用作体外试验中异常凝血对照血浆的组合物

摘要

用作体外试验中的异常凝血对照血浆的组合物。本发明涉及血液的临床分析的领域，并且特别涉及待被用作止血试验、凝血试验和纤维蛋白溶解试验中的异常凝血对照的包括人血浆、缓冲等渗溶液和阿魏酸的组合物。本发明还涉及阿魏酸在制备止血试验中的异常对照血浆中的用途。

说明书

本发明涉及血液的临床分析的领域，并且特别涉及待被用作止血试 验、凝血试验和纤维蛋白溶解试验中的异常凝血对照的包括人血浆、缓冲 等渗溶液和阿魏酸的组合物。本发明还涉及阿魏酸在制备止血试验中的异 常对照血浆中的用途。

止血是防止具有血管系统的动物在受伤之后血流不止的机制群。止血 机制具有多种重要功能：(a)当血液流过血管系统时保持血液为流体状态， (b)在伤口部位处或存在失血的任何地方通过形成凝块止血，以及(c)确保一 旦伤口愈合就移除凝块。通常，止血涉及五种要素，即：血管、血小板(细 胞成分)、凝血因子、凝血抑制剂和纤维蛋白溶解系统。因此，止血涉及一 组必须以完美平衡相互作用的力—促凝血力和抗凝血力。此平衡由多种蛋 白质控制，所述蛋白质的某些被称为凝血因子。其为非常微秒的平衡，其 中任何不平衡可导致血栓前状态(prothrombitic state)或血液疾患(blood  disorder)。

精确测量凝血功能是非常重要的，因为存在的任何损伤可为威胁生命 的。这在经受凝血治疗的血栓栓塞状况的患者中变得特别重要。

止血实验室的作用是检测和辨认血液学疾病和血栓形成疾病中的生 理变化。为了这么做，使用各种试验，比如原发性止血试验、凝血度量试 验(coagulometric assay)和免疫学试验，其允许获得有用的信息，以便帮助 保健专业医生做出精确诊断并且为此设计合适治疗。

止血试验可分成两个有区别的组：初步止血评估，其可包括凝血酶原 时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、纤维蛋白原浓度的确定和凝血 酶时间(TT)；以及另一组，其可包括特定试验，比如蛇毒凝血酶时间 (reptilase time,RT)、活化凝血时间(ACT)和抗凝血酶的浓度的确定(AT)、蛋 白质C、蛋白质S、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、纤维蛋白溶 酶原和α2-抗纤维蛋白溶酶(纤维蛋白溶酶血浆酶抑制剂)。

在止血实验室中，患者样品在整个工作日被分析用于各种各样的止血 筛查和特定试验。在这些试验中，影响止血试验的效率和功效的变量的方 法对照对正确诊断是必不可少的。对照血浆的使用在由实验室进行的这些 内部质量控制中起重要作用。

高度推荐在固定的时间间隔使用正常凝血时间范围中的一个对照和 异常范围中的另一个对照，以确保止血实验室中使用的试剂和装置的适当 运行。已经公布关于对照材料应以何种频率被测试用于某些凝血试验的推 荐。例如，临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards  Institute,CLSI)已经公布关于PT和aPTT试验的指导方针。所述文件推荐， 如果样品以连续的方式处理，正如在许多实验室中的情况一样，则至少每 8小时或更频繁地测试对照材料的至少两种水平。来自CLSI的此文件还指 示应该在试剂的改变或新试剂的包含之后或者在显著的器械改变之后进 行的第一次试验中使用对照样品。对照允许评估采用的血凝仪系统中的凝 血试验和使用的试剂两者的分析精确度与偏差。

已经公布关于凝血对照血浆的制备的文献，并且这些血浆的某些当前 可商购。然而，描述的方法的大多数耗时并且包括用于吸附关键血浆蛋白 质因子以获得异常凝血特性的昂贵的步骤。用于制备异常凝血对照血浆的 一种方法包括用氢氧化铝培育正常血浆，并且然后使所述血浆离心。沉淀 物包含各种凝血因子，并且所得上清液可用作病理学对照血浆。异常凝固 时间通过从血浆移除凝血因子来实现。然而，由此获得的凝血对照血浆不 是完全满意的，因为在某些试验中获得异常结果，而在其他试验例如因子 VIII、XI和XII中，以及在其他止血试验比如TT和RT中，活性在正常范 围内。

