-51090位，编码NDP-己糖-3-酮基还原酶，长度为322个氨基酸；
txn42位于基因簇核苷酸序列第61080-59929位，编码糖基转移酶，长度为384个氨基酸；
txn45位于基因簇核苷酸序列第63460-62186位，编码糖基转移酶，长度为425个氨基酸；
txn49位于基因簇核苷酸序列第68041-66848位，编码酰基转移酶，长度为398个氨基酸；
txn50位于基因簇核苷酸序列第69353-68070位，编码糖基转移酶，长度为428个氨基酸；
4)13个负责复杂的三并元含氧螺环后修饰基因，即txn21,txn23-26， txn35,txn37,txn40,txn44,txn47,txn51-53；
txn21位于基因簇核苷酸序列第38405-37200位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为402个氨基酸；
txn23位于基因簇核苷酸序列第40945-39710位，编码铁氧化还原蛋白，长度为412个氨基酸；
txn24位于基因簇核苷酸序列第41268-40945位，编码铁氧化还原蛋白，长度为108个氨基酸；
txn25位于基因簇核苷酸序列第41505-42989位，编码三肽氨基肽酶，长度为495个氨基酸；
txn26位于基因簇核苷酸序列第44290-43061位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为410个氨基酸；
txn35位于基因簇核苷酸序列第55060-53840位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为407个氨基酸；
txn37位于基因簇核苷酸序列第56938-55823位，编码氧化酶，长度为372个氨基酸；
txn40位于基因簇核苷酸序列第58430-58966位，编码黄素还原酶类似的氧化还原酶，长度为179个氨基酸；
txn44位于基因簇核苷酸序列第61741-62106位，编码未知功能蛋白，长度为122个氨基酸；
txn47位于基因簇核苷酸序列第65379-64357位，编码氧甲基转移酶，长度为341个氨基酸；
txn51位于基因簇核苷酸序列第70423-69404位，编码氧甲基转移酶，长度为340个氨基酸；
txn52位于基因簇核苷酸序列第71697-70474位，编码p450细胞色素氧化酶，长度为408个氨基酸；
txn53位于基因簇核苷酸序列第72753-71731位，编码氧甲基转移酶，长度为341个氨基酸；
5)2个抗性基因，即txn33,txn38；
txn33位于基因簇核苷酸序列第52661-51159位，编码抗性蛋白，长度为501个氨基酸；
txn38位于基因簇核苷酸序列第57431-56967位，编码抗性蛋白，长度为155个氨基酸；
6)7个调节基因，即txn0,txn9-11,txn18,txn34,txn55；
txn0位于基因簇核苷酸序列第11766-12050位，编码LuxR家族调节因子，长度为93个氨基酸；
txn9位于基因簇核苷酸序列第23673-22882位，编码SARP家族调控因子，长度为264个氨基酸；
txn10位于基因簇核苷酸序列第24216-25400位，编码双组份激酶，长度为395个氨基酸；
txn11位于基因簇核苷酸序列第25422-26033位，编码双组份激酶调节因子，长度为204个氨基酸；
txn18位于基因簇核苷酸序列第34147-35649位，编码外排蛋白，长度为501个氨基酸；
txn34位于基因簇核苷酸序列第53757-52738位，编码转录因子调节蛋白，长度为340个氨基酸；
txn55位于基因簇核苷酸序列第74585-73725位，编码SARP家族调控因子，长度为287个氨基酸；
7)其他未知功能基因，即txn20,txn22,txn48,txn54；
txn20位于基因簇核苷酸序列第37189-36809位，编码未知功能蛋白，长度为127个氨基酸；
txn22位于基因簇核苷酸序列第38570-39670位，编码未知功能蛋白，长度为367个氨基酸；
txn48位于基因簇核苷酸序列第66666-65500位，编码未知功能蛋白，长度为389个氨基酸。
txn54位于基因簇核苷酸序列第73004-73552位，编码未知功能蛋白，长度为183个氨基酸。
在另一优选例中，所述的三欣卡辛生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO.:1中第1-102575位或第5384－80087位所示。
本发明的第二方面，提供了一种三欣卡辛的生物合成相关蛋白，所述的蛋白氨基酸序列选自如SEQ ID NO.:2-57中任一所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的蛋白是txnZ蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:Z＋1所示，其中Z为0-55的整数。
本发明的第三方面，三欣卡辛的生物合成相关基因，所述的合成相关基因编码本发明第二方面所述的三欣卡辛的生物合成相关蛋白。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的三欣卡辛生物合成基因簇，或本发明第二方面所述的三欣卡辛生物合成相关蛋白或蛋白组合用于催化合成三欣卡辛及类似物的用途。
在另一优选例中，所述的蛋白组合是txnZ蛋白中2-55个蛋白所构成的组合，其中Z为0-55的整数。
本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第一方面所述的三欣卡辛的生物合成基因簇或如本发明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相关基因。
本发明的第六方面，提供了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第五方面所述的表达载体，或其染色体上整合有外源的如本发明第一方面所述的三欣卡辛的生物合成基因簇或本发明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相关基因。
在另一优选例中，所述重组的宿主细胞包括链霉菌。
本发明的第七方面，提供了一种产生三欣卡辛的方法，所述方法包括步骤：培养如本发明第六方面所述的宿主细胞，从而表达三欣卡辛；以及
分离出所述的三欣卡辛。
在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂HP20。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵母提取物、大孔树脂HP20，和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·7H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4、NaCl。
