一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其制备方法，以酰肼化透明质酸和N-丙烯酰基-L-α-氨基酸为主要原料，与交联剂混合均匀后实施紫外光辐照，同时实现腙键交联和光化学交联，形成交联网链中含二硫键的双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶。该水凝胶中二硫键可响应还原性物质而断裂，实现水凝胶的快速解离。该方法具有原料易得、反应条件温和、工艺简单快速等优点，制备的水凝胶具有强度、降解速度、微观孔结构、荷电状态可调等特点，生物相容性和细胞粘附性良好，在组织工程、三维细胞培养、体外肿瘤模型等方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透 明质酸复合水凝胶及其制备方法。

背景技术

随着三维细胞培养技术的快速发展，水凝胶越来越受重视，因为其不仅具有与活体组织类 似的多孔弹性水合网络，还利于氧、营养物质和代谢废物在其中的传输，可为细胞粘附、增殖 和分化提供理想的三维微环境。水凝胶已广泛用于生物医学研究领域，如药物或蛋白递送、细 胞递送、生物粘合剂、组织工程、体外细胞三维培养等。其中，由天然高分子制备的水凝胶， 如藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、胶原、丝素蛋白等，具有良好的生物相容性、生物可降解性、 细胞粘附性等性质。制备水凝胶的交联方法主要包括物理交联和化学交联两种。物理交联方法 通常工艺简单，但形成水凝胶强度不够高，而化学交联方法如光交联、碳二亚胺法交联、点击 化学交联等可赋予凝胶高的力学性能。然而，单一化学交联方法制备的水凝胶无法满足较高应 力环境下应用的要求，如骨或软骨组织等。为提高水凝胶的力学性能，新的技术手段不断出现， 如双交联网络结构水凝胶、互穿网络水凝胶、纳米复合凝胶和拓扑水凝胶等。

双交联网络水凝胶由两种三维聚合物网络构成，可克服彼此缺点，具有良好的综合性能， 尤其是拥有较高的力学强度，近年受到越来越多的关注。如利用聚丙烯酸改性聚乙二醇形成互 穿网络结构水凝胶，可使聚乙二醇水凝胶模量提高3.2倍[Waters DJ,et al.Structure and  mechanism of strength enhancement in interpenetrating polymer network hydrogels. Macromolecules,2011,44:5776-5787]；由聚甲基丙烯酰化古兰糖胶和聚甲基丙烯酰胺化明胶制 成的双网络水凝胶不仅具有高达6.9MPa的断裂应力，还可有效支持NIH-3T3纤维原细胞的 生长[Shin H,et al.The mechanical properties and cytotoxicity of cell-laden double-network  hydrogels based on photocrosslinkable gelatin and gellan gum biomacromolecules.Biomaterials, 2012,33:3143-3152]；再如，以中性寡聚(2,2-二甲基三亚甲基碳酸酯)-聚(乙二醇)-寡聚(2,2-二 甲基三亚甲基碳酸酯)-二丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯化透明质酸为原料，经两步光化学交联法制 备的双网络水凝胶最大压缩应力高达8.38MPa，可有效支持猪软骨细胞生长[Fan CJ,et al.A  tough double network hydrogel for cartilage tissue engineering.Journal of Materials Chemistry B, 2013,1:4251-4258]。尽管这些水凝胶具有较高的力学性能和良好的生物相容性，但是它们无 法满足细胞三维培养结束时需要细胞/基质快速分离的应用环境。因此，开发能响应刺激信号 实现快速解离并具有良好力学性能和生物相容性的水凝胶，具有重要的研究价值。