用于产生异常凝血对照的另一方法是稀释正常血浆。所述方法在国际 指南(NCCLS H30-A2)中描述，所述国际指南提到如何制备异常对照血浆， 以用于根据Clauss方法确定纤维蛋白原。所述文件还描述了一系列正常血 浆如何可被巴比妥缓冲液稀释以获得具有异常结果(低纤维蛋白原含量)的 血浆。稀释一系列正常血浆的最终结果在大多数止血试验中是异常的。然 而，所述凝血对照血浆对例如TT和RT不是异常的。通过用其他溶液比如 4％白蛋白溶液稀释正常血浆获得了相同的结果。

本发明公开克服所有上述缺点的异常凝血对照血浆。本发明的异常对 照血浆确保导致包括TT和RT的大量的止血试验中的异常范围和特定凝血 因子的活性的确定两者。本发明人已经惊人地发现，通过添加等渗溶液中 的阿魏酸到正常血浆，可能获得可在大多数止血试验中有效使用的异常对 照血浆。

不连接到任何特别理论，可能的是，阿魏酸的此特性借助于其特有的 抗凝血特性来获得。然而，物质具有抗凝血特性的事实不意味着其适合于 产生异常血浆。例如，华法林(warfarin)是在用于治疗处于血栓形成危险中 的患者的保健医学中最广泛使用的抗凝血剂之一，并且其已经被用作药物 持续多于50年。然而，此化合物不适合于添加至血浆并且产生异常凝血 对照，因为其作用机制基于抑制取决于维生素K的凝血因子的合成。作为 抗凝血剂，华法林需要完整的体外系统。

其他抗凝血剂化合物比如肝素或乙二胺四乙酸(EDTA)实际上可被添 加至正常血浆并且在止血试验中产生异常时间。然而，本发明人还未以抗 凝血剂肝素或EDTA获得类似的结果。这些抗凝血剂都不适合于产生异常 血浆，因为其对止血试验具有不一致的效果。换句话说，用于在一个试验 中获得异常时间的最佳浓度对另一试验是不充足的或过多的。例如，肝素 延长aPTT试验，但不影响PT试验或在较小程度上影响PT试验。此外， 肝素不延长RT试验，或更确切地说是对RT不产生异常血浆。EDTA具有 类似情况，EDTA在一定浓度下可延长RT试验，但不影响PT、aPTT和 TT试验的结果或者非常轻微地影响PT、aPTT和TT试验的结果。

因此，本发明公开包括阿魏酸、缓冲等渗溶液和人血浆的组合物，所 述组合物用作止血试验中的异常凝血对照血浆。

在本发明的组合物中，术语“人血浆”指的是红细胞、白细胞和血小 板已经自其移除的血液的液体部分。此外，用于本发明的组合物中的人血 浆是在各个试验中具有正常凝血时间并且从而能够在凝血试验中用作正 常对照的人血浆。所述血浆可通过本领域已知的任何方法比如通过血浆除 去法(plasmapheresis)获得。

本发明的组合物用于止血试验中的异常凝血对照的另外的优点是，所 述组合物可冷冻或冻干并且在解冻或重构时保持稳定。

为获得用于止血试验中的异常凝血对照的组合物，优选的是使用包含 来自两个或更多个健康人供体的血浆的正常血浆库。所述血浆库可通过在 合适的容器中和缓混合来制备。正常血浆在本发明的组合物中的浓度在从 15％v/v至75％v/v的范围中。

存在于用于止血试验中的异常凝血对照的本发明的组合物中的缓冲 等渗溶液的主要作用是使pH维持在生理pH周围，即在6.5和8.5之间， 但还允许血浆被稀释，以便当与阿魏酸组合时获得异常凝血时间。本发明 的等渗溶液可为本领域已知的任何等渗溶液。优选地，本发明的等渗溶液 是使pH维持在6.5和8.5之间的生理pH值周围的缓冲液(例如，Tris、 HEPES、MOPS或CHAPS)。等渗溶液在本发明的组合物中的量在从40％ v/v至70％v/v的范围中。

另一方面，阿魏酸在本发明的组合物中的量在从大约0.01％w/v至大 约1％w/v的范围中。

此外，用于止血试验中的异常凝血对照的本发明的组合物可任选地包 括凝血因子稳定剂。凝血因子稳定剂可给所述组合物提供另外的稳定性。 所述凝血因子稳定剂优选地为甘氨酸，更优选地，所述甘氨酸以从大约 0.1％w/v至大约4％w/v的量存在于本发明的用于止血试验中的异常凝血 对照的组合物中。

用于止血试验中的异常凝血对照的本发明的组合物还可任选地包括 蛋白质稳定剂或蛋白质添加剂和/或增量剂(bulking agent)以及防腐剂。所述 稳定剂的主要功能是在蛋白质已经被冻干时保持蛋白质的功能。所述稳定 剂可为本领域技术人员已知的任何稳定剂。

