一种利用人参病原菌诱导子提高反应器培养西洋参不定根中皂苷含量的方法

摘要

本发明为一种利用人参病原菌诱导子提高反应器培养西洋参不定根中皂苷含量的方法。当西洋参不定根在反应器培养至30d、生物量达到最大时，加入4mg/L的黑斑病诱导子处理西洋参不定根，在处理第8d时不定根中皂苷含量最高，为27.4mg/g，相应的皂苷产量也最高，为273.7mg/L。本发明可以有效提高不定根中皂苷含量，结合组织培养的手段，可在短期内获得大量人参皂苷含量较高的西洋参不定根以作为西洋参的替代药材，这就为名贵中草药西洋参的资源利用与保护提供一种方便而有效的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，为一种利用人参病原菌诱导子提高西洋参不定根中皂苷含量的方法。 

背景技术

西洋参(Panax quinquefolium L.)又称美国人参、西洋人参、洋参、花旗参、广东人参。原产于美国东部和加拿大，是五加科人参属的多年生草本植物，以根入药。西洋参具有滋补、强心、造血、健胃、镇静、降血脂、抗癌和抗衰老等多种医疗作用。现代化学及药理学研究表明，西洋参主要有效成分是皂苷。与人参相比，其性较温和，且总皂苷含量及人参皂苷Rb1的含量高于人参，因此被列为名贵中药材。由于西洋参医疗和保健用途很大，需求量逐年增加，造成供不应求，价格昂贵的局面。与人参类似，西洋参由于其自身的生理特性，生长缓慢，一般需4～6年才能收获入药，且种子资源稀少。因此利用组织培养的方法生产大量的西洋参替代药材便受到广泛关注，这其中包括西洋参细胞培养、毛状根培养及不定根培养等方面。而不定根培养的优势则在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培养中细胞的高度分化使得次生代谢产物的合成能力明显提高，同时表现出明显的代谢稳定性和活力稳定性，加之与生物反应器的结合利用，使得西洋参不定根的大量生产得到了有效的保证，进而为西洋参野生资源的保护和资源开发提供了可行的方法。然而西洋参不定根本身的皂苷含量并不高，仅能达到1％左右，因此生产皂苷含量高且稳定的西洋参不定根显得尤为重要，而利用诱导子提高皂苷含量及其生产量则是有效的途径。 

诱导子包括生物诱导子和非生物诱导子两大类，生物诱导子中的真菌诱导子则存在着来源广泛、无需人为合成、经简单处理便可直接使用等诸多优点，较非生物诱导子价格低廉，适用性更广。本发明用两种参区最流行并且危害最严重的人参病原真菌(人参黑斑病菌和人参锈腐病菌)提取物作为诱导子处理反应器培养的西洋参不定根，发现这两种真菌对西洋参不定根中皂苷含量的提高均具有较大的促进作用，这对于西洋参资源的开发利用有重要意义。 

本发明利用气球型气升式生物反应器培养西洋参不定根，当不定根生物量达到最大时加入人参黑斑病菌与人参锈腐病菌提取物作为诱导子继续培养，8d后测定其皂苷含量，发现这两种诱导子促进皂苷的合成，使其含量显著提高。该方法通过不定根培养可在短时间内获得大量西洋参皂苷，不定根可作为栽培或野生西洋参的替代药材，这对于西洋参的资源利用与开发保护具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用人参病原菌诱导子提高反应器培养西洋参不定根中皂苷含量的方法。以西洋参不定根为材料，用人参黑斑病菌与锈腐病菌提取物对反应器培养的不定根进行处理，通过对处理时间及加入量的调控，制定提高西洋参中皂苷含量的具体方案，为名贵中草药西洋参资源的保护和开发利用提供一种新方法。 

本发明采用了以下技术方案： 

一种利用人参病原菌诱导子提高反应器培养西洋参不定根中皂苷含量的方法。 

①真菌培养及真菌诱导子的制备 

本发明所选用的人参病原真菌为人参黑斑病菌(Alternaria panax)及人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans) 。 

将人参黑斑病菌及人参锈腐病菌分别接种在含有马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(马铃薯200g/L+葡萄糖50g/L+琼脂20g/L)的培养皿中，25℃下培养。20～25d后刮取菌丝并接种到不含琼脂的PDA培养基中进行液体振荡培养。15～20d后将真菌菌丝体取出并洗净，然后干燥、磨碎，利用超声波提取器提取真菌多糖，将真菌多糖提取液高压灭菌后储于4℃下作为诱导子备用。 

