对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法

摘要

本发明提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明还提供一种使用这样的核酸使产量增大的转基因植物和使植物的产量增大的方法。可通过将下述构建体导入植物来对该植物赋予高产性，所述构件体通过使结构基因长雄野生稻的假应答调节因子的启动子、和/或植物的假应答调节因子可操作地连接而成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对植物赋予高产性的核酸、特别是含有源自稻野生种长 雄野生稻的假应答调节因子的启动子和/或假应答调节因子的编码区域的核 酸。并且，本发明涉及一种使用上述核酸使产量增加的转基因植物的制备方 法及使植物的产量增大的方法。

背景技术

1.有关使植物的数量性状增加的基因的研究

为了培育农业上有益的新品种，进行了使植物彼此杂交而筛选后代的杂 交育种法或诱发植物突变的突变育种法等。另外，近年来，还培育有导入有 用基因并表达其功能的基因重组植物。为了培育这样的新品种，有效的方法 是聚集赋予了优异性质的基因，但在期望进一步提高作物的生产率的情况下， 可利用的基因仍然较少，特别希望对控制高产性状等数量性状的基因进行确 定。

近年来，随着分子生物学方法的发展，可使用DNA标记物进行数量性状 的基因分析。并且，还在积极地进行利用遗传图谱，并利用分子生物学方法 来进行克隆农业上有用基因的研究。在构建有遗传图谱的生物中，进行有通 过显示特定的表达型的性状和标记物的连锁分析、以及随后的染色体步移等 而尝试确定控制其性状的基因的物理位置并进行分离基因(图谱克隆法)。但 是，通常只能粗略确定含有控制数量性状的基因的部位，只能理论上确定含 有大量基因的DNA片段。而且，作为可进行克隆大小的片段或者可通过转化 导入植物大小的片段，不容易确定。另外，制备详细的基因图谱、以图谱信 息为基础对要得到的基因进行确定并对基因进行克隆的作业需要长时间和大 量工作量。实际上，虽然有若干通过图谱克隆法对使数量性状增大的基因进 行克隆的例子(非专利文献1：Ashikari et.al.2005、非专利文献2：Miura et.al. 2010)，但其数量仍然非常有限。

已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻(O.longistaminata)虽然与作为栽培 种的栽培稻(O.sativa L.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的 生物质。本发明人培育在稻栽培品种“Shiokari”中导入长雄野生稻的长花药的 过程中，显示生长旺盛性的BC7F6系统“No.645”。然后，成功地利用图谱克 隆将赋予生长旺盛性的区域缩小至第7染色体最末端部约180kb。然后，对该 区域的约82kb进行碱基序列确定，对以其为基础制备的转化体进行调查，但 无法得到显示生长旺盛性的转化体(非专利文献3)。

2.植物的钟相关基因

关于植物的钟相关基因，在使用拟南芥(Arabidopsis:拟南芥属)的研究中， 发现CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1(CCA1)、LATE ELONGATED  HYPOCOTYL(LHY)、TIMING OF CAB EXPRESSION1(TOC1)这样的3个基 因。而且，已明确：构成植物的昼夜节律时钟的基础的机制是这些基因表达 的反馈环路。其中，TOC1基因作为假应答调节因子(Pseudo response regulator: PRR)之一而熟知。以下，将假应答调节因子记为PRR。作为拟南芥中所确定 的PRR基因，目前包含TOC1(PRR1)在内已知有PRR3、PRR5、PRR7、PRR9 这5个。并且，发现按照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1(TOC1)的顺序， 通过表达量上升/衰减而引起昼夜交替现象(非专利文献4：Matsushika et.al. 2000)。

然后，在单子叶植物的稻中，确定了5种与双子叶植物的拟南芥的PRR 基因对应的直系同源物，明确这些直系同源物与拟南芥同样地显示昼夜节律。 并且，这些稻的直系同源物、即OsPRR1、OsPRR37、OsPRR59、OsPRR73、 OsPRR95分别定位于稻的基因组上的第1染色体、第7染色体、第11染色体、 第3染色体、第9染色体(非专利文献5:Murakami et.al.2003)。另外，有向拟 南芥的PRR7基因突变株导入以拟南芥PRR7的启动子对稻OsPRR37cDNA 的表达进行控制的构建体而显示功能互补的报告(非专利文献6：Murakami  et.al.2006)。

另外，在粳稻品种“日本晴”和籼稻“卡萨拉斯(kasalath)”之间，对OsPRR 基因的表达谱进行比较，结果非常相似，表明在粳稻和籼稻之间非常保守(非 专利文献7：Murakami M et.al.2005)。

可是，关于PRR基因，报告有：通过将组成型启动子连接于该基因，植 物的产量增加。具体而言，已知有向稻导入将稻中组成型表达的启动子(GOS2 启动子)连接于源自番茄的PRR2结构基因而成的构建体，结果稻的产量增加 的实例(专利文献1)，或者向稻导入将组成型启动子(RICE ACTIN启动子)连 接于源自拟南芥的PRR5基因而成的构建体，结果稻的茎数增加且高度伸长 的实例(专利文献2)。但是，迄今为止不存在着眼于PRR的启动子的例子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开2011/0145949

