一株海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌菌株及其应用

摘要

本发明涉及一株海洋污泥来源的水莱茵海默式菌菌株（Rheinheimera aquimaris）QSI02及其在细菌群体感应抑制筛选方面的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏日期为2015年4月23日，保藏号为CCTCC NO:M2015245。本发明是首次报道Rheinheimera属的菌株具有细菌群体感应抑制活性。由该菌株发酵液制备的代谢物对紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统具有双重抑制作用，并且在有效浓度范围内对筛选模型紫色杆菌CV026的菌体生成不产生抑制作用。该菌株提取物能够显著降低紫色杆菌紫色素的产量以及铜绿假单胞菌的群集运动，减弱致病菌的耐药性，从而在解决细菌耐药性问题、研发新型抗菌药物方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物领域，具体涉及一株海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）QSI02菌株及其代谢产物在细菌群体感应抑制筛选方面的应用。

背景技术

群体感应（Quorum sensing, QS）是广泛存在于细菌间的一种信息交流现象。近年来的研究发现细菌可以通过生产、识别、感应一种或多种可溶性的化学信号分子来实现相互间信息的传递和交流。尽管早在20世纪60年代就已经在一种海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）中发现了群体感应现象，但是直到1994 年细菌群体感应这一概念才被提出（J. Bacteriol.,1994,176:269-275）。许多细菌都能合成并释放一种称作自诱导物质（auto inducer, AI）的信号分子，当一个特定环境中细菌的数量急剧增加时，其所分泌的信号分子的浓度也会相应的升高，当得到一定的阈值时细菌与细菌之间就会通过这种信号分子来调控基因的表达，比如生物发光、生物被膜形成、抗生素产生、毒素产生、生产孢子等。

近些年来细菌耐药性问题日益突出，传统的抗菌药物由于产生生存压力很容易使细菌产生耐药性，因此，以传统的靶点和筛选方法获得的抗菌药物无法从根本上解决细菌性感染疾病问题。近些年来研究发现，细菌QS系统使作为单细胞生物的细菌，具备了部分类似于多细胞生物的功能，让细菌在应对环境挑战时，能协调一致，使细菌形成一种群体行为来有效的抵御外界环境压力、攻击宿主等。以细菌QS系统为靶标筛得的抗菌药物，与传统抗生素的作用机制完全不同，它不杀死细菌或抑制单个细菌的生长，只抑制细菌QS调控的致病行为，不易诱导耐药突变。

海洋相对独特的高盐、高压、寡营养、低光照等复杂生态环境造就了海洋微生物不同于陆生微生物的独特的生理功能与代谢机制，大大提高了结构多样性和活性多样性的先导化合物的发现概率。目前，已从海洋微生物中发现了大量的具有化学结构新颖、生物活性特异的化合物，其中有些已经作为药物广泛应用于临床。同时，海洋微生物种类多、易于培养，可通过人工发酵培养获得活性代谢产物因此海洋微生物资源已成为一种重要的环境友好的生物资源。

发明内容

本发明旨在提供一株具有细菌群体感应抑制活性的海洋细菌，该菌株代谢产物具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统的活性，并且能够降低致病菌致病行为的产生，减弱致病菌的耐药性。

本发明从黄海青岛海域海洋污泥样品中分离海洋细菌，采用紫色杆菌CV026筛选模型对分离得到的菌株进行细菌群体感应抑制活性的筛选，得到一株具有高效淬灭细菌群体感应活性的菌株。通过16S rDNA序列分析结合形态学及生理生化特征，鉴定其为Rheinheimera aquimaris QSI02，与GenBank中一株水莱茵海默氏菌的相似性达到99%。

本发明所述的具有细菌群体感应抑制活性的海洋细菌是水莱茵海默氏菌(Rheinheimera aquimaris)QSI02，于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO:M2015245。

本发明所述的活性代谢物的获得方法主要包括海洋细菌R.aquimaris QSI02的分离、培养与提取物的制备两个步骤。取活化后的海洋细菌R.aquimaris QSI02，接种到发酵培养基进行摇床培养，发酵结束后，离心、真空低温浓缩至膏状，用甲醇浸提得甲醇提取物，将甲醇提取物用0.22μm有机相滤器过滤后用于生物活性检测。

本发明所涉及的海洋细菌R.aquimaris QSI02制备的代谢物具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体感应系统的作用；在加入0-300μl范围内该代谢物不抑制紫色杆菌CV026的菌体生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的产生，当加入100μl代谢物时其抑制率达到50%。在加入200μl代谢物时能显著减弱铜绿假单胞菌的群集运动。

本发明与现有技术相比，具有海洋细菌R.aquimaris QSI02菌株发酵培养条件简单，活性代谢物的制备工艺过程简单易控，制备的代谢物具有明显的淬灭细菌群体感应的活性等特点。

附图说明

图1活性菌株R. aquimaris QSI02菌落形态。

图2 活性菌株R. aquimaris QSI02的系统发育树。

图3菌株R. aquimaris QSI02抑制QS活性的生物学检测。

图4 菌株R. aquimaris QSI02发酵液提取物抑制紫色杆菌紫色素产量分析。

图5菌株R. aquimaris QSI02发酵液提取物对铜绿假单胞菌PA01群集运动的影响。

具体实施方式

实施例中涉及到的紫色杆菌Chromobacterium violaceum(1511C0001ACCC10486)购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01为实验室所保藏。