聚氨基酸(或称为多肽)是一类具有良好生物相容性、酶特异性降解性和功能性的新型材 料，其含有的功能性基团如-NH₂、-COOH赋予其独特的生物学性能，如碱性聚赖氨酸荷正电 对蛋白质、DNA和细胞膜就有很强的亲和性、可刺激免疫球蛋白和干扰素β的合成、抑制肿 瘤生长[Kuo YC,et al.Chondrogenesis in scaffolds with surface modification of elastin and  poly-L-lysine.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2012,93:85-91]；酸性聚氨基酸能诱导仿生 矿化和骨细胞分化[Amosi N,et al.Acidic peptide hydrogel scaffolds enhance calcium phosphate  mineral turnover into bone tissue.Acta Biomaterialia,2012,8:2466-2475]。另一方面，由L-α-氨基 酸丙烯酰化衍生物经自由基聚合形成的聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)，同样具有聚氨基酸的诸多 性质，在生物医学领域具有良好的应用前景，然而这类材料应用于生物医学领域的研究尚处于 婴儿期，在组织工程等领域的应用极少。这类聚合物形成的水凝胶脆性和模量均较大，单独使 用有一定限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶及其 制备方法。该方法制得的复合水凝胶的交联网链中含有二硫键，具有快速的还原解离性质；且 该复合水凝胶的荷电状态、模量、降解性能、微孔结构等性质可灵活调控，在组织工程、三维 细胞培养、体外肿瘤模型等生物医学领域应用前景广阔。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

配制质量百分浓度为1％～4％的酰肼化透明质酸溶液，并将其pH值调至4～6.5；将N-丙烯 酰基-L-α-氨基酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光引发剂和多端羰基聚乙二醇溶于蒸馏 水中配成混合物溶液；按体积比为1：(0.5～2)将混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，混合 均匀后置于模具中进行紫外光辐照，即得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合 水凝胶；其中混合物溶液中N-丙烯酰基-L-α-氨基酸的质量百分浓度为10％～30％，N-丙烯酰基 -L-α-氨基酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的摩尔比为100：(2.5～15)：(0.1～0.8)， 酰肼化透明质酸中的酰肼基团和多端羰基聚乙二醇中的端羰基团的摩尔比为1：(0.2～1)。

所述的酰肼化透明质酸是由分子量为20万～500万的透明质酸经碳二亚胺法接枝2,2'-二硫 代二乙酰肼、3,3'-二硫代二丙酰肼或4,4'-二硫代二丁酰肼形成的，取代度为10％～50％。

所述的酰肼化透明质酸的合成方法如下：

将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和含二硫键 的二酰肼溶于蒸馏水中配成混合溶液，混合溶液中透明质酸的质量百分浓度为0.2～2％，且透 明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、含二硫 键的二酰肼的摩尔比为100：(12～55)：(15～60)：(96～660)；将混合溶液的pH值调至4.5～5.5， 室温下搅拌反应24～48小时，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到酰肼化透明 质酸。

所述的N-丙烯酰基-L-α-氨基酸为N-丙烯酰基-L-谷氨酸、N-丙烯酰基-L-天冬氨酸、N_ε-丙 烯酰基-L-赖氨酸、N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸、N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸或 N-丙烯酰基-L-缬氨酸。

所述的N-丙烯酰基-L-α-氨基酸的合成方法如下：

将L-α-氨基酸(其中L-赖氨酸和L-鸟氨酸为其铜络合物形式)溶于水中形成质量百分浓 度为5％～20％的L-α-氨基酸水溶液，将其置于冰水浴中搅拌冷却，然后在0.5～2小时内滴加丙 烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中维持体系pH在8～9.5之间，其中滴加的氯仿溶液的体积为L-α- 氨基酸水溶液体积的10％～25％，丙烯酰氯与L-α-氨基酸的摩尔比为(1.2～2)：1；滴加完毕后在 室温下继续搅拌反应4小时，随后向反应体系中加入8～12倍体积的沉淀剂(采用铜络合物时 需先用L-α-氨基酸摩尔数1.5倍的8-羟基喹啉除铜)，沉淀剂为乙醇、甲醇、丙酮或四氢呋喃， 然后收集沉淀物并真空干燥，得到N-丙烯酰基-L-α-氨基酸。

所述的N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的合成方法如下：

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL～0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其 中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1；然后对L-胱氨酸溶液进行冰浴冷却，再向其中滴加丙 烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为(2.1～2.3)：1，滴加过程中维持体系 pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1～4小时，再在零下20℃进行冷冻干燥；将冷冻 干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，得到质量百分浓度为5％～20％的溶液，然后用6～12倍体 积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

