结核分枝杆菌中dodecin-like家族蛋白的初步研究与结核抗体检测试剂盒的研制和应用

摘要

结核病是一种古老的传染性疾病,但目前对于其病原微生物结核分枝杆菌的研究还不是很透彻。结核分枝杆菌的4000多个基因中,只有40％左右的编码基因功能明确,其余基因的功能都不十分清楚。
　　 我们发现结核分枝杆菌中存在一种特殊的黄素结合蛋白(dodecin),编码基因为Rv1498A,共70个氨基酸,以十二聚体的形式存在,属于dodecin-like蛋白家族。目前发现dodecin蛋白基本上存在于极端微生物中,能够储存和运输黄素(包括FMN和FAD),在微生物的氧化还原反应(如电子传递链)和某些新陈代谢过程中起着重要的作用。我们通过质谱、光谱学、分子进化分析和等温滴定微量热分析等方面的研究与分析,证实Rv1498A在体内体外都能够与黄素结合,且与FMN的结合能力高于FAD。
　　 对Rv1498A蛋白的理化性质分析表明,该蛋白能够耐受5M NaCl(接近饱和的盐浓度)和121℃高温处理等极端环境的破坏。经DSC分析表明,使该蛋白完全变性的温度需要超过130℃。
　　 通过对Rv1498A蛋白晶体结构的解析与分析,我们证实蛋白质在极端环境中的稳定性与表面电荷的多少没有关系,而是盐键网络、氢键网络、表面离子结一合和疏水残基埋藏等因素综合作用的结果。Rv1498A形成一个对称的四面体状中空结构,可以将蛋白或多肽展示在十二聚体的外表面,实现被展示蛋白的对称性多聚化,从而提高蛋白的活性;也可以将药物或生物活性化合物包埋在蛋白内部,为研制新型的药物投递系统和常温疫苗等奠定基础。
　　 在对dodecin-like蛋白家族的分子进化分析研究中,发现该家族随着物种进化的过程,其蛋白功能由嗜盐古细菌的黄素结合开始,产生两种方向上的进化(直系同源和旁系同源),一个方向仍然结合黄素,另一个方向的功能尚不明确。在包括结核分枝杆菌在内的7种极端微生物中,同时存在2个dodecin-like蛋白家族的成员。我们针对结核分枝杆菌中另一个dodicin-like家族蛋白mtb8的理化性质、结构和功能等的研究和分析表明,该蛋白为盐依赖性蛋白,能耐受5M NaCl的高盐,并在盐离子(尤其是多价离子)的帮助下,可以耐受高压灭菌及高浓度乙醇溶液的破坏。Mtb8在盐离子的作用下形成十二聚体,但不结合黄素,通过结构预测、分子进化分析、分析超离和光谱学分析等方式的研究证实,mtb8拥有与Rv1498A相似的结构但执行的功能不一致。
　　 另外,我们在对结核分枝杆菌来源的其它基因工程重组抗原的理化性质研究中,发现很多表达在超声上清或包涵体复性后拥有接近天然构象的蛋白,也能够承受100℃的高温变性处理,证实极端微生物来源的蛋白质往往都具有耐受极端环境破坏的能力。这为今后基因工程重组抗原的表达纯化提供了一个良好的思路。
　　 目前,结核分枝杆菌的感染情况很严重,全球约有三分之一的人群感染结核,且每年约有800-1000万新发结核病患者,约有300万人死于结核病,我国在全球结核病高负担国家中排名第二。然而结核病的现有诊断方式都存在各种缺陷和不足,其中血清学诊断试剂,尤其是国产试剂,质量需要尽快提高。
　　 我们利用基因工程技术表达目前报道的效果较好的结核血清学诊断候选抗原,通过各抗原的检测效率和互补情况分析,将结核血清学诊断候选抗原大致分为4类,为今后诊断用抗原的进一步筛选比较提供指导,并以此建立初步的结核抗体检测试剂盒。经临床实验验证,该试剂盒的检测性能与国际主流试剂性能相当。