在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种子培养基为TSB培养基。
在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
本发明第八方面，提供了一种突变菌株，所述的突变菌株是以产生三欣卡辛的菌株为原始菌株，通过将所述原始菌株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一个或多个基因失活而形成的突变菌株。
在另一优选例中，所述的原始菌株包括链霉菌，更佳地包括链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45。
在另一优选例中，所述的原始菌株是导入三欣卡辛生物合成基因簇的完整序列，从而表达三欣卡辛的菌株。
在另一优选例中，所述的失活是通过以下方法实现：同源重组、定点突变、基因敲除、或其组合。
在另一优选例中，所述的被失活的基因是选自如权利要求1中所述的三欣卡辛生物合成所涉及的56个基因中的至少一个基因。
在另一优选例中，所述的被失活的基因选自下组：txn21、txn41、txn44、txn49、txn4、txn52，或其组合。
本发明的第九方面，提供了一种本发明第八方面所述的突变菌株用于制备三欣卡辛类似物的用途。
在另一优选例中，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn-21、Txn-41，Txn-44、Txn-49、Txn-4-1、Txn-4-2、Txn-52。
本发明的第十方面，提供了一种三欣卡辛类似物，所述的三欣卡辛类似物通过以下方法制备：
(1)提供本发明第八方面所述的突变菌株；
(2)对步骤(1)所述的突变菌株进行培养，从而得到所述的三欣卡辛类似物。
在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂HP20。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵母提取物、大孔树脂HP20，和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·7H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4、NaCl。
在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种子培养基为TSB培养基。
在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
在另一优选例中，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn-21、Txn-41，Txn-44、Txn-49、Txn-4-1、Txn-4-2、Txn-52；
本发明的第十一方面，提供了一种提高三欣卡辛产量的方法，所述方法包括步骤：
在吸附性材料存在下，培养三欣卡辛的生产菌，从而产生三欣卡辛；以及
从培养体系或培养物中分离所述的三欣卡辛；
较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂HP20。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1三欣卡辛A(trioxacarcin A)及其三欣卡辛B(trioxacarcin B)的化学结构式。
图2A完整的三欣卡辛生物合成基因簇；图2B三欣卡辛生物合成基因簇的基因组成。
图3三欣卡辛A在链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45中的生物合成途径。CoA：辅酶A；ACP：酰基载体蛋白；TxnZ(或txnZ，Z=0-55):合成三欣卡辛的基因。
图4链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45野生型菌株发酵产物的液相色谱-质谱(LC-MS)分析。Txn-A:化合物三欣卡辛A。
图5三欣卡辛生物合成基因簇相关性的证实与基因簇边界确定。最终确定orf0-orf55共56个基因与三欣卡辛生物合成相关，其他的orf(-12)-orf(-1)及orf(56)到orf(77)为边界外基因。
图5-1中断KS(txn8)聚酮合酶后，三欣卡辛不再产生；
图5-2边界外的AT(orf-3)(酰基转移酶敲除掉后不影响三欣卡辛的产生)；
图5-3上游边界外orf-1(membrane protein)及下游最后一个基因txn55(SARP)敲除后对比野生型发酵图；
图5-4：敲除下游边界外基因orf58并不影响三欣卡辛的生物合成。
图6改变配方后加入大孔树脂HP20提高三欣卡辛产生量。
图7pcr-targeting介导的突变株黏粒的构建及突变株基因型验证和发酵检测示意图。其中，图7a为pcr-targeting法构建突变株黏粒示意图，图7b为接合转移后基因型验证(带有Am-marker)(以0rf55为例)，图7c为带有Marker的基因型和同框缺失删除Marker后的基因型PCR验证图(以orf16为例)，图7d为是突变株的发酵与野生型对比HPLC图，以此检测是否有新化合物产生。M：DL5000的基因标准对照条带。
图8三欣卡辛合成基因簇中部分基因的敲除实验结果。
图9各种新化合物的分析数据图。
图10Txn-49和野生型的生物活性实验对比图。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，以链霉菌来源的三欣卡辛为目标分子，从克隆其在Streptomyces bottropensis DO-45中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物信息学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成 机制的研究揭示蒽环骨架结构及乙酰脱氧糖基独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用基因工程的原理，合理修饰三欣卡辛的生物合成途径，提高三欣卡辛的产量，并分离得到可能具有更好活性的一些列新化合物。
术语
如本文所用，术语“三欣卡辛”或“trioxacarcin”可互换使用，均指化合物三欣卡辛A或三欣卡辛B，其结构如说明书附图1中所示。
以下结合图1-图9对本发明进一步详细说明。
利用保守基因的同源序列克隆完整生物合成基因簇
