降甲基齐墩果烷型三萜皂苷及其活性组合物的制备方法和应用

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物黄蜡果皂苷，所述的两个降甲基齐墩果烷型三萜具有如下结构，本发明还包括两个化合物的组合物及其制备方法和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及两个新的降甲基齐墩果烷型三萜 皂苷类化合物黄蜡果皂苷，即： 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Ara  binopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acid α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyra  nosyl ester和3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid 24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside，以及包含这两个新化合物的活 性组合物及其分离、制备和在抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品 和功能食品中的开发与应用。

背景技术

黄腊果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)为木通科野木瓜 属植物，广泛分布在我国南方地区。因其果实形态与猪腰子相似，因 此在当地俗称“猪腰子”。黄腊果整株植物都具有较大的药用价值，广 泛应用于炎症、疼痛等疾病的治疗，其藤茎具有清热利尿、通经活络、 镇痛排脓、通乳等功效；果皮民间用于结石病的治疗；叶子用于治疗 外感风寒，头痛胸闷，吐泻腹胀等症。尽管黄腊果具有极大的药用 价值，但时至今日国内外仍无任何有关其化学成分及药用机理的相关 报道，极大的限制了其应用。我们前期研究中发现，这一植物提取物 具有较好的抗炎、镇痛、保肝和利尿的生物活性。以活性指导分离制 备得到了2个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物黄蜡果皂苷， 即：

Comp.1：3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl -(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-1 2-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl -(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

Comp.2：3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid 24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside及他们的活性组合物。

发明内容

本发明的目的是提供两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化 合物。

Comp.1：3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl -(1→3)-α-L-Arabinopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-1 2-en-28-oic acidα-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl -(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

Comp.2：3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid 24-O-6′-O -acetyl-β-D-glucopyranoside。

本发明还包括两个化合物的制备方法和在抗炎、镇痛、保肝、利 尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。

本发明的另一个目的是提供包含两个新的降甲基齐墩果烷型三 萜皂苷类化合物Comp.1、Comp.2的活性组合物及其制备方法，和在 抗炎、镇痛、保肝、利尿药物、保健品和功能食品中的开发与应用。

本发明所述的两个降甲基齐墩果烷型三萜具有如下结构：

本发明提供的两个新的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷，以及包含这 两个新化合物的活性组合物，是通过以下方法制备得到，

(1)分别取干燥黄蜡果(Stauntonia brachyanthera Hand-Mazz)药 材，包括其根、茎、叶、果实，粉碎后经溶剂提取法，分别采用35％-95％ 的乙醇或甲醇水溶液，优选60％-80％的乙醇或甲醇水溶液，浸泡后 回流提取、浸渍提取、或超声提取2-3次，合并提取液，减压回收至 醇浓度低于5％；

(2)步骤(1)所得粗提物溶于水或悬浮于水，依次用石油醚或 环己烷或正己烷、二氯甲烷或氯仿萃取后，再经乙酸乙酯、正丁醇萃 取，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；或步骤(1)所得粗提物 溶于水或悬浮于水后，经大孔吸附树脂柱，用甲醇/水或乙醇/水梯度 (0：100-100：0)洗脱，得到35％-85％醇洗脱部位，优选40％-70 ％的醇洗脱部位；减压回收溶剂；

(3)上述步骤(2)所得乙酸乙酯或正丁醇层萃取物，或大孔吸 附树脂洗脱流分经硅胶色谱柱色谱法分离，以氯仿甲醇混合溶剂梯度 洗脱得到洗脱流份，洗脱溶剂为20:1-2:1的氯仿或二氯甲烷/甲醇；

(4)上述步骤(3)中所得流分经ODS柱色谱处理，以甲醇/ 水或乙腈/水为流动相洗脱，其比例为1:9-7:3的甲醇/水混合溶剂、或 1:15-4:3的乙腈/水混合溶剂，得到化合物1、2和3。