②西洋参不定根的培养及真菌诱导子处理 

将鲜重为20g的西洋参不定根接种于5L气球型气升式生物反应器中进行增殖培养，在温度为25℃条件下暗培养。当反应器培养至30d，不定根生长量达到最大时加入两种真菌诱导子。 

③西洋参不定根中皂苷含量测定 

将诱导子处理的西洋参不定根从反应器中取出烘干并磨成粉末后，用高效液相色谱(HPLC)测定皂苷含量并计算皂苷生产量。 

本发明整体考察了人参病原菌培养、诱导子制备以及诱导子对西洋参不定根的处理方式，在此基础上优化并筛选出了合理的诱导子处理时间及处理浓度，形成了一套完整而完善的增加西洋参不定根中皂苷含量及皂苷产量的方法途径。本发明可提高西洋参不定根的皂苷生产量，利用HPLC进行检测更加精密准确，适用性更广。 

附图说明

图1黑斑病菌诱导子处理后西洋参不定根中9种皂苷含量

图2锈腐病菌诱导子处理后西洋参不定根中9种皂苷含量

图3真菌诱导子处理后西洋参不定根中总皂苷含量

图4真菌诱导子处理后西洋参不定根中总皂苷生产量

具体实施方式

(一)材料与方法 

①真菌培养 

将人参黑斑病菌及人参锈腐病菌分别接种含PDA培养基的培养皿中，25℃下培养。20～25d后刮取菌丝并接种在PDA液体培养基中进行液体振荡培养，培养周期为15～20d。 

②真菌诱导子的制备及多糖浓度的测定 

将上述人参黑斑病菌及人参锈腐病菌菌丝体在液体振荡培养15～20d后从培养瓶中取出用蒸馏水洗净后，在40℃下烘干。将干燥的菌丝体磨碎，加入10倍体积的蒸馏水，45℃下超声提取30min，过滤后将滤渣再次以同样方法提取，共三次，合并滤液。再将过滤的两种真菌提取液在5000r/min的条件下离心15min，取上清液定容至500mL，并分别将两种提取液在压力为1.3MPa，温度为121℃条件下高压灭菌15min。精密量取灭菌后的两种真菌提取液50mL，以sevage试剂除蛋白后加入适量95％乙醇并静置12h以沉淀多糖，12h后抽滤并分别用无 水乙醇、丙酮、乙醚对滤渣清洗三次。收集滤渣于40℃下烘干即得真菌多糖干品。将1mg真菌多糖干品溶解于10mL蒸馏水中，然后用苯酚-硫酸法通过葡萄糖含量的测定计算出换算因子f,f＝多糖的重量(mg)/多糖液的葡萄糖浓度(mg/L)×多糖的稀释倍数。结果人参黑斑病菌f为1.05，人参锈腐病菌f为2.96。分别精密吸取1mL两种真菌提取液在490nm处测定吸收度，同时精密吸取1mL葡萄糖标准溶液(含葡萄糖0.05mg)，同样以苯酚-硫酸法测得吸光值，按下式计算样品中多糖浓度：多糖浓度(mg/L)＝Cf×1000。式中C：真菌提取液中葡萄糖浓度(mg/mL)，f：换算因子。 

③西洋参不定根的培养 

将鲜重为20g的西洋参不定根接种于5L气球型气升式生物反应器中，培养基为3/4MS+白糖50g/L+IBA5mg/L，反应器通气量为400mL/min。在温度为25℃条件下暗培养。 

④真菌诱导子处理天数的筛选 

当反应器培养至30d时不定根生长量达到最大(350～400g鲜重)，此时每个反应器中加入5mL真菌诱导子，在处理第2、4、6、8和10d时将不定根分别从反应器取出，用自来水冲洗2～3次，再将各处理的不定根分别装入标记好的纱布袋中，利用脱水机(700r/min，HQB52-8521，杭州松下家用电器有限公司，中国)甩干其表面水分，称鲜物重。之后放入40℃干燥箱(YHW1103，天津市华北实验仪器有限公司，中国)中烘干，2d后称干物重，同时测定皂苷含量。 

⑤真菌诱导子浓度的筛选 

根据④的结果，真菌诱导子处理时间确定为8d。将人参黑斑病诱导子的浓度设定为3、4、5、和6mg/L，人参锈腐病诱导子的浓度设定为15、20、25及30mg/L(以多糖浓度计算)，以未加入诱导子为对照。在反应器内不定根培养至30d时加入不同浓度的诱导子，8天后将不定根从反应器取出，测鲜物重、干物重及皂苷含量，方法同④。 