所述的多端羰基聚乙二醇的分子量为400～8000Da，其合成方法如下：

将多端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入催化剂对甲苯磺酸，回流反应4～8 小时，然后负压去除2/3～3/4体积的甲苯，再用沉淀剂对反应体系进行沉淀，将得到的沉淀物 在30℃真空干燥24小时，得到多端羰基聚乙二醇；其中多端羟基聚乙二醇为2、3、4、6或8 端羟基聚乙二醇，多端羟基聚乙二醇上的羟基与乙酰丙酸的摩尔比为1：(1.5～8)，催化剂的质 量为多端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸总质量的0.5％～2％，沉淀剂为乙醚、甲醇、正己烷、乙醚 与正己烷的混合物或甲醇与正己烷的混合物。

所述的水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸或1-羟基环 己基苯基丙酮。

所述的紫外光辐照时间为0.5～10min，紫外光辐照时的中心波长为365nm、光能量密度 为1200mJ/cm²～1500mJ/cm²、照射距离为5cm～20cm。

制得的双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶为多孔结构，其孔径为100 μm～300μm，压缩模量为77.3～78.3kPa。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶的制备方法，以酰 肼化透明质酸和N-丙烯酰基-L-α-氨基酸为主要原料，与交联剂多羰基聚乙二醇、N,N'-双丙烯 酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂混合均匀后实施紫外光辐照，同时发生腙键交联和光化学交 联，形成交联网链中含有二硫键的双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶。 该方法具有原料易得、反应条件温和(室温进行)、反应时间短(数分钟内完成)、工艺简单(一 步完成)等优点。并且通过改变原料的配比来改变该复合水凝胶的化学成分和交联度，可灵活 调控该复合水凝胶的模量、强度、荷电状态、降解性能、降解速度和微观孔结构等性能，可在 层次上研究水凝胶对细胞生长行为的影响。

本发明制得的双网络聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明质酸复合水凝胶的化学成分为聚(N- 丙烯酰基-L-α-氨基酸)和透明质酸，具有优异的生物相容性，与细胞的粘附性良好；其双交联 网络结构赋予其良好的力学性质，压缩模量为77.8±0.5kPa。并且该复合水凝胶的交联网链中 的二硫键具有快速的还原解离性质，可响应生物还原性物质而断裂，实现水凝胶的快速解离， 由水凝胶转变为溶液；另外其含有的腙键具有pH敏感性，可加快水凝胶降解/解离速度。本发 明制得的复合水凝胶既可用于体外培养细胞，也可实现体内注射应用，在细胞递送、组织工程、 三维细胞培养、体外肿瘤模型建立等生物医学领域方面，尤其是完成细胞培养后需要细胞-水 凝胶有效分离、探讨力学信号和荷电状态影响细胞生长行为方面，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的双网络聚(N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸)/透明质酸复合水凝胶的扫 描电镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但对本发明并不限于此。

实施例1

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将2,2'-二硫代二乙酰肼接枝于分子量为100万的透明质酸上，得到取代度 为40％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、2,2'-二硫代二乙酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为1％的透明质酸溶液， 用1mol/L盐酸将体系pH值调至5，室温搅拌反应48小时，反应结束后，反应体系用去离子 水透析2天(透析袋截留分子量为3500Da，以下同)再在零下20℃进行冷冻干燥72小时， 得到酰肼化透明质酸。其中，透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐、N-羟基琥珀酰亚胺、2,2'-二硫代二乙酰肼的摩尔比为100：40：50：400。

2)N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸的制备

将L-赖氨酸铜络合物溶于水中形成质量百分浓度为10％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小 时；接着，在1小时内滴加含1.2倍于L-赖氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中 用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持体系pH在8.5，其中氯仿溶液体积为L-赖氨酸水溶液体 积的20％；滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入L-赖氨酸摩尔数 1.5倍的8-羟基喹啉除去铜，过滤后水相在其10倍体积的丙酮中沉淀，收集沉淀物、真空干燥 后，得到N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨 酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯 酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.1：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应3小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为5％的溶液，用10倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)双端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为2000Da的双端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比1％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应6小时，利用负压去除2/3体积的甲苯后，滴加入乙 醚中进行沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到双端羰基聚乙二醇。其中，双端 羟基聚乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：4。

5)双网络聚(N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为3％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至5；将N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光引 发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和双端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物溶 液；然后，将该混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：0.5，混合均匀后置于 模具中，实施紫外光照射5分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm²、 照射距离为15cm，得到双网络聚(N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中，N_ε-丙 烯酰基-L-赖氨酸的质量百分浓度为15％，N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸 和2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的摩尔比为100：10：0.5，酰肼化透明质酸中酰肼基 团和双端羰基聚乙二醇中端羰基团的摩尔比为1：1。

