一种新型α-葡萄糖苷酶活性抑制剂

摘要

本发明公开了一种新型α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，属于功能食品的功能因子和药物领域。本发明的茶色素能强烈抑制α-葡萄糖苷酶活性，醇溶性茶黄素、茶红素和茶褐素的IC50分别为3.94μg/ml、3.24μg/ml、75.43μg/ml，水溶性茶黄素、茶红素和茶褐素的半抑制率IC50分别为8.19μg/ml、4.50μg/ml、6.98μg/ml，无论醇溶性茶色素还是水溶性茶色素，对α-葡萄糖苷酶的抑制效果远远优于常用的降糖药物拜糖平(阿卡波糖IC50＝1.04mg/ml)，可作为食品添加剂或药剂用于糖尿病的治疗。由于茶色素是从茶叶中提取的纯天然色素，安全无毒，降血糖效果更好，这是拜糖平所不可比拟的优势，具有开发成保健品或新型降糖药物的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，属于功能食品的功能因子和药物领域。

背景技术

糖尿病是一种以血糖过高为主要特征的全球性内分泌系统疾病，其中，Ⅱ型糖尿病占到90％以上，降低血糖含量是预防和治疗糖尿病的重要途径。有研究预测，全球糖尿病患者将从2000年的1.71亿增加到2030年的3.66亿，发病率居高不下，而发展中国家糖尿病人数可能会翻倍。国际糖尿病联合会报告指出，全球每年都有5百万人死于糖尿病，到2014年底，用于糖尿病治疗费用已逾5.66千亿，因此，预防和治疗糖尿病的工作刻不容缓。

α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制或非竞争性抑制小肠刷状边缘α-葡萄糖苷酶的活性,延迟多糖、双糖转化为可吸收的葡萄糖，减缓血糖的升高。常见的降糖药——阿卡波糖，米格列醇，伏格列波糖均为化学或半化学合成，虽然有一定的降血糖效果，但临床应用中存在胃胀、腹泻、肝损害等副作用，因此我们需要从自然界中寻找天然副作用少的α-葡萄糖苷酶抑制剂。多项研究报道，茶叶提取物具有防癌抗肿瘤、预防心血管疾病、调节血糖血脂、预防糖尿病等多种药理功能，但研究多集中在茶多酚和蛋白质酪氨酸磷酸酶上。茶色素是从茶叶中的茶多酚经氧化聚合而成的酚性色素，由茶黄素、茶红素和茶褐素组成。

本发明证明茶色素能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，有很好的预防血糖快速升高的效果，如果能作为食品添加剂或控糖药物，将会在糖尿病的防治领域具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，所述抑制剂是红茶茶色素。

所述红茶茶色素包括茶黄素、茶红素和茶褐素。经测定，醇溶性茶黄素、茶红素和茶褐素的IC₅₀分别为3.94μg/ml、3.24μg/ml、75.43μg/ml，水溶性茶黄素、茶红素和茶褐素的IC₅₀分别为8.19μg/ml、4.50μg/ml、6.98μg/ml，无论醇溶性茶色素还是水溶性茶色素，对α-葡萄糖苷酶的抑制效果远远优于阿卡波糖(IC₅₀＝1.04mg/ml)。

在本发明的一种实施方式中，所述红茶茶色素是以江苏宜兴红茶为原料，通过有机溶剂萃取的方式得到的天然产物，经体外实验证明对α-葡萄糖苷酶的活性有强烈抑制，其来源于红茶，毒副作用少，对α-葡萄糖苷酶的抑制效果远远高于目前控制Ⅱ型糖尿病的一线药物拜糖平(阿卡波糖)。

在本发明的一种实施方式中，采取以下步骤获得所述红茶茶色素：

(1)将干燥的红茶茶叶与80％乙醇按1g：20-30mL的比例混合，浸泡24h，过滤，滤液浓缩蒸发乙醇，得到醇提茶色素，醇溶性茶色素提取物用适量的水转溶；滤渣用60℃热水浸提，重复2-3次，合并每次的浸提液，蒸发水分得到浓缩的水提茶色素；

(2)向上述醇提茶色素中加入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保留水相；向上述水提茶色素中分别加入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保留水相；两水相分别独立进行后续提取过程；

(3)向水相中加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次并合并，得到乙酸乙酯相和水相；

(4)向第(3)步中的乙酸乙酯相加入等体积的2.5％的NaHCO₃溶液，以除去部分茶红素，保留有机相，并用截留分子量为100-500Da的透析袋透析除盐，然后蒸发有机溶剂得到茶黄素；

