一种建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的方法

摘要

本发明涉及一种建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的方法，所述方法包括以下步骤：1)动物：1.3拷贝高复制HBV转基因小鼠；2)试剂：白酒；3)肝癌癌前病变小鼠模型的制备：HBV转基因小鼠每天给予白酒，连续灌胃16-30周，期间小鼠自由进食、饮水；4)肝癌癌前病变模型小鼠后期处理：灌胃结束后，分别称重，取小鼠处死，取肝组织,称肝重，计算肝脏指数，并进行病理切片观察。本发明的优点在于：本发明动物模型制作简单，费用低，易重复；22周乙醇诱导的HBV转基因型小鼠模型组可于镜下见到肝细胞不典型增生有大细胞性和小细胞性改变，符合肝癌癌前病变模型判断标准，显示推断造模成功。

说明书

发明领域

本发明涉及动物模型领域，具体的说，是一种建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变 小鼠模型的方法。

背景技术

肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏 的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为 肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性 肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性 肿瘤的肝转移。

全球大约有3.5亿人是乙肝病毒(HBV)的慢性携带者，中国更是HBV感染高发区，约7 亿人感染过HBV，流行病学研究已经证实HBV感染与肝细胞癌(HCC)的发展之间存在着密切 相关性。国际卫生组织(WHO)指出：“酒精毒性对肝脏的影响最大，对病毒性肝炎、肝癌等 的发生、发展及预后都有重要影响”。如果酗酒的同时又并发肝炎病毒感染，其肝癌发生率可 高达50％以上。我们应该认识到至少25％的乙醇性肝病患者同时并发HBV感染及演变为肝癌 的高危性。因此，针对HBV感染同时饮酒的肝癌高危人群,建立的乙醇性HBV转基因小鼠肝癌 癌前病变模型，为肝癌癌前病变动物模型的建立探索新的方法，为深入研究肝癌发生发展的 分子生物学机制奠定基础。

目前应用最广泛的主要都是采用诱发性肝癌癌前病变模型，其中最常用的大多数都是化 学、生物致癌因素作用于实验动物如：2-乙酰氨基芴(2-AAF)；二乙基亚硝胺(DEN)；黄曲 霉毒素B1(AFB1)；二甲基氨基偶氮苯(DAB)；四氯化碳(CCL4)等。但是还没有一种公认的 针对酗酒的同时并发肝炎病毒感染诱发的肝癌模型用于实验研究，如何选择和研究更为理想 的肝癌癌前病变模型则是关键所在。

发明内容

本发明的目是提供一种建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种建立乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变小鼠模型的方法，包括以下步骤：

1)动物：1.3拷贝高复制HBV转基因小鼠；

2)试剂：白酒；

3)肝癌癌前病变小鼠模型的制备：HBV转基因小鼠每天给予白酒，连续灌胃16-30周，期 间小鼠自由进食、饮水；

4)肝癌癌前病变模型小鼠后期处理：灌胃结束后，分别称重，取小鼠处死，取肝组织, 称肝重，计算肝脏指数，并进行病理切片观察。

所述步骤1)中，1.3拷贝高复制HBV转基因小鼠为6-8周龄，体重23±2g，雄性。

所述步骤3)中，HBV转基因小鼠灌胃白酒前，先适应性饲养一周以上。

所述步骤3)中，白酒酒精度为53％vol，剂量为10ml·kg^-1，次数为每天一次。

所述步骤3)中，小鼠在灌胃白酒的过程中，需5天称一次体重，并根据体重变化调整 灌胃剂量。

所述步骤3)中，小鼠灌胃白酒的时间为22周。

所述步骤4)中的具体操作方法为：灌胃结束后，分别称重，将小鼠摘除眼球取血，颈 椎脱臼处死小鼠,处死后的小鼠立即取出肝脏，盐水冲洗后，吸干水分称重，计算小鼠肝脏指 数,然后放入已准备好的4％多聚甲醛固定液瓶中固定、脱水、包埋、切片、HE染色，在400 倍光镜下观察肝组织病理情况。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明动物模型制作简单，费用低，易重复；