实施例1制备的双网络聚(N_ε-丙烯酰基-L-赖氨酸)/透明质酸复合水凝胶的扫描电镜照片如 图1所示。由图1可以看出，制得的复合水凝胶呈现高度多孔的结构，孔大小较均匀，孔径分 布范围为100μm～300μm。这说明制得的复合水凝胶适合于细胞的三维培养需要。

实施例2

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将2,2'-二硫代二乙酰肼接枝于分子量为200万的透明质酸上，得到取代度 为30％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、2,2'-二硫代二乙酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为0.5％的透明质酸溶 液，用1mol/L盐酸将体系pH值调至5.5，室温搅拌反应24小时，用截留分子量为3500Da 的透析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中， 透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、2,2'- 二硫代二乙酰肼的摩尔比为100：30：40：300。

2)N-丙烯酰基-L-谷氨酸的制备

将L-谷氨酸溶于水形成质量百分浓度为20％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时；接着， 在1.5小时内滴加含1.3倍于L-谷氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用浓度为 1mol/L的NaOH溶液维持体系pH在9，其中氯仿溶液体积为L-谷氨酸水溶液体积的25％； 滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入8倍体积的沉淀剂乙醇，收集 沉淀物并真空干燥后，得到N-丙烯酰基-L-谷氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.5g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸 的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰 氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.3：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应1小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为20％的溶液，用12倍体积量的丙酮沉淀， 所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)双端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为800Da的双端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比2％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应4小时，利用负压去除3/4体积的甲苯后，利用甲醇 沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到双端羰基聚乙二醇。其中，双端羟基聚乙 二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：3。

5)双网络聚(N-丙烯酰基-L-谷氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为4％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至5.5；将N-丙烯酰基-L-谷氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光 引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和双端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物 溶液；然后，将该混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：1，混合均匀后置 于模具中，实施紫外光照射4分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1500mJ/cm²、 照射距离为12cm，得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-谷氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中，N-丙烯 酰基-L-谷氨酸的质量百分浓度为30％，N-丙烯酰基-L-谷氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和 2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的摩尔比为100：8：0.3，酰肼化透明质酸中酰肼基团和 双端羰基聚乙二醇中端羰基团的摩尔比为1：0.9。

实施例3

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将3,3'-二硫代二丙酰肼接枝于分子量为80万的透明质酸上，得到取代度 为30％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼接溶于蒸馏水中，制备浓度为0.8％的透明质酸 溶液，用1mol/L盐酸将体系pH值调至5，室温搅拌反应24小时，用截留分子量为3500Da 的透析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中， 透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'- 二硫代二丙酰肼的摩尔比为100：30：40：300。

2)N-丙烯酰基-L-天冬氨酸的制备

将L-天冬氨酸溶于水形成质量百分浓度为15％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时；接着， 在0.5小时内滴加含1.5倍于L-天冬氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用浓度 为1mol/L的NaOH溶液维持体系pH在8.2，其中氯仿溶液体积为L-天冬氨酸水溶液体积的 10％；滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入12倍体积的沉淀剂丙 酮，收集沉淀物并真空干燥后，得到N-丙烯酰基-L-天冬氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.1g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸 的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰 氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.2：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应2小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为10％的溶液，用6倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)四端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为8000Da的四端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比1.2％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应8小时，利用负压去除2/3体积的甲苯后，利用乙 醚沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到四端羰基聚乙二醇。其中，四端羟基聚 乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：2。

5)双网络聚(N-丙烯酰基-L-天冬氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为3.5％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至6；将N-丙烯酰基-L-天冬氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光 引发剂2-氧化戊二酸和四端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物溶液；然后，将该混合物 溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：1.5，混合均匀后置于模具中，实施紫外光照 射3分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1250mJ/cm²、照射距离为10cm， 得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-天冬氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中，N-丙烯酰基-L-天冬氨酸 的质量百分浓度为25％，N-丙烯酰基-L-天冬氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和2-氧化戊二酸 的摩尔比为100：6：0.4，酰肼化透明质酸中酰肼基团和四端羰基聚乙二醇中端羰基团的摩尔 比为1：0.5。