实施例中所用的不同培养基配方如下：

（1）富集培养基：反硝化细菌富集培养基：KNO₃ 2g, K₂HPO₄0.5g, MgSO₄5g, 乙酸钠9.5g，H₂O 1L，pH7.0-7.4。

（2）筛选与发酵培养基：LB培养基：蛋白胨1%；酵母提取物0.5%；NaCl 0.5%。

实施例1：菌株R.aquimaris QSI02的富集筛选。

1.1样品采集：2010年9月从黄海青岛海域采集海水污泥样品，存放于无菌瓶中。

1.2 富集培养：取样品2g加入到150mL反硝化细菌富集培养基(KNO₃ 2g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 5g，乙酸钠9.5g，H₂O 1L，pH7.0-7.4)的250mL三角瓶中，30℃、150r/min摇床中培养，每3～4d取样用格里斯试剂检验NO₂^-的变化情况。选取NO₂^-变化大的反硝化细菌接入新鲜培养基。经过几次重复操作后，取菌悬液1mL置于盛有9mL无菌水的试管，混合均匀制成稀释度为10^-1的菌悬液，同样方法再做5个稀释度。

1.3 菌株分离纯化：取稀释度为10^-5、10^-6的菌悬液各100μL涂布在LB培养基上，30℃培养2～5d。挑选生长良好、菌落较大的菌落划线分离，重复2～3次后挑选优势菌落接种于斜面保藏培养基中，冰箱4℃保藏。

实施例2：菌株R.aquimaris QSI02鉴定与保藏。

2.1 形态特征：菌株R.aquimaris QSI02在LB培养基上呈乳白色，边缘整齐，革兰氏染色为阴性菌。通过透射电镜扫描结果显示（图1），菌体呈短杆状，大小约1.5-2.0μm宽，7.0-9.0μm长，含有很多鞭毛，且胞内有透明的内含物。

2.2 菌株16S rDNA鉴定与保藏：16S rDNA序列分析采用菌落PCR法，引物分别为fD1: 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和rD1: 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR反应条件如下：94℃预变性 3min ，94℃ 30s，55℃ 1min、72℃ 90s，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增结束后，将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。将经胶回收柱纯化的PCR产物与载体pMD-18T连接后转化E. coli DH5a感受态细胞。挑取阳性转化子进行序列测定。将待测菌的16S rDNA序列输入GenBank以Blast程序进行相似性比较分析，发现与已知菌株序列相似性大于99%，因此本发明菌株鉴定为Rheinheimera aquimaris种属，并命名为Rheinheimera aquimaris QSI02。根据相似标准菌株的16S rDNA序列构建的系统发育树见图2。本发明菌株Rheinheimer aaquimaris QSI02已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO:M2015245。

2.3 菌株生理生化特征：使用青岛高科园海博生物技术有限公司生产的博检革兰氏阴性细菌鉴定系统对筛得的水莱茵海默氏菌进行生理生化鉴定。结果如表1所示。

表1水莱茵海默氏菌的部分生理生化鉴定结果

*“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

经鉴定，水莱茵海默氏菌为革兰氏阴性菌。该菌株的最适生长条件与海洋环境很一致，显示了较强的海洋特征。

实施例3：菌株R.aquimaris QSI02代谢物的群体感应抑制活性检测。

3.1 菌株R.aquimaris QSI02代谢物的制备：取活化后的海洋细菌R.aquimaris QSI02，接种到发酵培养基进行摇床培养，发酵结束后，离心、真空低温浓缩至膏状，用甲醇浸提得甲醇提取物，将甲醇提取物用0.22μm有机相滤器过滤后用于生物活性检测。

3.2群体感应抑制活性检测：在LB平板上涂布200μl稀释10倍的C. violaceum发酵液，在中央位置贴一个蘸有0.5% DMSO水溶液的滤纸片作对照，在周围依次贴上蘸有待测菌提取物的滤纸片，观察滤纸片周围是否长菌却不出现紫色素。结果表明菌株R.aquimaris QSI02周围与对照相比紫色素分泌减少（图3），表明该菌有QS抑制能力。为了进一步证明待测菌有QS抑制能力，在7个装有10ml LB培养基和100μl紫色色杆菌的三角瓶中分别加入待测菌提取物0μl, 50μl, 100μl, 150μl, 200μl, 250μl, 300μl；在28℃、150r/min的摇床上培养48h。每瓶取1ml，离心（4000r/min, 30min），倒掉上清液，用1ml DMSO重新溶解沉淀，离心（4000r/min, 30min），将上清液分别倒入已标记好的离心管中，然后依次取200μl上清液加入到96孔微孔板中，用酶标仪测585nm的吸光度A₅₈₅，以此表征紫色素产量的变化。同时用1ml无菌水重新悬浮菌体，然后依次取200μl菌悬液加入到96孔微孔板中，用酶标仪测600nm的吸光度OD₆₀₀，以此代表菌体生长密度的变化。结果表明，加入该菌提取物的上清液，紫色素的产量明显减少，但是菌体的生长密度基本不变，表明该菌提取物具有QS抑制能力（图4）。

同时利用铜绿假单胞菌PA01为模型，分析了该菌提取物对PA01的群集运动(swarming)的影响。取14.75ml 热融化的swarming软琼脂培养基，待冷却至30℃左右，向其中加入200μl该提取物，轻轻混匀，倒入平板中，待凝固后，用打孔器打孔，将2μl过夜培养的铜绿假单胞菌PA01(OD_600nm=0.1)菌液加入孔中，37℃恒温培养24h，观察现象。结果表明，在琼脂平板上PA01表现出群集运动减弱(图5)，这就说明该菌提取物能够通过抑制群体感应介导的群集运动性，进而抑制毒力因子的表达。