一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒和方法

摘要

本发明公开了检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒它包括SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示的引物对以及SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示的探针，本发明还公开了SEQ ID NO.1～2与SEQ ID NO.3～4所示的引物对、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针。本发明试剂盒可以准确检测石蜡切片组织中是否有结核分枝杆菌复合体，且灵敏度高，MTC的最低检测限为10fg，是现有方法的2.5％，特异性好，检测快速，临床应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒和方 法。

背景技术

结核病主要是由结合分枝杆菌复合体(M.tuberculosis complex，MTC) 引起的一类以呼吸系统感染为主的慢性人兽共患病。MTC主要由核酸组成高 度相似但宿主、表型和致病性等差异明显的不同种群组成：结核分枝杆菌 M.tuberculosis,非洲分枝杆菌M.africanum,肯尼迪分枝杆菌M.canettii,牛 分枝杆菌M.bovis,田鼠分枝杆菌M.microti,海豹分枝杆菌M.pinnipedii以 及羊分枝杆菌M.caprae。在中国，每年结核病新发病例大约是100万，大约 占到了全球新发病例的十分之一(http://www.chinacdc.cn/)。因此，特异、快速、 高效地检测出MTC不仅可以尽快的给患者准确的诊断同时从流行病控制的 角度有利于控制和阻止结核病(国家法定乙类传染病)在人群的流行。

MTC几乎可以感染人类的任何组织和器官，其中最常见的是肺。病人通 常是有较密切的结核病接触史后出现呼吸道咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同 程度胸闷或呼吸困难而入院就医。通过影像学及痰液或者胸腹水中的MTC 检测诊断肺结核。当MTC感染肺以外的其他组织或者器官包括：淋巴结、 消化道、关节和滑膜、(支)气管、肾脏、胸膜和胸壁、鼻(咽)部、腹腔、 骨等，其与宿主组织反应出现肉芽肿结节，外科手术后送检病理诊断。

在常规病理诊断中，要确诊结核病，除了观察到以肉芽肿为特征的组织 学改变外，还需找到直接病原菌－MTC。目前我国病理科开展得最广泛的寻 找病原菌的方法为齐-尼氏抗酸特殊染，但是齐-尼氏抗酸有其突出的几大问 题比如：阳性率普遍偏低，国际报道普遍低于10％；另外，抗酸染色不能从 形态上区分开MTC和其他的非结核分枝杆菌(NTM)，造成误诊。

PCR检测时一种较为简便、准确的方法，但是目前所有基于PCR技术 的结核临床检测试剂盒都是针对新鲜样本(体液、血液等)，而MTC感染 后仅存留在局部组织中，如肉芽肿结节中，直接取新鲜的体液、血液或者组 织时，很多时候会因为选取的组织中不含MTC而造成假阴性结果。

将组织制成石蜡切片组织后，可以有效确定哪些部位有肉芽肿结节，因 此通过检测肉芽肿结节的组织是否含有MTC，可以准确的确定是否感染 MTC，降低假阴性结果。但是石蜡组织有其自身的特点，比如其组织中DNA 均不是完整的DNA是片段化DNA，其大小一般小于500bp，另外石蜡组织 中，MTC均夹杂在宿主细胞中，难以富集，提取到的DNA绝大多数是宿主 DNA，待检的MTC的DNA往往含量很低，因此用常规检测新鲜样本的PCR 方法难以有效检测。

专利号为US7,332,597B的专利申请公开了一种检测石蜡切片组织中 MTC的方法，但是该方法的灵敏度低，MTC的最低检测限为400fg。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的检测石蜡切片组织中结核分 枝杆菌复合体的试剂盒和方法。

本发明提供了SEQ ID NO.1～2与SEQ ID NO.3～4所示的引物对。

本发明提供了SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针。

本发明还提供了SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示的引物对以 及SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示的探针在制备检测石蜡切片组织中 结核分枝杆菌复合体的试剂中的用途。

本发明还提供了一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂 盒，它包括SEQ ID NO.1～2和/或SEQ ID NO.3～4所示的引物对以及SEQ ID  NO.5和/或SEQ ID NO.6所示的探针。

本发明还提供了一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的方法， 它包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检石蜡切片组织，提取其中的DNA；