分析前人报道的三欣卡辛的分子结构式发现，其分子中具有一个蒽醌类骨架结构(图1),蒽醌类抗生素家族是聚酮类天然产物中非常有特色的一类，它们中的绝大多数是由放线菌产生的，具有良好的抗肿瘤活性。从生物合成角度看，蒽环类抗生素是由II型PKS体系催化形成的。在这一催化体系中，KSα，KSβ与ACP是II型PKS的核心蛋白，它们通过相互作用形成minimalPKS异源复合物。其中的KSα负责催化合成砌块之间的Claisen缩合，从而将C链延长；而KSβ控制着Claisen缩合发生的次数，从而决定最终形成的C链的长度，因此又称为链延伸因子(CLF)。合成过程中的聚酮链结合在ACP上形成聚酮酰ACP。合成结束后的聚酮链与KSα、KSβ脱离，经环化、氧化、还原、甲基化以及其它一些后修饰形成成熟的蒽环骨架结构。(图3)
本发明人根据已经报道的蒽醌类抗生素KSα和KSβ的氨基酸序列，分析它们的保守序列，设计了简并引物(For(KS)：A TC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCSATC-3’，Rev(CLF)：CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC；S=C或G,Y=C或T,R=A或G)进行PCR，从Streptomyces bottropensis DO-45基因组DNA中扩增得到了1.1kb的片段，克隆入pGEM-T Easy载体。DNA序列分析表明插入片段与聚酮合酶(KS)同源性很高[Identities=79%，Positives=85%]，因此，该片段很可能与三欣卡辛的生物合成相关。
将上述克隆得到的基因片段进行地高辛标记，用于文库筛选。对筛选到的正确黏粒测序，利用已知序列信息进行染色体步移，直至得到的黏粒能够完整地覆盖整个基因簇。使用基因簇序列同源性在线分析软件FramePlot4.0beta(http://nocardia.nih.go.jp/fp4/)，对所获得的102575bp核苷酸序列进行的分析发现了75个orf和1个不完整的orf(图2B)。目的蛋白氨基酸序列同源性分析是使用美国国家生物信息中心提供的Blast搜索引擎(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。序列中各个基因对应的核苷酸位置和编码蛋白功能的生物信息学分析结果如表1所示(与三欣卡辛生物合成不相关的基因仅显示了一部分)。以上实验内容表明，三欣卡辛的生物合成基因簇是通过同源序列克隆得到，同时，三欣卡辛生物合成基因簇中的保守基因也可以用作同源探针或者其他形式的同源参考序列来筛选与三欣卡辛类似的次级代谢产物的生物合成基因簇。
表1：全序列功能分析
其中，“位置”一栏的数字表示SEQ ID NO:1中对应序列的核苷酸；数字从小到大，表明该氨基酸序列是由SEQ ID NO:1中对应序列的核苷酸的正义链进行翻译得到；反之，表明该氨基酸序列是由反义链翻译得到。
三欣卡辛生物合成基因簇相关性和完整性的确定
由于微生物次级代谢产物的生物合成基因在染色体上是连锁成簇存在的，本发明人对已获得序列中的各个基因进行敲除实验，以验证所获得基因簇与三欣卡辛生物合成的相关性及其完整性。
基因敲除txn8完全中断了三欣卡辛的产生，证明筛选到的基因簇的确是与三欣卡辛生物合成相关的；基因敲除orf(-3)、orf(-1)与orf(58)对三欣卡辛的产生没有影响，证实得到的基因簇包含了三欣卡辛生物合成所需要的所有基因(图5)。在各个基因敲除突变株中，有的完全中断了三欣卡辛的产生，有的产量有所变化，有的有新化合物出现(图8，图9)。
基于以上实验结果，并与同类化合物生物合成基因簇进行比较，本发明人确定三欣卡辛的生物合成基因簇包含从txn0到txn55的56个开放读码框(图2B)，涵盖染色体62.819kb的区域。
在整个基因簇中，13个基因(txn5-8,txn13,txn17,19,27,36,39,41,43,46)用于编码II型聚酮合成酶(PKS)及其相关蛋白；4个基因(txn14-16,txn12)编码起始单元合成相关 蛋白；13个基因(txn1-4,txn28-32,txn42,45,49,50)编码糖基合成相关蛋白；14个后修饰基因，(txn21,23-26，txn35,37,38,40,44,47,51-53)编码氧化还原酶，负责形成复杂的三并元含氧螺环；还包括2个抗性基因(txn33,38)，7个调节基因(txn0,txn9-11,txn18,34,55)以及3个功能不确定的基因(txn20,22,48)。(表1，图2B)。
三欣卡辛分子中蒽环骨架的合成
负责合成三欣卡辛骨架的是II型PKS基因，包含三个重复利用的酶：KSα、KSβ及ACP，此三者相互作用形成复合体，构成miniPKS。聚酮链以特殊的七碳单元承载到KSIII上转移到KSα上起始，并以丙二酰-CoA作为延伸单元进行8次延伸形成23C的聚酮酰-ACP。接下来在芳香化酶和C-9位酮基还原酶的催化下形成第一个环；在二三环环化酶和单氧化酶催化下形成第二、第三个环；最后发生脱羧及各种氧化还原酶对骨架的修饰后下形成成熟的蒽环骨架(图3)。
边链糖基单元的合成
两个糖基单元的合成也是平行于蒽环骨架形成过程的。其合成过程起始于葡萄糖-6-磷酸向dNDP-葡萄糖的转化(N为尿嘧啶或胸腺嘧啶)，继而在dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶的作用下脱去一分子水，在2,3-己糖脱水酶催化下又脱去一分子水，形成一个3,4-二酮基-2,6-双脱氧的dNDP-己糖结构；在糖基-3-酮还原酶的催化下C-3位酮基被还原成羟基并在3,5-表异构酶的催化下发生异构化。此时得到的糖基化合物接下来分流以两种合成路线分别得到1号和2号边链糖。1号边链糖是在两个酶作用下得到的，它们分别与丙酮酸脱氢酶的α亚基和β亚基同源，txn3催化硫胺素焦磷酸与丙酮酸缩合生成2-α-羟乙基硫胺素焦磷酸，再通过txn4的转乙醛作用将羟乙基转移到脱氧糖基的4’位羰基碳上，最后通过异构化形成成熟的1号乙酰脱氧糖基单元。而2号边链糖则是在NDP-己糖-3-C-甲基转移酶和己糖-4-酮基还原酶作用下形成2号糖基单元，成熟的糖基单元能够被糖基转移酶识别，被转移到蒽环骨架上形成成熟的三欣卡辛分子(图3)。
三欣卡辛或其类似物的制备
一直以来，获得结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型三欣卡辛结构类似化合物是我们研究该课题的重点目标之一，我们通过体内基因遗传操作，包括基因缺失、中断、置换等实验手段最终获得三欣卡辛一系列的突变株，通过对其中一些的发酵分析，发现已不再产生三欣卡辛及其类似物；其中一些则三欣卡辛的产量有所改变，还有一些突变株，通过对其大量发酵分离纯化，获得了部分三欣卡辛的中间体化合物(图8，图9)。
本发明中，制备三欣卡辛或其类似物的方法如下：
(1)提供一突变菌株；
(2)对步骤(1)所述的突变菌株进行培养，从而得到所述的三欣卡辛类似物。
其中，所述的突变菌株是以产生三欣卡辛的菌株为原始菌株，通过将所述原始菌株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一个或多个基因失活而形成的突变菌株。