2、本发明22周乙醇诱导的HBV转基因型小鼠模型组可于镜下见到肝细胞不典型增生有大 细胞性和小细胞性改变，符合肝癌癌前病变模型判断标准，显示推断造模成功。

附图说明

图1肝组织病理切片HE染色结果×400，22周酒精模型组。

图2肝组织病理切片HE染色结果×400，22周空白对照组。

图3肝组织病理切片HE染色结果×400，16周酒精模型组。

图4肝组织病理切片HE染色结果×400，16周空白对照组。

具体实施方式

下面结合附图1-4对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

1.材料

1.1动物1.3拷贝高复制HBV转基因小鼠，雄性，6-8周龄，体重23±2g，32只，购自 中国人民解放军第四五八医院全军肝病中心，动物合格证号：SCXK(军)2012-0018。

1.2试剂酒精度为53％vol红星二锅头白酒，产自(北京红星股份有限公司)，产品标 准号：GB/T10781.2；4％多聚甲醛(Biotoopped公司)。

1.3仪器TB-215D型电子天平(美国丹佛公司)；YB-6LF型生物组织石蜡包埋机(湖南 亚光公司)；RM2235型组织切片机(德国LEICA公司)；YT-7F型摊烤片机(湖南亚光公司)； BX51型显微镜(日本OLYMPUS公司)。

2.方法

2.1肝癌癌前病变小鼠模型的制备32只HBV转基因小鼠适应性饲养一周后，随机分为16 周对照组，16周模型组，22周对照组和22周模型组，每组8只。模型组给予酒精度53％vol红星 二锅头白酒剂量为10ml·kg^-1灌胃，每天一次，对照组小鼠给予等体积蒸馏水灌胃，每天一次。 小鼠自由进食、饮水，每5天称一次体重，根据体重变化调整灌胃剂量，小鼠分别于第16、22 周末取相应组小鼠处死，取肝组织行病理切片，观察肝脏病理变化。

2.2小鼠一般情况观察实验过程中观察小鼠的活动情况、精神状态、皮毛光泽度、食欲 等。

2.3小鼠肝重和肝脏指数的影响于造模第16、22周末各组分别称重后，摘除眼球取血， 颈椎脱臼处死小鼠，处死后立即取小鼠肝脏，盐水冲洗后，吸干水分称重，计算小鼠肝脏指 数,肝脏指数＝肝脏重量/小鼠体重(g)×100。

2.4肝组织形态学影响于造模第16、22周末取相应小鼠的肝组织，盐水冲洗吸干水分 后放入已准备好的4％多聚甲醛固定液瓶中固定、脱水、包埋、切片、HE染色，在400倍光镜 下观察肝组织病理情况。

2.5评价标准根据文献制定：①显微镜下可见肝细胞不典型增生(小细胞性改变和/或 大细胞性改变)；②肉眼可见肝组织出现结节性或局灶性改变。出现①和/或②即可判定为肝 癌癌前病变。

2.6统计学分析采用SPSS18.0软件包统计分析，数据以表示，组间比较采用t检 验。P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。

3.结果

3.1小鼠一般状况对照组小鼠灌胃后，精神、呼吸、运动均正常，毛发光泽，对刺激反 应灵敏，进食饮水正常并随体重增加略有增加。模型组小鼠灌胃初期小鼠灌胃后出现精神萎 靡、呼吸急促、活动减少、对刺激反应减弱、嗜睡、进食饮水减少等情况，从实验开始第4 周起，模型组小鼠灌胃后精神萎靡、呼吸急促、嗜睡现象开始减轻，小鼠体重略有增加，同 时发现模型组小鼠打斗比对照组多，从第12周起开始出现有胃肠胀气死亡小鼠，同时观察发 现模型组小鼠毛发比空白对照组小鼠毛发稀疏。模型组小鼠从第14出现眼睛异常明显现象。

3.2小鼠肝重和肝脏指数的影响与16周对照组相比较，16周模型组肝重和肝脏指数明 显增加，有统计学意义(P<0.05)；与22周对照组相比较，22周模型组肝重和肝脏指数明显 增加，有统计学意义(P<0.05)；与16周模型组相比较，22周模型组肝重和肝脏指数明显增 加，有统计学意义(P<0.05)。提示乙醇、HBV双因素刺激可加重肝损伤，损伤程度与时间长 短成正比。见表1。