⑥皂苷含量测定方法 

精密称取西洋参不定根干燥粉末(过100钼筛)1g，加入25mL的80％甲醇在80℃下浸提2次，每次2h。过滤后合并的滤液在50℃下减压浓缩至5mL左右膏状物，在膏状物中加入双重蒸馏水并定容为25mL。定容后的样品中加入25mL乙醚脱脂两次，得到的下层溶液利用25mL水饱和正丁醇萃取三次并合并萃取后的正丁醇提取液，提取液在60℃下减压旋干，得到的干物质用甲醇定容至5mL，然后用0.45μm的有机滤器进行过滤，过滤后即得待测样品。待测样品利用配有C18色谱柱(250×4.6mm，5μm，Theromo scientific，美国)的高效液相色谱(LC-15C，岛津公司，日本)，在紫外可见检测器(SPD-15C，岛津公司，日本)203nm波长处进行检测。进样量为20μL，流动相为乙腈与水，流速为1.0mL/min，柱 温为30℃。人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Re、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3和Rh2均由成都曼斯特生物科技有限公司购买。总皂苷含量为单体皂苷之和，皂苷生产量(mg/L)＝不定根干重(g/L)×皂苷含量(mg/gDW)。 

测定人参皂苷含量的流动相洗脱条件如下表： 

梯度洗脱程序 

(二)结果与分析 

通过对不定根鲜物重和干物重的测定，并利用HPLC对西洋参不定根中的9种单体皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3和Rh2)的含量进行分析，得到如下结果： 

①真菌诱导子处理天数的筛选 

利用人参黑斑病菌及锈腐病菌诱导子处理反应器培养的西洋参不定根，在处理2、4、6、8、10d后将不定根从反应器取出称鲜物重与干物重，并用HPLC测定皂苷含量，结果发现：用黑斑病诱导子处理2～10d中不定根鲜物重和干物重变化不大，分别由未处理的384.5g和146.7g降低到335.6g和41.6g；而利用锈腐病诱导子处理的过程中，不定根的鲜物重和干物重变化较大，分别降低为243.1g和23.2g。但皂苷含量均是在用两种真菌诱导子处理后的第8天达到最大值，分别为黑斑病菌：21.7mg/g DW，锈腐病菌：21.9mg/g DW，皂苷生产量分别达到225.7mg/L和170.7mg/L；而未进行诱导子处理的不定根中皂苷含量及生产量仅为8.6mg/gDW和100.4mg/L。 

②诱导子浓度的筛选 

将人参黑斑病诱导子的浓度设定为3、4、5和6mg/L，锈腐病诱导子的浓度设定为15、20、25及30mg/L，在不定根反应器培养30d后处理8d，然后将不定根从反应器中取出，测其鲜物重、干物重及皂苷含量。结果发现真菌诱导子处理西洋参不定根后，不定根中各单体皂苷含量均有增加，但增加幅度不一。利用4mg/L的黑斑病诱导子处理西洋参不定根后，不定根中Rb1的含量由未处理的2.26mg/g提高到8.71mg/g，Rb2的含量提高到4.89mg/g(未处理为1.71 mg/g)，Rg3和Rh2也由未处理的0.28mg/g和0.32mg/g增加到1.34mg/g和1.75mg/g。而利用20mg/L的人参锈腐病诱导子处理西洋参不定根，不定根中单体皂苷Rf含量(3.43mg/g)为未处理的10倍，Rb2和Rd的含量也由未处理的1.71mg/g和1.63mg/g提高到6.41mg/g和7.23mg/g，Rg3和Rh2的含量分别增加为1.94mg/g与5.78mg/g。 

但是我们同时发现，这两种真菌诱导子中黑斑病诱导子对不定根的鲜物重和干物重影响并不大，而锈腐病诱导子则有较大影响，且不同浓度诱导子对皂苷的积累有不同程度的效果。黑斑病诱导子处理浓度为4mg/L时皂苷含量最高(27.4mg/g DW)，4L的反应器培养出的西洋参不定根干重为40.0g，此时的皂苷生产量也最大(273.7mg/L)；而锈腐病诱导子浓度为20mg/L时，皂苷含量虽显著高于其他浓度处理，达到35.6mg/g DW，然而由于较强的抑制生长作用，在处理8d后，4L的反应器培养出的西洋参不定根干重仅为26.5g，皂苷生产量仅达到235.9mg/L。可见两种真菌诱导子中黑斑病诱导子的效果好于锈腐病诱导子。 

因此，在西洋参不定根生产中，可在不定根生物量达到最大时加入4mg/L(以多糖浓度计算)的人参黑斑病诱导子进行处理以达到提高皂苷产量的目的。