在另一优选例中，所述的原始菌株包括链霉菌，更佳地包括链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45。在另一优选例中，所述的原始菌株是导入三欣卡辛生物合成基因簇的完整序列，从而表达三欣卡辛的菌株。优选地，所述的失活是通过以下方法实现：同源重组、定点突变、基因敲除、或其组合。
所述的被失活的基因是选自本发明所述的三欣卡辛生物合成所涉及的56个基因中的至少一个基因。优选的所述的被失活的基因选自下组：txn21、txn41、txn44、txn49、txn4、txn52，或其组合。
在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂HP20。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵母提取物、大孔树脂HP20，和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4、NaCl。
在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种子培养基为TSB培养基。
在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
优选地，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn-21、Txn-41，Txn-44、Txn-49、Txn-4-1、Txn-4-2、Txn-52。
文献中报道[The Jounal of Antibiotics.1981,1520]的三欣卡辛的产量为1-2mg/L，低的产量对研究其生物合成途径及获得活性中间体带来很大的困难。因此找到合理的提高其产量的方法和途径是及其重要的。本发明人通过改变培养基配方和发酵时间，获得每升的培养基可获得三欣卡辛A纯品近500mg，相对原来的产量而言提高了近400倍。这也为接下来研究三欣卡辛的生物合成途径奠定了基础，同时所有的突变株也是在此培养条件下发酵获得(图4，图5)。
本发明的应用及优点
三欣卡辛作为一种蒽醌类抗生素，其生物活性、作用机制和生物合成路线有其独特的地方，这些机制的阐明对于发现新的药物作用靶点、作用机制有重要意义。在对其生物合成机制有着充分理解的基础上，有助于通过对生物合成途径的合理化遗传修饰，来构建三欣卡辛的高产菌株或获得更具应用价值的结构类似物。
本发明以链霉菌来源的三欣卡辛为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法验证其负责三欣卡辛的生物合成。期望通过体内基因操作、体外异源表达等方法，研究三欣卡辛的生物合成机理，提高其发酵产量。这有利于合理修饰三欣卡辛的生物合成途径，以便获得结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型三欣卡辛结构类似化合物。
三欣卡辛生物合成基因簇的应用
本发明的三欣卡辛生物合成基因簇的应用，包括(但并不限于)：
(1)可利用本发明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法或利用包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交从其它微生物中得到三欣卡辛生物合成基因的同源基因；
(2)构建包含本发明所提供的基因簇核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的质粒，以用于研究或生产目的；
(3)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因，可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其它更高的生物活性或产量的酶。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等；
(4)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径；
(5)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等；
(6)本发明所提供的具有三欣卡辛合成相关蛋白可用于抗体的制备；
(7)对于本发明所提供的氨基酸序列或部分序列，可对多肽进行改造，以便获得去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或提高产量或优化蛋白动力学特征；
(8)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可以用来调节三欣卡辛或其衍生物的产量；
(9)本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子；
(10)本发明提供的三欣卡辛产量提高的方法，可以用来获得更多的三欣卡辛及其类似物；
(11)本发明提供的几种三欣卡辛中间体化合物，可以用来进一步研究其生物活性，亦可以通过其他手段对分子进行修饰从而获得活性更理想的天然产物类似物。
总之，本发明所提供的包含三欣卡辛生物合成相关的所有基因和蛋白信息有助于阐明与理解三欣卡辛及相关抗生素家族生物合成的分子机理。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989或Hopwood等人，1985年，Genetic manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual,John I nnes Foundation,Norwich,UK)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1
三欣卡辛产生菌链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45基因组DNA的提取：
1)收集菌丝
将100μL1×108个/mL的Streptomyces bottropensis DO-45孢子悬液接种到3mL TSB液体培养基中，30℃，230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期，取2mL接种到50mLTSB中(含25mM氯化镁)，30℃，250rpm培养约36hr后达到稳定生长期前期，呈乳黄色浑浊，将菌液4℃，3500rpm，离心15min收集菌丝，用溶菌缓冲液洗涤，收集淡黄色菌丝0.5mL。
2)抽提基因组DNA