其中，所述步骤(2)中，提取物溶于水或悬浮于水后，其体积 与生药材的重量比为1:2-2:1；

所述步骤(2)中萃取所用的石油醚的沸程为30-60℃或60-90℃， 萃取溶剂与提取液的体积比为1:2-2:1；萃取次数为2-4次。

所述步骤(2)中大孔吸附树脂可选用非极性树脂(XAD-4，Diaion  HP-20，D101、D102、D401，D1、D2、D3、D4，HPD-100，X-5)、 弱极性树脂(D-201，HPD-300，AB-8)和中等极性树脂(HPD-400， XAD-6、XAD-7、XAD-8)等。

步骤(2)中所得乙酸乙酯或正丁醇萃取物，或大孔吸附树脂 35％-85％醇洗脱物，为含有新化合物Comp.1和Comp.2，即 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-α-L-Ara  binopyranosyl-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)]30-norolean-12-en-28-oic acid α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyra  nosyl ester和3β,20α,24-trihydroxy-29-norolean-12-en-28-oic acid 24-O-6′-O-acetyl-β-D-glucopyranoside的活性组合物。

所述的活性组合物包含所述的降甲基齐墩果烷型三萜皂苷和化 合物3-14中的一种或几种：

上述降甲基齐墩果烷型三萜皂苷或活性组合物，以及药学上可接 受的赋形剂，组成一种药物组合物。

本发明所述的新降甲基齐墩果烷型三萜皂苷类化合物1和2，和 包含这两个成分的活性组合物，以及药物组合物，具有抗炎、镇痛、 保肝、利尿的活性，可用于抗炎、镇痛、保肝、利尿的药物以及保健 品和功能食品中的开发和应用。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制 本发明。

实施例1

黄腊果根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的35％醇80℃下加 热提取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤， 合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度小于5％，加水稀释至4 升，按1:2的比例，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃 取，分别萃取4次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂，得到浸膏，用硅 胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.5克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷 /甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分 别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、 7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(20.1mg)、1(9.2mg)。

实施例2

黄腊果根4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的95％醇室温下温 浸提取三次，(第一次4小时，第二次4小时，第三次3小时)过滤， 合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味后，加水稀释至2升，用 非极性大孔吸附树脂D-101分离，流动相为甲醇/水，依次经水、40％、 85％甲醇洗脱，得到40％醇洗脱物，进一步用硅胶柱色谱分离，按每 克提取物加入1.5克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、 12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。取10:1-2:1的流分用ODS 分离，经1:15、1:10、3:20、1:5、1:4、1:3、2:5、1:1、4:3的乙腈/水 梯度洗脱，依次得到化合物2(5.6mg)、1(4.3mg)。

实施例3

黄腊果茎3kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的60％醇80℃下加 热提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤， 合并滤液，回收溶剂或蒸干至醇浓度小于5％，加水稀释至6升，按 1:1的比例，用环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取2 次，目标化合物主要富集于正丁醇层，合并正丁醇萃取液，回收溶剂， 得到浸膏，用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.5克硅胶拌样装 柱，用二氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、 2:1梯度洗脱。取10:1-2:1的流分用ODS分离，经1:15、1:10、3:20、 1:5、1:4、1:3、2:5、1:1、4:3的乙腈/水梯度洗脱，依次得到化合物2 (20.1mg)、1(11.6mg)。

实施例4

黄腊果茎3kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的80％醇80℃下加 热回流提取三次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时) 过滤，合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至6升， 用非极性大孔吸附树脂HPD-100分离，流动相为乙醇/水，依次经水、 40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用 硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲 烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。 分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、 7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(3.7mg)、1(3.2mg)。

实施例5

黄腊果根3kg，用12倍，10倍和8倍的60％甲醇室温下超声提 取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合 并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至3升，按1:2的 比例，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，目 标化合物主要富集于乙酸乙酯层，合并、回收溶剂，得到浸膏；进一 步用硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二 氯甲烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗 脱。分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、 6:4、7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(25.3mg)、1(17.4mg)。