实施例4

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将4,4'-二硫代二丁酰肼接枝于分子量为60万的透明质酸上，得到取代度 为10％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、4,4'-二硫代二丁酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为1.2％的透明质酸溶 液，用1mol/L盐酸将体系pH值调至5.5，室温搅拌反应24小时，用截留分子量为3500Da 的透析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中， 透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4,4'- 二硫代二丁酰肼的摩尔比为100：12：15：96。

2)N-丙烯酰基-L-丙氨酸的制备

将L-丙氨酸溶于水形成质量百分浓度为6％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时；接着，在 0.8小时内滴加含1.8倍于L-丙氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用浓度为1 mol/L的NaOH溶液维持体系pH在8，其中氯仿溶液体积为L-丙氨酸水溶液体积的22％；滴 加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入9.5倍体积的沉淀剂丙酮，收集 沉淀物并真空干燥后，得到N-丙烯酰基-L-丙氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.2g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸 的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰 氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.15：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应4小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为15％的溶液，用8倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)八端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为6000Da的八端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比1.5％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应5小时，利用负压去除8/11体积的甲苯后，利用正 己烷沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到八端羰基聚乙二醇。其中，八端羟基 聚乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：8。

5)双网络聚(N-丙烯酰基-L-丙氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为2.5％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至6.5；将N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光 引发剂1-羟基环己基苯基丙酮和八端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物溶液；然后，将 该混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：0.8，混合均匀后置于模具中，实施 紫外光照射8分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1300mJ/cm²、照射距离为 6cm，得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-丙氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中，N-丙烯酰基-L-丙氨 酸的质量百分浓度为18％，N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和1-羟基环己基 苯基丙酮的摩尔比为100：12：0.3，酰肼化透明质酸中酰肼基团和八端羰基聚乙二醇中端羰基 团的摩尔比为1：0.8。

实施例5

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将3,3'-二硫代二丙酰肼接枝于分子量为20万的透明质酸上，得到取代度 为15％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为0.2％的透明质酸溶 液，用1mol/L盐酸将体系pH值调至4.5，室温搅拌反应30小时，用截留分子量为3500Da 的透析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中， 透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'- 二硫代二丙酰肼的摩尔比为100：17：22：170。

2)N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸的制备

将L-苯丙氨酸溶于水形成质量百分浓度为11％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时；接着， 在2小时内滴加含1.4于L-苯丙氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用浓度为1 mol/L的NaOH溶液维持体系pH在8.8，其中氯仿溶液体积为L-苯丙氨酸水溶液体积的12％； 滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入9倍体积的沉淀剂丙酮，收集 沉淀物并真空干燥后，得到N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.3g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸 的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰 氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.25：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应2.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为12％的溶液，用9倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)四端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为4000Da的四端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比1.6％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应7小时，利用负压去除5/7体积的甲苯后，利用乙 醚和正己烷的混合物沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到四端羰基聚乙二醇。 其中，四端羟基聚乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：6。

5)双网络聚(N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为1％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至6.2；将N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性 光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和四端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合 物溶液；然后，将该混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：1.2，混合均匀后 置于模具中，实施紫外光照射4.5分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1400 mJ/cm²、照射距离为18cm，得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其 中，N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸的质量百分浓度为20％，N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸、N,N'-双丙烯酰 基-L-胱氨酸和2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的摩尔比为100：9：0.6，酰肼化透明质酸 中酰肼基团和四端羰基聚乙二醇中端羰基团的摩尔比为1：0.6。

实施例6

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将3,3'-二硫代二丙酰肼接枝于分子量为300万的透明质酸上，得到取代度 为25％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'-二硫代二丙酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为0.6％的透明质酸溶 液，用1mol/L盐酸将体系pH值调至5，室温搅拌反应42小时，用截留分子量为3500Da的 透析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中， 透明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、3,3'- 二硫代二丙酰肼的摩尔比为100：28：30：500。