向1mL菌丝中加入10mL溶菌缓冲液(含溶菌酶5mg/mL)，涡旋至均一，37℃水浴15mim。加入0.1mL蛋白酶K溶液(10mg/mL，用溶菌缓冲液新鲜配制)，1mL10%SDS，混匀后迅速放入70℃水浴15mim，呈澄清。置冰上冷却，加入2.5mL5M KAc，冰上冷却15min。加入10mL饱和酚，混匀，10mL氯仿，混匀，12000rpm，4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加等当量的氯仿：异戊醇(24:1)抽提，12000rpm，4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管，加5mL70%乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE缓冲液溶解，加RNase A使终浓度为50μg/mL，37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，氯仿：异戊醇(24:1)抽提两次，向水相中加入0.1体积的3M NaAc，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL70%乙醇用于洗涤)，将液体吸出，再加1mL无水乙醇洗涤，吸出乙醇，超净台中吹干，溶于适当体积的TE缓冲液(pH8.0)中。
实施例2
PCR克隆三欣卡辛合成基因：
50μL PCR体系的组成：
PCR程序：
Taq酶
循环1：94℃，3min，1轮循环；
循环2：94℃，30s；55-65℃，30；72℃，1min/kb；35轮循环；
循环3：72℃，5-10min；1轮循环。
Primestar：
步骤1：98℃，10s
步骤2：58-65℃，15s
步骤3：72℃，1min-3min
步骤1-3循环30轮
步骤4：72℃，10min
不同引物的PCR条件都是以上述条件为基础进行优化的。
PCR以后，将预期大小的DNA条带低熔点胶回收纯化，并连接到PCR克隆载体pGEM-TEasy载体中，转化E.coli DH5α，涂布在含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-Br-4-Cl-3-indole-β-D-galactoside，X-gal)的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色克隆进行鉴定。插入有预期大小DNA片段的质粒测序。
有时，引物两端设计有酶切位点，可以克隆入合适的载体中，酶切鉴定或测序。
实施例3核酸分子杂交
1)地高辛DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μL dNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL0.8M EDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL4M LiCl混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于-80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μL TE(pH8.0)中。
2)菌落杂交(文库筛选)的膜转移：将保存于-80℃的基因文库稍融，取50μL，用450μL LB稀释得到10-1的稀释倍数，倍比稀释得到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。300μL涂平板(15cm×15cm，平板为LB/50μg/mL卡那霉素)。选取合适的比例，使每块平板约1200-1500个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37℃培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上，干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4-5hr，使克隆重新生长作为原平板。将尼龙膜置于变性液(0.25MNaOH，1.5M NaCl)饱和的滤纸上15分钟(不要浸过膜)，转移至中和液(1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH7.5)饱和的滤纸上5分钟。转移至2×SSC(20xSSC储备液(L-1)：NaCl，175.3g，柠檬酸钠，88.2g，pH=7.0)饱和的滤纸上自然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120℃固定45分钟。常温下于3×SSC/0.1%SDS溶液中振荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。
3)预杂交和杂交：预热杂交液(20mL/100cm2)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm2)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。
4)杂交后洗脱：室温下用2×SSC/0.1%SDS漂洗两次，每次5分钟。68℃，用 0.1×SSC/0.1%SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。
5)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15MNaCl，pH=7.5,0.3%(v/v)吐温20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10%的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH=7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1MNaCl,pH=9.5)中平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT溶于70%DMF，浓度为70mg/mL，BCIP溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μL NBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。
实施例4三欣卡辛生物合成基因簇的克隆
提取Streptomyces bottropensis DO-45的总DNA,利用试剂盒进行基因组文库构建，构建方法按照试剂盒的说明进行。所使用的试剂盒为CopyControlTM Fosmid Library Production Kit,购自EPICENTRE Biotechnologies公司。