实施例6

黄腊果茎4kg，用12倍，10倍和8倍的80％甲醇室温下超声提 取三次，(第一次3小时，第二次2小时，第三次2小时)过滤，合 并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩无醇味，加水稀释至2升，经中等极 性树脂XAD-6大孔吸附吸附树脂，流动相为甲醇/水，依次经水、45％、 85％甲醇洗脱，得到85％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱 色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇 系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取 10:1-2:1的流分用ODS分离，经1:15、1:10、3:20、1:5、1:4、1:3、 2:5、1:1、4:3的乙腈/水梯度洗脱，依次得到化合物2(15.3mg)、1 (10.4mg)。

实施例7

黄腊果叶2kg，用12倍，10倍和8倍的75％醇室80℃提取三次， (第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液， 回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至4升，弱极性 大孔吸附树脂AB-8纯化，流动相为乙醇/水，依次经水、40％、80％ 乙醇洗脱，得到80％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用硅胶柱色谱 分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲烷/甲醇系统 20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。分别取10:1-2:1 的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、7:3梯度洗脱， 依次得到化合物2(11.2mg)、1(7.5mg)。

实施例8

黄腊果果实4kg，用12倍，10倍和8倍的70％醇室80℃提取三 次，(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤 液，回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味，加水稀释至4升，按1:1的比 例，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，目标 化合物主要富集于正丁醇层，合并、回收溶剂，得到浸膏；进一步用 硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲 烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。 分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、 7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(11.2mg)、1(9.5mg)。

实施例9

黄腊果根6kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的70％乙醇室80 ℃提取三次(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤， 合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至6 升，经非极性大孔吸附树脂HPD 100以乙醇/水为流动相，依次经水、 40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分，回收溶剂，得到浸膏，用 硅胶柱色谱分离，按每克提取物加入1.0克硅胶拌样装柱，用二氯甲 烷/甲醇系统20:1、15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、3:1、2:1梯度洗脱。 分别取10:1-2:1的流分用ODS分离，甲醇/水1:9、2:8、3:7、5:5、6:4、 7:3梯度洗脱，依次得到化合物2(47.2mg)、1(29.5mg)。

实施例10

黄腊果根6kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的70％乙醇室80 ℃提取三次(第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤， 合并滤液，回收溶剂或蒸干至浓缩至醇浓度低于5％，加水稀释至6 升，经非极性大孔吸附树脂HPD 100以乙醇/水为流动相，依次经水、 40％、70％乙醇洗脱，得到70％醇洗部分的活性组合物。

实施例11

黄腊果茎4kg，用12倍，10倍和8倍的70％醇室80℃提取三次， (第一次4小时，第二次3小时，第三次3小时)过滤，合并滤液， 回收溶剂或蒸干至浓缩至无醇味，加水稀释至4升，按1:1的比例， 用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取3次，富集于正 丁醇层，合并、回收溶剂，得到活性组合物。

化合物1、2的结构鉴定数据如下：

化合物1:白色粉末(CH₃OH)，254nm下无暗斑，365nm下无荧光， 体积分数为10％硫酸-乙醇显紫色，HR-TOF-MS中给出准分子离子峰 [2M+Na+K]²⁺：m/z 1500.6718(calcd.for 1500.5993)，示分子式为 C₆₇H₁₀₆O₃₃。

化合物2：白色针状粉末(CH₃OH)，紫外(254nm)下无暗斑，体 积分数为10％硫酸-乙醇溶液显紫色，HR-ESI-MS中给出准分子离子 峰[M+Na]⁺；m/z:701.3880(calcd 701.3871,C₃₇H₅₈Na₁O₁₁)，示分子式 为C₃₇H₅₈O₁₁。