表1 16周与22周肝重和肝脏指数比较情况(n＝6)

注：与对照组相比较，△P<0.05；与16周模型组相比较，**P<0.05。

3.2肝组织形态学HE染色400倍光镜下观察对照组小鼠肝小叶结构存在，肝细胞索排列 基本整齐，肝细胞水肿明显，细胞大小一致，有轻微的脂肪变性和汇管区、但管周可见少量 的炎细胞(见附图4；附图2)。16周模型组小鼠部分区域肝细胞层次1-2层增加，肝索排列紊 乱，肝细胞水肿明显，肝细胞不典型增生有大细胞性改变，细胞具有异型性，肝细胞的核和 细胞都增大，核/浆比一般保持正常，核多异型性，常见核深染和多核，可见肝细胞点状坏死， 并有部分区域见炎性细胞浸润(见附图3)。22周模型组：部分区域肝细胞层次1-3层增加，肝 索排列紊乱,肝细胞不典型增生有小细胞性改变，细胞具有异型性，肝细胞的细胞体积减小， 核/浆比增大，轻度核多形性和核深染,并可见小片状坏死及大量炎细胞浸润(见附图1)。

4.讨论

本实验结果表明，与对照组相比较，模型组肝重和肝重指数明显增加(P<0.05)；与16 周模型组相比较，22周模型组肝重和肝脏指数明显增加(P<0.05)。肝脏的重量变化可以客 观的反应肝脏病变的情况，在酒精性肝损伤时，肝细胞会发生肿大，胞质变性，肝细胞微管 受损伤，从而导致分泌功能障碍，分泌性蛋白潴留，肝细胞呈气球样变，严重时肝脂质代谢 紊乱，肝细胞内脂肪堆积，肝细胞呈脂肪变性，均可致肝脏肿大，体积增大，重量增加。通 过对肝组织病理结果分析发现，对照组HBV转基因小鼠已经具有明显的脂肪变性及炎细胞的 浸润。国内学者通过酒精对BALB/c小鼠进行16周造模同样观察到了肝损伤的情况，但是肝 癌癌前病变情况不明显。

本实验用乙醇、HBV双因素加大诱导力度，并在16周的基础上增加22周这个时间点来 观察小鼠肝脏损伤的病理改变。通过病理结果可以看出，16周模型组已经出现肝细胞层次增 加，肝索排列紊乱，偶见有大细胞出现，细胞具有异型性，肝细胞的核和细胞增大，核/浆比 一般保持正常，核多异型性，常见核深染和多核，可见肝细胞点状坏死，并有部分区域见炎 性细胞浸润；22周模型组部分区域肝细胞层次具有1-3层增加，肝细胞不典型增生有小细胞 出现，肝细胞的细胞体积减小，核/浆比增大，轻度核多形性和核深染,并可见小片状坏死及 大量炎细胞浸润。值得注意的是，22周模型组已经出现了小细胞性的改变。

有研究表明，在慢性乙型肝炎中的大细胞变显示为一个肿瘤相关的病变，认为大细胞变 至少提示发生了倾向于肝癌发病的慢性损伤,而小细胞不典型增生比大细胞不典型增生更可 能是一种癌前病变。小细胞变的生长速度快于正常肝细胞，与肝癌的发生关系密切，属于癌 前病变，而病灶内小细胞性改变主要存在于HBV、HCV慢性感染或酗酒所致的HCC高危慢性肝 病中。本实验22周乙醇诱导的HBV转基因型小鼠模型组可于镜下见到肝细胞不典型增生有 大细胞性和小细胞性改变，符合肝癌癌前病变模型判断标准,由此可以推断造模成功。综上， 可以得出显微镜下肝细胞不典型增生(小细胞性改变和/或大细胞性改变)更符合癌前病变的 前瞻性，更有利于肝癌的防治。

本发明的动物模型制作简单，成本低廉，易重复；22周乙醇诱导的HBV转基因型小鼠模 型组可于镜下见到肝细胞不典型增生有大细胞性和小细胞性改变，符合肝癌癌前病变模型判 断标准，显示推断造模成功。故针对乙醇、HBV双因素所致肝癌癌前病变的预防和治疗的研 究都有积极的意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在 不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明 的保护范围。