如前文所述，根据KSα和KSβ的保守氨基酸序列设计了简并引物(For(KSα)：ATC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCS ATC-3’，Rev(KSβ)：CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC；S=C或G,Y=C或T,R=A或G)进行PCR，从Micromonospora sp.TP-A1304基因组DNA中扩增得到了1.1kb的片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序验证其的确与II型PKS相关。用地高辛标记上述1.1kb片段作为探针，通过原位杂交从基因组文库中筛选阳性克隆，得到黏粒cZM04-4；通过PCR分析该黏粒，发现该黏粒不仅包括KS基因，同时也包括UDP-葡萄糖-4,6-脱水酶的基因信息，再根据cZM04-4端基测序结果发现其一端已经包含基础代谢的基因信息(编码膜蛋白和脂蛋白)，另外一端则编码信息为未知蛋白，故对其进行全菌测序。获得其完整信息后经体内中断实验证实其确实与三欣卡辛合成相关。根据该黏粒设计探针进行染色体步移，得到黏粒cZM05-09-2。由于这两个黏粒还是未完全包含合成三欣卡辛的信息，包括糖基转移酶及氧甲基转移酶的信息均不完全，故再在cZM05-09-2末端设计探针进行菌落原位杂交实验，最终获得第三个黏粒cZM06-10-2，该三个黏粒进行拼接后共包含有102,575bp的基因信息。包含了完整的三欣卡辛生物合成基因簇(图2A)。3个相互交叠的黏粒代表了三欣卡辛产生菌Streptomyces bottropensis DO-45基因组已测序的102.6kb DNA区域。如图2B所示，三欣卡辛生物合成基因簇的基因组成；II PKS：II型聚酮合酶基因；PKS initiation：聚酮合酶起始单元相关基因；Tailoring：后修饰基因；Sugar：糖基合成相关基因；Regulation/resistance：调节/抗性基因；Unknown：无明显作用的基因；Beyond cluster:三欣卡辛基因簇外的基因。
实施例5PCR-targeting技术(Red-ET基因打靶)
1.PCR-targeting片段制备
以商业化的盒子为模板为模版(含Am抗性基因)，PCR溶液组分同前，聚合酶采用高保真酶primer star和Takara Taq DNA polymerase一起，进行PCR反应。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离分析，与预期大小符合的条带，Kit回收，溶于50μl无
酶双蒸水。
PCR程序
循环1：94℃，2min，1轮；
循环2：94℃，45sec;50℃,45sec;72℃,90sec；10轮；
循环3：94℃，45sec;55℃,45sec;72℃,90sec；15轮；
循环4：72℃，5min；1轮。
2.11.2电转化
将黏粒转化入E.coli BW25114感受态细胞(含有pIJ790)，涂布于含有50μg/mLAmp和30μg/mLCm的LB平板上30℃培养过夜。挑选取大肠杆菌单菌落接种入3ml含有25μg/mLCm50μg/mLAmp的SOB中，30℃摇床培养过夜。接种500μL菌液至50mL新鲜的SOB培养基(含25μg/mL Cm，50μg/mLAm)中，同时添加500μL1ML-阿拉伯糖，30℃培养约2～3h至OD600～0.6。3800rpm，4℃离心10min回收菌体，尽量弃掉上清，加入1mL10%甘油，打散沉淀，再加9mL10%甘油,摇匀。3800rpm，4℃离心10min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。重复上面操作4次左右：3800rpm，4℃离心10min，尽量弃去上清，用100μL10%甘油重悬。与此同时准备电击杯，洗净后泡于70%的乙醇中，从乙醇中取出保存好的电击杯，在超净台下用无水乙醇洗涤两次，最大风力下吹干，置于冰上或冰箱预冷30min。将100μL感受态细胞与1～2μLPCR产物混匀，加入预冷的0.1cm的电击杯中，电击条件采用200Ω,25uF,1.8kv,电击时间4.5～4.9ms，立即加入1ml预冷的LB，37℃培养60min后；涂布于含有50μg/ml Am和50μg/ml Cm的LB平板，37゜C过夜培养。挑取单克隆接种至50μg/mlAm和50μg/mlCm的液体LB中，而后抽提质粒，溶于50μl TE溶液，再次转化E.coli S17-1中进行纯化，而后挑取单克隆接种，菌液提取质粒进行酶切或者PCR鉴定。
实施例6三欣卡辛产生菌Streptomyces bottropensis DO-45基因敲除方法
(一)带有Marker的基因置换突变株(以txn8为例)
(1)基因置换黏粒的构建
设计引物Tg-ks8-f:ACTTCTCACCGATGGCCGATCGGCCACACGCACCATCAGATTCCGGGGATCCGTCGACC和Tg-ks8-R:GTACTTCCCTCGCGGATCAGCTCCACCGCGTGTCCGATCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC，以Targeting盒子为模板扩增得到1.5kb左右的片段(两端包含有39bp的同源臂)，按照实施例5的方法获得包含有目标缺失基因置换成Am抗性的黏粒，并将其转化到大肠杆菌S17-1中，经过PCR验证正确后，作为接合转移的供体菌。
(2)通过接合转移获得基因置换单交换突变株
从经过转化的大肠杆菌(E.coli S17-1)培养平板上挑取单菌落接到试管中培养过夜，吸取500μl的菌液接到25ml LB中，置于37℃摇床中培养至OD600为0.4-0.6。将菌液离心沉淀，用35mL LB培养基洗涤两次，然后用1ml的LB培养基重悬，作为供体菌。
取冻存于-80℃、20%甘油保存的链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45的 孢子悬液500μL，用等体积的TES缓冲液洗两次，重悬于等体积的TES缓冲液，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB，37℃温育2-5hr。离心重悬于1mL LB中作为受体菌。
将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mMMgCl2的IWL-4或MS平板上，30℃培养12-18hr后，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(nalidixic acid，终浓度为50μg/mL)和Am抗生素的1mL无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。接合子如果能够在含有阿泊拉霉素50μg/ml的TSB培养基中生长，则为目标基因被替换(至少已是单交换)的突变株。(图7)
(3)基因置换双交换突变株的获得