2)N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸的制备

将L-鸟氨酸铜络合物溶于水形成质量百分浓度为14％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时； 接着，在1.2小时内滴加含1.6倍于L-鸟氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用 浓度为1mol/L的NaOH溶液维持体系pH在9.2，其中氯仿溶液体积为L-鸟氨酸水溶液体积 的17％；滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入L-鸟氨酸摩尔数1.5 倍的8-羟基喹啉除铜，过滤后水相用其11倍体积的四氢呋喃沉积，收集沉淀物并真空干燥后， 得到N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.4g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸 的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰 氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.18：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应3.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为8％的溶液，用11倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)三端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为400Da的三端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比0.75％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应5.5小时，利用负压去除9/13体积的甲苯后，利用 甲醇和正己烷的混合物沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到三端羰基聚乙二醇。 其中，三端羟基聚乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：1.5。

5)双网络聚(N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为2％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至4.5；将N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光 引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和三端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物 溶液；然后，将该混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：1.8，混合均匀后置 于模具中，实施紫外光照射10分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1350 mJ/cm²、照射距离为5cm，得到双网络聚(N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中， N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸的质量百分浓度为26％，N_δ-丙烯酰基-L-鸟氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L- 胱氨酸和2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的摩尔比为100：15：0.1，酰肼化透明质酸中 酰肼基团和三端羰基聚乙二醇中端羰基团的摩尔比为1：0.4。

实施例7

1)酰肼化透明质酸的制备

利用碳二亚胺法将4,4'-二硫代二丁酰肼接枝于分子量为500万的透明质酸上，得到取代度 为50％的酰肼化透明质酸。具体如下：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐与N-羟基琥珀酰亚胺、4,4'-二硫代二丁酰肼溶于蒸馏水中，制备浓度为2％的透明质酸溶液， 用1mol/L盐酸将体系pH值调至4.8，室温搅拌反应36小时，用截留分子量为3500Da的透 析袋对蒸馏水透析2天后在零下20℃进行冷冻干燥72小时，得到酰肼化透明质酸。其中，透 明质酸重复单元数、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4,4'-二 硫代二丁酰肼的摩尔比为100：55：60：660。

2)N-丙烯酰基-L-缬氨酸的制备

将L-缬氨酸溶于水形成质量百分浓度为5％的溶液，置于冰水浴中搅拌1小时；接着，在 1.8小时内滴加含2倍于L-缬氨酸摩尔数量的丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加过程中用浓度为1 mol/L的NaOH溶液维持体系pH在9.5，其中氯仿溶液体积为L-缬氨酸水溶液体积的15％； 滴加完毕后恢复至室温继续搅拌4小时，随后向反应体系中加入10.5倍体积的沉淀剂甲醇， 收集沉淀物并真空干燥后，得到N-丙烯酰基-L-缬氨酸。

3)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的制备

将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.25g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨 酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯 酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.22：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0， 滴加完成后常温维持反应1.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得 到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为18％的溶液，用7倍体积量的丙酮沉淀，所 得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。

4)六端羰基聚乙二醇的制备

将分子量为1200Da的六端羟基聚乙二醇与乙酰丙酸溶于无水甲苯中，加入反应物质量百 分比0.5％的催化剂对甲苯磺酸，回流反应6.5小时，利用负压去除7/10体积的甲苯后，利用 正己烷沉淀，最后将沉淀物在30℃真空干燥24小时，得到六端羰基聚乙二醇。其中，六端羟 基聚乙二醇上羟基和乙酰丙酸的摩尔比为1：5。

5)双网络聚(N-丙烯酰基-L-缬氨酸)/透明质酸复合水凝胶的制备

将酰肼化透明质酸溶于蒸馏水中制得质量百分浓度为1.5％的溶液，利用浓度为1mol/L的 盐酸将溶液pH值调至4；将N-丙烯酰基-L-缬氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸、水溶性光引 发剂1-羟基环己基苯基丙酮和六端羰基聚乙二醇溶于蒸馏水中，得到混合物溶液；然后，将该 混合物溶液加入酰肼化透明质酸溶液中，二者体积比1：2，混合均匀后置于模具中，实施紫 外光照射0.5分钟，所用紫外光中心波长为365nm、光能量密度为1450mJ/cm²、照射距离为 20cm，得到双网络聚(N-丙烯酰基-L-缬氨酸)/透明质酸复合水凝胶。其中，N-丙烯酰基-L-缬氨 酸的质量百分浓度为10％，N-丙烯酰基-L-缬氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和1-羟基环己基 苯基丙酮的摩尔比为100：2.5：0.8，酰肼化透明质酸中酰肼基团和六端羰基聚乙二醇中端羰 基团的摩尔比为1：0.2。