(2)基因扩增：用权利要求3所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行 扩增；

(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。

本发明提供的试剂盒可以准确检测石蜡切片组织中是否有结核分枝杆菌 复合体，且灵敏度高，MTC的最低检测限为10fg，特异性好，检测快速，临 床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是中国食品药品鉴定研究院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔 马林固定石蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂 盒(进口)对比实验。P表示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv  DNA浓度在10fg条件下，用本发明方法和试剂盒检测的结果，2表示待检菌 株H37Rv DNA浓度在10fg条件下，用商品化新鲜样本结核检测试剂盒(进 口)检测的结果；

图2是中国食品药品鉴定研究院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔 马林固定石蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂 盒(进口)对比实验。P表示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv  DNA浓度在100fg条件下，用本发明方法和试剂盒检测的结果，2表示待检 菌株H37Rv DNA浓度在100fg条件下，用商品化新鲜样本结核检测试剂盒 (进口)检测的结果；

图3是中国食品药品鉴定研究院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔 马林固定石蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂 盒(进口)对比实验。P表示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv  DNA浓度在1000fg条件下，用本发明方法和试剂盒检测的结果，2表示待检 菌株H37Rv DNA浓度在1000fg条件下，用商品化新鲜样本结核检测试剂盒 (进口)检测的结果。

具体实施方式

实验试剂：

PCR反应液(货号R007A)、dUTP、MgCl₂、UNG酶、Taq酶，均购自 大连Takara公司；石蜡组织提取试剂盒，购自Qiagen公司。

实施例1本发明检测试剂盒和检测方法

一、本发明试剂盒的组成

PCR扩增试剂(50人份)：

Primer 1：上游引物(F)为：5'-TGG CCA TGC TCT TGA TGC-3'(SEQ  ID NO.1)；下游引物(R)为：5'-CAA ACA AAA CCC AAA CAC TCC C-3' (SEQ ID NO.2)；

FAM标记的Taqman荧光探针1引物序列为 5'-CAGGATATTTCTAAATACCTTTGGCTCCCT-3'(SEQ ID NO.5)；

Primer 2：上游引物(F)为：5'-GACCTACTACGACCACATCAA-3'(SEQ  ID NO.3)；下游引物(R)为：5'-TCAGGGTTAGCCACACTTT-3'(SEQ ID  NO.4)；

FAM标记的Taqman荧光探针2引物序列为：5'- ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCA-3(SEQ ID NO.6)。

二、采用本发明试剂盒检测

1、样本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等

石蜡组织提取试剂盒，本例以Qiagen公司为例，提取DNA：

利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；

将石蜡包埋组织切成4μm厚的薄片；

迅速用灭菌小镊子取2—6枚装入DNase/RNase Free EP管中(每张摊开 面积500(最大)mm²，即边长1.6cm的正方形大小；

加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；

加入800μl二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数离心3分钟；

弃二甲苯，加入800μl无水乙醇，最大转数离心3分钟；

弃无水乙醇，挥干样品；

加入180μl ALT buffer及20μlproteinase K，56℃一小时以上，直至清 亮；

90℃一小时；

离心6000g 1min，取上清；(此步骤是防止沉淀物阻塞柱子)

加入200μlAL,混匀，加入200μl乙醇，再混匀；

简单离心清洁管壁；

将全部混合液加入到DNA分离柱，关盖，离心6000g 1min，换新的收 集管；

加入500μlAW1,6000g离心1min；换收集管；

加入500μlAW2，6000g离心1min，换收集管；

全速离心3min，干燥柱子；

换一只干净的1.5ml收集管，准备收集DNA；加入20-30μlATE,在室 温保持1min以溶解DNA。全速离心1min收集DNA。

2、多重PCR扩增

PCR引物和探针：

Primer 1：上游引物为：5'-TGG CCA TGC TCT TGA TGC-3'(SEQ ID  NO.1)；下游引物为：5'-CAA ACA AAA CCC AAA CAC TCC C-3'(SEQ ID  NO.2)；

FAM标记的Taqman荧光探针1引物序列为 5'-CAGGATATTTCTAAATACCTTTGGCTCCCT-3'(SEQ ID NO.5)；

Primer 2：上游引物为：5'-GACCTACTACGACCACATCAA-3'(SEQ ID  NO.3)；下游引物为：5'-TCAGGGTTAGCCACACTTT-3'(SEQ ID NO.4)；

FAM标记的Taqman荧光探针2引物序列为：5'- ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCA-3(SEQ ID NO.6)。