已经摇浓的带有Am抗性的TSB菌液，取10ul加入到无抗的TSB中(松弛培养)，30℃培养24hr后，取1-5ul菌液经过200ul无菌水的稀释后涂在带有Am抗性的MS平板上，2-3天后长出单克隆，经过对部分单克隆PCR验证，凡是只能扩增出单一的1.5kb大小的而不能扩增出野生型(一般五六百个碱基)条带的即为发生双交换置换的突变株。经过不断的松弛培养和涂板PCR验证最终获得完全发生双交换的基因置换突变株。(图7)
(二)同框缺失突变株的获得
该方法与上述中基因置换突变株的方法大部分是一样的，开始的同源臂PCR时，必须以带有Am抗性的LoxP质粒为模板进行扩增，引物与方法(一)中的一样，均为59bp包含有39bp同源臂序列的基因片段。同样的方法获得基因置换黏粒，最终接合转移获得带有抗性基因的基因置换突变株后，还需要再发生一次接合转移，利用导入含有Cre基因的质粒于链霉菌中，通过抗性基因Tsr(硫链丝菌素)来筛选接合转移平板的接合子，最终在无抗的TSB松弛下丢掉trs抗性，并通过PCR验证获得基因型正确的同框敲除突变株(该突变株PCR扩增出的条带远小于野生型的大小通常为200-400bp)。其中的原理是因为Cre基因编码的蛋白识别Loxp位点，利用Loxp自身的同源重组从而将其中间的Marker序列缺失,从而获得同框缺失突变株。(图7)
实施例7链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45产量的提高：
之前文献[The Jounal of Antibiotics.1981,1520]报道三欣卡辛的产量1-2mg/L，利用文献报道的种子(每100ml:玉米汁0.5g，蔗糖2g，果糖1g，葡萄糖1g。K2HPO40.15g，MgSO40.05g，CaCO32g，KCl0.4g。pH=7.0)培养基和发酵培养基(每100ml:可溶性淀粉6g,玉米汁1g，微量元素)发酵后(表2)(表3)，发现三欣卡辛的产量不太稳定，而且产量也不高。
为了获得一种稳定的发酵条件同时提高三欣卡辛的产量，改动原有发酵培养基的配方为SYG培养基(每100ml:可溶性淀粉6g,葡萄糖1g,酵母提取物1g，微量元素(CuSO4·5H2O7mg,FeSO4·7H2O1mg,MnCl2·4H2O0.8mg，ZnSO4·7H2O0.2mg，CoCl2·7H2O0.0006mg))，种子培养基则改为普通的TSB培养基；同时最关键的是尝试在发酵时加入了大孔树脂HP20，并摸索了HP20的加入时间和加入量。最终确定了在刚开始发酵时便加入质量比为50%的HP205g每100ml(表3-2)，发酵五天时间即可收菌，经过进一步柱纯化最终分离得到三欣卡辛A纯品约500mg/L，产量提高了近400倍。(图4， 图5)
表2发酵培养基中的微量元素
表3-1：原有液体培养基
表3-2：改进后液体培养基
图6显示了本实施例中，改变配方后加入大孔树脂HP20，三欣卡辛产生量的提高。表格为HP20在发酵时加入的时间，“+”代表产量高低，越多则产量越高。由上到下依次为未加HP20，初始加入HP20，第三天加入HP20，发酵后加入HP20的发酵液HPLC图，明显可以看出发酵初始时加入HP20产量最高。
实施例8链霉菌Streptomyces bottropensis DO-45基因敲除突变株的发酵和产物鉴定：
(1)突变株的发酵
接种基因型正确的孢子20ul到50mL发酵培养基TSB(250mL摇瓶)中30℃，250rpm培养至呈对数生长期(36hr)。接种2.5mL至50mL发酵培养基SYG(可溶性淀粉6g,葡萄糖1g,酵母提取物1g，CuSO4·5H2O7mg，FeSO4·7H2O1mg,MnCl2·4H2O0.8mg，ZnSO4·7H2O0.2mg，CoCl2·7H2O0.0006mg)(%)中，再加入灭过菌的大孔树脂HP20(质量比为50%)的2ml,在30℃，220rpm条件下培养5天。离心收集沉淀，用丙酮分两次浸泡，并超声10min,离心去沉淀后，旋转蒸发仪旋去上清中丙酮，水相用乙酸乙酯萃取三到五次，有机相用饱和食盐水洗两次后旋去乙酸乙酯，用少量甲醇溶解。取20μL稀释到1ml甲醇中做HPLC。
各突变株以及野生型均采用相同的方法进行发酵和发酵液的处理。如果要分离突变株产生的化合物，则需要将发酵量扩大至1-4升，扩大的方法是增加发酵摇瓶的数量；菌体培养方法和发酵液处理方法与前面相同。
(2)突变株发酵产物的鉴定
高效液相色谱(HPLC)分析
将突变株的发酵提取液与野生型菌株的发酵提取液分别用HPLC检测，通过对比检测结果确定突变株是否产生新的化合物。具体做法是将发酵液提取物溶于甲醇中，取20μl进样，A相为水(含0.1%甲酸)，B相为乙腈(含0.1%甲酸)。流速=1mL/min，紫外271nm处检测，柱子为NUCLEOSIL100-5C18，仪器为安捷伦1260。洗脱梯度如下：
液相-质谱连用(LC-MS)与核磁共振(NMR)分析:
若HPLC分析发现突变株能够产生新化合物，可以进一步将突变株的发酵提取液用LC-MS检测新化合物的分子量和部分结构信息，再通过大量发酵分离纯化化合物进行NMR分析，得到化合物完整的结构信息。(图8，图9)
验证正确的基因敲除突变株与野生型同时进行发酵，发酵之后的提取液用HPLC检测。HPLC结果能够反映基因的敲除是否对三欣卡辛的产生造成影响，以及基因敲除突变株中是否有新化合物出现。WT：三欣卡辛产生菌野生型；
图8-1：敲除基因txn0，产生突变株为mZM-0-1/2。该基因敲除后野生型的产量显著下降，所以该边界基因与三欣卡辛生物合成基因簇相关。
图8-2：敲除基因txn5，产生突变株为mZM-5-1/2。该基因缺失后没有完全中断三欣卡辛的产生，只是产量有所下降。
图8-3：敲除基因txn14，产生突变株为mZM-14。该基因缺失后完全中断三欣卡辛的产生。
图8-4：敲除基因txn12，产生突变株为mZM-12-1/2。该基因缺失后并不影响三欣卡辛的生物合成，且产量没有太大的变化。
图8-5：敲除基因txn19，产生突变株为mZM-19-1/2。该基因敲除后不再产生三欣卡辛，且有新化合物产生，但量很低，还在分离中。
图8-6:敲除基因txn20，产生突变株为mZM-20-1/2。该基因缺失后没有中断三欣卡辛的生物合成，产量略有降低。
图8-7：敲除基因txn-22，产生突变株为mZM-22-1/2。该基因敲除不影响三欣卡辛的产生，且没发现明显的新峰出现。
图8-8：敲除基因txn-23，产生突变株为mZM-23-1/2。该基因敲除也未发现有新峰出现，且未影响三欣卡辛的生物合成。
图8-9：敲除基因txn-25，产生突变株为mZM-25-1/2。该基因敲除未中断三欣卡辛的合成，但其产量大大降低，且有新峰出现经分离纯化为色素的增加。
图8-10：敲除基因txn-26，产生突变株为mZM-26-1/2。该基因缺失后，完全中断野生型产生，发酵后色素很明显，非常红，HPLC显示有新化合物产生，但是峰型很杂，量都很低，有待大量发酵分离。