最后，本发明公开了阿魏酸在制备止血试验中的异常凝血对照中的用 途。

以下参考不限制本发明的说明性的实施例和附图将更加详细描述本 发明，在附图中：

图1示出了在PT止血试验中阿魏酸相对于对照样品的效果。

图2示出了在PT止血试验中肝素相对于对照样品的效果。

图3示出了在PT止血试验中EDTA相对于对照样品的效果。

图4示出了在aPTT止血试验中阿魏酸相对于对照样品的效果。

图5示出了在aPTT止血试验中肝素相对于对照样品的效果。

图6示出了在aPTT止血试验中EDTA相对于对照样品的效果。

图7示出了在TT止血试验中阿魏酸相对于对照样品的效果。

图8示出了在TT止血试验中肝素相对于对照样品的效果。

图9示出了在TT止血试验中EDTA相对于对照样品的效果。

图10示出了在RT止血试验中阿魏酸相对于对照样品的效果。

图11示出了在RT止血试验中肝素相对于对照样品的效果。

图12示出了在RT止血试验中EDTA相对于对照样品的效果。

实施例

实施例1.用于止血试验的异常血浆对照组合物的制备

为评估不同抗凝血剂在各种止血试验中的效果，制备不同血浆组合 物。用法由加柠檬酸盐于正常人血浆(16mM的柠檬酸盐)、存储在低于 -70℃的温度下以及在37℃的浴器中解冻组成。然后添加HEPES，直到40 mM的最终浓度，并且pH使用NaOH 1N调节到在7.4和7.6之间。制备 各种血浆组合物。不添加抗凝血剂到第一组合物，其用作对照。渐增浓度 的被分析的抗凝血剂添加至其他组合物：阿魏酸(0.5％、1％和1.5％)、肝素 (0.1IU/mL、0.5IU/mL和1IU/mL)和EDTA(0.5mg/mL、1mg/mL、1.5 mg/mL)。每种血浆组合物在Q止血分析仪(Diagnostic Grifols,Spain)中使用 Diagnostic Grifols的试剂DG-PT、合成的DG-APTT、人的DG-TT L和 GD-Fibroclotin被分析用于上述PT、aPTT、TT和RT试验。

实施例2.包括抗凝血剂的组合物在PT试验中的效果

图1-3示出了使用各种抗凝血剂在PT试验中获得的结果，并且绘制 了在PT试验中获得的时间作为存在于血浆中的抗凝血剂的浓度的函数。 对照(不具有抗凝血剂的血浆)通过三角形示出，并且包括阿魏酸、肝素和 EDTA的组合物通过正方形示出。可看到阿魏酸(图1)和EDTA(图3)产生 PT活性百分比的减少，所述减少与存在于血浆中的抗凝血剂的量成正比。 相比之下，肝素(图2)没有引起任何不同于不具有抗凝血剂的血浆的PT 活性的结果。这意味着在测试的浓度下，肝素对PT试验不具有效果。另 一方面，添加至正常血浆的阿魏酸和EDTA确实产生PT活性百分比的减 少。

实施例3.包括抗凝血剂的组合物在aPTT试验中的效果

在aPTT试验中测试实施例1中制备的相同的血浆(图4-6)。在此试验 中，添加至血浆的所有抗凝血剂即阿魏酸(图4)、肝素(图5)和EDTA(图6) 延长PT试验。此外，试验的结果的延长与存在于血浆中的抗凝血剂的量 成正比。

实施例4.包括抗凝血剂的组合物在TT试验中的效果

在TT试验中测试实施例1中制备的相同的血浆。图7-9示出了当测 试制备的血浆时获得的TT结果。在分析的三种抗凝血剂当中，EDTA(图 9)不延长试验的结果，即不产生异常TT。相比之下，肝素(图8)和阿魏酸(图 7)两者均确实产生异常TT。

实施例5.包括抗凝血剂的组合物在RT试验中的效果

在RT试验中测试实施例1中制备的相同的血浆。参照RT试验的结果 (图10-12)，在添加到正常血浆库之后不产生异常结果的仅有的抗凝血剂是 肝素(图11)。肝素在测试的任何浓度下不延长RT。包含抗凝血剂阿魏酸(图 10)和EDTA(图12)的血浆确实产生异常RT结果。

根据实施例和前述附图中示出的结果，在阿魏酸被添加至正常血浆之 后的所有止血试验中，阿魏酸的抗凝血能力及其引起异常结果的能力是清 楚的。此外，阿魏酸以平衡的方式延长各试验，从而使其适合于产生异常 对照血浆。

尽管已经关于优选的实施方案描述了本发明，但这些不应认为是本发 明的限制，本发明将通过以下权利要求书较宽泛的解释来定义。