(5)向第(3)步中的水相加入等体积的正丁醇，萃取3次并合并，得到有机相和水相，蒸发有机相中的正丁醇即得到茶红素；

(6)蒸发第(5)步水相中残留的正丁醇即得到茶褐素；

(7)将得到的茶黄素、茶红素和茶褐素样品真空冻干，分别得到干燥的醇溶性和水溶性的茶黄素、茶红素和茶褐素。

在本发明的一种实施方式中，所述红茶茶叶是宜兴红茶。

本发明提供的宜兴红茶中提取的茶黄素、茶红素和茶褐素三种茶色素能强烈抑制α-葡萄糖苷酶活性，且这三种茶色素是从茶叶中提取的天然色素，安全无毒，具有常用的降糖药物拜糖平所不具备的优势。通过抑制肠道中糖类的消化酶α-葡萄糖苷酶活性，红茶色素将成为功能性食品添加剂或药剂，在预防和治疗糖尿病中发挥作用。

附图说明

图1为本发明一种实施方式中提取茶色素的工艺流程图

具体实施方式

茶色素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的测定：

A.测定原理：以无色的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作为反应底物，α-葡萄糖苷酶水解α-1,4-葡萄糖苷键会释放出对硝基苯酚(PNP)，对硝基苯酚(PNP)在碱性条件下显黄色，通过在405nm下测定吸光度的变化间接测定酶活的抑制情况。测定体系如下：在500μL磷酸盐缓冲液体系(pH6.8)中，加入250μLα-葡萄糖苷酶抑制剂和事先溶于缓冲液中500μL 2mmol/L的pNPG，37℃下预热5min，再加α-葡萄糖苷酶250μL，37℃反应30min，然后再加1ml Na₂CO₃终止反应，405nm下测吸光度。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率计算公式：

A_实验组为既加酶也加抑制剂时的吸光度；A_实验空白为加抑制剂不加酶时的吸光度；A_对照组为加酶不加抑制剂时的吸光度；A_对照空白为既不加酶也不加抑制剂时的吸光度(其它用缓冲液补充至相应的体积)。

B.测定方法：各个物质对α-葡萄糖苷酶的抑制能力用半数抑制浓度(IC₅₀)来衡量，当抑制率为50％时，所对应的抑制剂的浓度即为IC₅₀。将冻干后的醇溶性和水溶性茶黄素、茶红素和茶褐素用蒸馏水配成25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml，阳性对照阿卡波糖用蒸馏水配成浓度为5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的浓度梯度，按上述测定体系测定每个稀释浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并计算IC₅₀。

实施例1茶色素的提取

干燥的宜兴红茶茶叶：体积浓度为80％的乙醇＝1:20-30(g：mL)，浸泡24h，过滤，滤液浓缩蒸发乙醇后用水转溶，得到醇提茶色素；滤渣用60℃热水浸提2h，重复2-3次，合并每次的浸提液，蒸发水分得到浓缩的水提茶色素。向醇提茶色素和水提茶色素中分别加入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保留各自的水相，分别用于后续提取步骤。

向水相中加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次并合并乙酸乙酯相，得到乙酸乙酯相和水相。

对上一步得到的乙酸乙酯相，向乙酸乙酯相加入等体积的2.5％的NaHCO₃溶液，保留有机相，用截留分子量为100-500kDa的透析袋透析除盐，并蒸发有机溶剂得到茶黄素样品。对上一步得到的水相，向水相中加入等体积的正丁醇，萃取3次并合并，得到有机相和水相，蒸发有机相中的正丁醇即得到茶红素样品。蒸发水相中残留的正丁醇即得到茶褐素样品。

将得到的茶黄素、茶红素和茶褐素样品真空冻干，分别得到干燥的从第一步醇提茶色素中提取得到的醇溶性茶黄素、茶红素和茶褐素，以及从第一步水提茶色素中提取得到的水溶性茶黄素、茶红素和茶褐素。

实施例2

将冻干后的醇溶性和水溶性茶黄素用蒸馏水配成25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml，测定每个稀释浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并计算IC₅₀。经测定，醇溶性茶黄素和水溶性茶黄素的IC₅₀分别为3.94μg/ml和8.19μg/ml，醇溶性茶黄素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果比水溶性茶黄素更好。

实施例3

将冻干后的醇溶性和水溶性茶红素用蒸馏水配成25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml，测定每个稀释浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并计算IC₅₀。经测定，醇溶性茶红素和水溶性茶红素的IC₅₀分别为3.24μg/ml和4.50μg/ml，醇溶性茶红素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果比水溶性茶红素略好。

实施例4

将冻干后的醇溶性和水溶性茶褐素用蒸馏水配成25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，测定每个稀释浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并计算IC₅₀。经测定，醇溶性茶褐素和水溶性茶褐素的IC₅₀分别为75.43μg/ml和6.98μg/ml，水溶性茶褐素对α-葡萄糖苷酶的抑制效果远远优于醇溶性茶褐素。

实施例5

阳性对照拜糖平(阿卡波糖)用蒸馏水配成浓度为5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml的浓度梯度，测定每个稀释浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制能力，并计算IC₅₀。经测定，阿卡波糖的IC₅₀为1.04mg/ml。

体外实验结果表明无论醇溶性茶色素还是水溶性茶色素，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力远远优于常用降糖药物拜糖平(阿卡波糖)，因此茶色素作为食疗或药物中的功能因子在糖尿病预防和治疗中具有很大的潜力。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。