多重PCR体系(PCR体系及酶购自大连Takara公司)配制：

    工作浓度 DNA 10μl   Primer 1+Probe 1 2μl 上下游引物浓度均为500nM，探针浓度为150nM Primer 2+Probe 2 2μl 上下游引物浓度均为500nM，探针浓度为150nM 10Xbuffer 5μl   dUTP PLUS dNTP 4μl dATP 0.2mM、dCTP 0.2mM、dGTP 0.2mM、dUTP 0.6mM 25mM MgCl₂3.5μl 3.25mM Taq 0.3μl 1.5U UNG 0.05μl 0.1U H2O 23.2μl   total 50μl  

DNA 10μl、16S rRNA序列上下游引物工作浓度均为500nM、16S rRNA特 异性taqman探针工作浓度为150nM、IS6110上下游引物工作浓度均为 500nM、IS6110特异性taqman探针工作浓度为150nM、Tris-HCl(pH 8.3) 10mM、KCl 50mM、MgCl₂3.25mM、dATP 0.2mM、dCTP 0.2mM、dGTP 0.2mM、 dUTP 0.6mM、Taq酶1.5U、UNG 0.1U、双蒸水23.2μl；总反应体系为50μl。

PCR仪循环程序：

步骤 温度 时间 1 37℃ 5分钟 2 94℃ 1分钟 3 94℃ 5秒 4 60℃ 30秒 5 返回3步,共15次   6 94℃ 5秒 7 60℃ 30秒 8 采集信号 采集信号 9 返回6步,共25次     END END

3、结果判读：

根据扩增曲线及其CT值判读结果:CT值小于23判读阳性；CT值在23 －25之间需重复实验，再判读；没有扩增曲线或者CT值大于25，判读阴性。

以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：

实验例1本发明检测试剂盒的灵敏度和特异性

一、实验方法

1、灵敏度检测

中国食品药品鉴定研究院提供人结核标准菌株H37Rv(标准菌株 H37Rv，M.tuberculosis)，经过福尔马林固定石蜡处理(50％酒精1小时； 70％酒精1小时；80％酒精1小时；90％酒精1小时；95％酒精1小时；无 水酒精1小时；无水酒精/二甲苯混合物1小时；二甲苯透明4；二甲苯/石蜡 混合物过夜；石蜡1小时)后，在不同浓度下用本发明实施例1的试剂盒、 方法检测，以商品化新鲜样本结核检测试剂盒(德国Qiagen公司货号： tbCARE)作为对照。

2、特异性检测

阴性参考品为中国食品药品鉴定研究院提供的非结核分枝杆菌以及呼吸 道感染细菌构成。其具体菌种包括：鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝 杆菌、堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟 脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺 炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌共计15种。以上参考品也是“结核 分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品”。

二、实验结果

1、灵敏度

如图1～3所示：

曲线P表示阳性参照，曲线N是阴性参照(阳性参照：标准菌株H37Rv； 阴性参照：“结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品”中的阴性参照)， 说明正常工作。

曲线1是用本发明方法检测待检菌株H37Rv DNA浓度在10fg、100fg、 1000fg的检测结果，结果显示CT值小于23，判定为阳性，说明本发明方法 在待检菌株H37Rv DNA浓度为10fg、100fg、1000fg的情况下，均可以有效 检测；

曲线2是用商品化新鲜样本试剂盒的检测结果，在检测待检菌株H37Rv  DNA浓度在10fg，其扩增曲线的CT值远大于25，判定为阴性，说明用商 品化新鲜样本试剂盒无法准确检测DNA浓度为10fg的H37Rv。

实验结果说明，本发明方法和试剂盒可以有效检测结核分枝杆菌，灵敏 度高，最低检测限低至10fg，比检测试剂盒(德国Qiagen公司货号：tbCARE) 低了一个数量级。

2、特异性

经鉴定，使用本试剂盒的对鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、 堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝 杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺炎球菌、 嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌进行检测，检测结果全部为阴性。

实验结果说明，本发明方法和试剂盒特异检出有结核分枝杆菌复合体， 而不会检测其他细菌，特异性好。

综上，本发明试剂盒可以准确检测石蜡切片组织中是否有结核分枝杆菌 复合体，且灵敏度高，MTC的最低检测限为10fg，是现有方法的2.5％，特 异性好，检测快速，临床应用前景良好。