图8-11：敲除基因txn30，产生突变株为mZM-30-1/2。该基因缺失后，完全中断野生型产生，HPLC显示有新化合物产生，且从基因型分析应该是与糖基合成相关的化合物，产量挺高，有待大量发酵分离纯化。
图8-12：敲除基因txn35，产生突变株为mZM-35-1/2。该基因缺失后，完全中断野生型产生，HPLC显示有新化合物产生，但产量非常低，为分离纯化带来很大困难。
图8-13：敲除基因txn42，产生突变株为mZM-42-1/2。该基因缺失后，基本上不影响三欣卡辛AD的产生，HPLC显示也无化合物产生。
实施例9产生新化合物的突变株的获得
目前已经确定产新颖结构化合物的突变株包括有mZM-5，mZM-21，mZM-41，mZM-44，mZM-49，mZM-52，这其中前四个突变株分别为带有Marker的双交换突变株，构建的方法也是采用实施例6中的方法(一)，最终经过PCR验证正确的基因型后，与野生型对比发酵，在HPLC图上发现有新的化合物峰出现。(图7)后两个则是采用实施例6中的方法(二)，最终拿到了不带Marker的同框敲除突变株，同样经过PCR验证后与野生型对比发酵，在HPLC图上发现有新的化合物峰出现。
实施例10新化合物的分离纯化和结构鉴定
通过大量发酵(1L-4L不等)突变株，最终分离纯化到七个具有新颖结构的化合物，分别是Txn-5-1,Txn-5-2,Txn-21,Txn-41,Txn-44,Txn-49,Txn-52。(图9)
图9-1：A.敲除基因txn4,产生突变株为mZM-4-1/2，分离纯化得新化合物Txn-4-1,Txn-4-2；B.LC-MS-Txn-4-1/Txn-4-2；C:NMR-Txn-4-1/Txn-4-2；解析出Txn-4-1、Txn-4-2结构如下。
图9-2：A.敲除基因txn21,产生突变株为mZM-21，分离纯化得新化合物Txn-21，与野生型对比HPLC图；B:Txn-21的MS数据；C:NMR-Txn-21/WT(新化合物与野生型的对比图)及化合物的二维谱图；解析出Txn-21结构如下所示。
图9-3：A.敲除基因txn41，产生突变株为mZM-41，分离纯化得新化合物Txn-41，与野生型对比HPLC图；B:Txn-41的MS数据；C：Txn-41的核磁数据； 综合上述数据，解析出Txn-41的结构为：
图9-4：A.敲除基因txn 44，产生突变株为mZM-44，分离纯化得新化合物Txn-44，与野生型对比HPLC图；B: Txn-44的MS数据；C: Txn-44的核磁数据(包括一维和二维谱图)；综合上述数据，解析出Txn-44
图9-5：A.敲除基因txn 49，产生突变株为mZM-49，分离纯化得新化合物Txn-49，与野生型对比HPLC图；B: Txn-49的MS数据；C: Txn-49与野生型对比的核磁数据(HNMR)；根据所有谱图分析，我们推出该化合物结构如下式所示，相比野生型在2号糖边链少了一个乙酰基的化合物：
图9-6：A.敲除基因txn 52，产生突变株为mZM-52，分离纯化得新化合物Txn-52，与野生型对比HPLC图；B: Txn-52的MS数据；C: Txn-52的核磁数据(包括一维和二维谱图)；解析出Txn-52结构
其中化合物Txn-5-1, Txn-5-2,在发酵突变株mZM-5一升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为10mg,5mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-1)
其中化合物Txn-21,在发酵突变株mZM-21两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃 取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为60mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-2)
其中化合物Txn-41,在发酵突变株mZM-41两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为20mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-3)
其中化合物Txn-44,在发酵突变株mZM-44两升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为15mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-4)
其中化合物Txn-49,在发酵突变株mZM-49一升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为45mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-5)
其中化合物Txn-52,在发酵突变株mZM-52四升后，通过丙酮浸泡，乙酸乙酯萃取等粗处理后，最终通过硅胶柱的纯化分离，以及凝胶柱的进一步纯化，共获得分别为30mg的纯品，最终通过LC-MS及HNMR的谱图验证其结构的正确性。(图9-6)
实施例11化合物及相关生物活性实验
为验证化合物Txn-49的细胞毒性，我们将jurkat细胞株(属急性T细胞白血病细胞系)作为本次细胞活性的测试菌株，与野生型化合物trioxacarcin A相对照来检测其生物活性。
MTT实验：
将Jurkat细胞800rpm离心2分钟，弃上清，用培养基稀释成细胞悬液，调整浓度至1×105个/ml，50μl/well接种于96孔平底透明板中，将待测小分子(Txn-49、trioxacarcin A)按不同浓度配制到培养基中，后加入到相应的孔中(50μl/well)，作用48小时，加入20μl/well的MTT(5mg/ml in PBS)作用4小时后，加入80μl/well三联剂(10%w/v SDS+5%iBuOH+0.01M HCl)，置于37oC下，12小时以上至紫色结晶完全溶解。用酶标仪测定OD(Optical Density)值(检测波长550nm，参考波长650nm)。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为加入与化合物同体积的DMSO，计算细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。
实验结果如图10所示，结果显示，在细胞菌株活性上，野生型的致死率要高一些，化合物Txn-49相对于野生型的细胞致死性变弱，但细胞毒性降低。体外细胞毒性降低了一个数量级，提示三欣卡辛的类似物(如Txn-49)具有与三欣卡辛不同的细胞菌株活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
机译： 胶束-生物合成基因簇及其应用
机译： 蜜环糊精生物合成基因簇及其应用
机译： Meleolide生物合成基因簇及其应用