表1 化合物1和2降甲基三萜母核部分的核磁数据

表2 化合物1糖部分的核磁数据

表3 化合物2糖部分的核磁数据

如下实施例中所涉及的活性组合物为包含化合物1-14的组合物， 即本发明步骤(3)得到的组合物。

实施例12化合物1、2及活性组合物的体外保肝活性

采用MTT法考察药物对大鼠肝干细胞样上皮细胞WB-F344(简 称WB)成活率的影响。分别设正常对照组、D,L-半乳糖胺模型组、 双环醇给药组和受试药物组。

结果：如表4所示。

表4 保肝试验结果

Compared with control**P<0.01Compared with model group*P<0.01

实施例13化合物1、2及活性组合物的镇痛活性

(1)醋酸扭体试验

昆明种小鼠雌雄各半，18-22g，随机分为空白组，给药组，阳性 组，每组10只。分别用1、2和活性组合物生理盐水溶液灌胃7天， 给药量如表5所示。最后一天阳性组和给药组同时给药1小时后，给 小鼠腹腔注射0.7％醋酸0.2ml，过5分钟后，观察并记录各组小鼠在 15分钟内的扭体次数。然后根据下列公式计算小鼠扭体的抑制率。

抑制率＝(样品组平均扭体次数－阳性组平均扭体次数)/样品组 平均扭体次数。

结果：如表5所示。

表5 醋酸扭体试验结果

(2)热板试验

昆明种小鼠雌雄各半，18-22g，随机分为空白组，给药组，每组 10只。分别用1、2和活性组合物生理盐水溶液灌胃7天，给药量如 表6所示。最后一天阳性组和给药组同时给药1小时后，把小鼠放到 热板上，用秒表计时，以引起小鼠舔后足或后足跳跃所需潜伏期作为 痛阈指标(一分钟为极限指标)。潜伏时间延长率＝(阳性组的平均潜 伏时间－样品组平均潜伏时间)/阳性组的平均潜伏时间。

结果：如表6所示。

表6 热板试验结果

实施例14化合物1、2及活性组合物的抗炎活性

(1)对二甲苯诱发小鼠耳肿胀的影响:

昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12 只，分别为空白对照组、给药组和阿司匹林组；化合物给药剂量为 40mg/kg，活性组合物给药剂量为150mg/kg；试验组分别ig给药， 连续7天，第7天给药后1h，于小鼠右耳两面涂二甲苯25μl，左耳 不涂为正常耳，2h后，脱颈椎处死，用直径8mm打孔器打下左耳 和右耳同一部位的圆片，于扭力天平上称重，计算耳肿胀率及抑制率。 结果见表7。

Edema Rate(ER)(％)＝[Right Ear(mg)-Left ear(mg)]/Left Ear(mg)×100％ Inhibitory Rate(IR)(％)＝(ER_control-ER_samples)/ER_control×100％

结果：如表7所示。

表7 小鼠耳肿胀试验结果

*P<0.05，**P<0.01vs control，Duncan test

(2)对小鼠棉球肉芽肿增生的抑制作用

昆明种小鼠60只，18-22g，雌雄各半，随机分为5组，每组12 只，分别为空白对照组、给药组和阿司匹林组；化合物给药剂量为 40mg/kg，活性组合物给药剂量为150mg/kg；试验各组分别ig给药， 连续7天，在给药第一日手术植入10mg灭菌棉球(每个棉球含1000 U青霉素和1000U链霉素)，第8天脱颈椎处死小鼠，剥离肉芽组织， 并于60℃烘箱中烘12h，称重，计算肉芽肿重。

结果：如表8所示。

表8 小鼠棉球肉芽肿试验结果

**P<0.01，***P<0.001vs control，Duncan test

实施例15化合物1、2及活性组合物的利尿活性

取180-200g雄性大鼠，预试，选取经水灌胃(2.5mL/100g)后 2h内排尿量达到灌胃量40％以上的大鼠40只，随机分组，将各组 大鼠分别放入代谢笼中，每笼2只，体重相近。实验前禁食24h，生 理盐水组和各个给药组的灌胃水负荷量均为2.5mL/100g体重。给 药后在代谢笼下放置量筒，连续收集6h尿量，记录尿量体积(mL)。

结果：如表9所示。

表9 利尿作用(n＝10,x±s)结果

**P<0.01。