专利文献2：WO2011/049243

非专利文献

非专利文献1：Ashikari M.,Sakakibara H.,Lin S.,Yamamoto T.,Takashi T., Nishimura A.,Angeles ER.,Qian Q.,Kitano H.,and Matsuoka M.(2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production Science 309:741-745

非专利文献2：Miura K.,Ikeda M.,Matsubara A.,Song X.J.,Ito M.,Asano  K.,Matsuoka M.,Kitano H.and Ashikari M.(2010)OsSPL14promotes panicle  branching and higher grain productivity in rice Nature Genetics 42:545-549

非专利文献3：前川雅彦、小森俊之“稻野生种长雄野生稻染色体部分导 入系统中的生长旺盛性所涉及的原因基因分离和功能(イネ野生種オリザ·ロ ンギスタミナータ染色体部分導入系統における生育旺盛性に係わる原因遺 伝子単離と機能解析，QT2002)40-43”研究成果第473集“利用基因组育种的 有效的品种育成技术的开发-QTL基因分析的推进-(ゲノム育種による効率 的品種育成技術の開発―QTL遺伝子解析の推進―)”平成21年2月20日发 行编辑发行农林水产省农林水产技术会议事务局

非专利文献4：Matsushika A.,Makino S.,Kojima M.and Mizuno T.(2000) Circadian Waves of Expression of the APRR1/TOC1 Family of Pseudo-Response  Regulators in Arabidopsis thaliana:Insight into the Plant Circadian Clock Plant  Cell Physiol.41:1002-1012

非专利文献5：Murakami M.,Ashikari M.,Miura K.,Yamashino T.and  Mizuno T.(2003)The Evolutionarily Conserved OsPRR Quintet:Rice  Pseudo-Response Regulators Implicated in Circadian Rhythm Plant Cell Physiol. 44:1229-1236

非专利文献6：MURAKAMI,M.,Y.TAGO,et al.(2007)."Characterization  of the Rice Circadian Clock-Associated Pseudo-Response Regulators in  Arabidopsis thaliana.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry 71(4): 1107-1110.

非专利文献7：Murakami M.,Matsushika A.,Ashikari M.,Yamashino T.and  Mizuno T.(2005)Circadian-associated rice pseudo-response  regulators(OsPRRs):Insight into the control of flowering time Biosci. Biotechnol.Biochem.69:410-414

非专利文献8：Harushima,Y.,Yano,M.,Shomura,A.,Sato,M.,Shimano,T., Kuboki,Y.,Yamamoto,T.,Lin,S.Y.,Antonio,B.A.,Parco,A.,Kajiya,H.,Huang, N.,Yamamoto,K.,Nagamura,Y.,Kurata,N.,Khush,G.S.,and Sasaki,T.(1998)A  high-density rice genetic linkage map with 2275markers using a single F₂population.Genetics,148,479-494.

非专利文献9：Hiei et al(1994)Efficient transformation of rice(Oryza Sativa  L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of boundaries of the T-DNA  Plant J.6:271-282.

非专利文献10：Komari et al(1996)Vectors carrying two separate T-DNAs  for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and  segregation of transformants free from selection markers.Plant J.10,165–174.

非专利文献11：Ditta et al(1980)Broad host range DNA cloning system for  gram-negative bacteria:construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  77:7347-7351.

非专利文献12：Ishida et al.(2007)Agrobacterium-mediated transformation  of maize.Nature Protocols 2:1614-1621.

非特专利文献13：Ogiso et al.(2010)The role of casein kinase Ⅱ in  flowering time regulation has diversified during evolution.Plant Physiology. 152:808-820

发明内容

发明所要解决的问题

如上所述，需要开发一种使植物的数量性状增加的方案。因此，本发明 要解决的问题在于，提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明提 供一种使用这样的核酸使产量增大的转基因植物及使植物的产量增大的方 法。

用于解决课题的技术方案

本发明人等利用图谱克隆对位于长雄野生稻的第7染色体最末端部的赋 予生长旺盛性的区域进行研究，缩小至第7染色体最末端部约180kb。确定了 该区域的82kb的碱基序列，5处存在1kbp以上的较大的缺失，在末端侧还存 在约3kbp的插入。因此，虽然缩小至约180kb，但由于该差异，难以进行进 一步缩小。

本发明人等也考虑“日本晴”的全长cDNA的位置，对该82kb区域设计 并制制备了7个构建体并进行了研究。其结果，明确了：位于约82kb区域的 PRR7基因同源物是赋予高产性的原因基因。并且，本发明人等发现，令人吃 惊的是，长雄野生稻的高产性不仅由基因区域赋予，长雄野生稻的启动子区 域贡献较大。

基于以上见解，本发明提供一种含有长雄野生稻中假应答调节因子基因 的启动子的碱基序列的核酸及该启动子与假应答调节因子的结构基因可操作 地连接而成的核酸。这样的核酸可对植物赋予高产性。

本发明优选通过以下记载的方案来进行，但并不限定于此。

[方案1]

一种核酸，其含有：

(1)序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或

(2)与序列号1的34845-35044所示的碱基序列具有至少90％的同一性， 且显示促进植物基因转录的活性的碱基序列。

[方案2]

(1)序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或

(2)与序列号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90％的同一性， 且显示促进植物基因转录的活性的碱基序列。

[方案3]

一种核酸，其含有：

(1)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或

(2)与序列号1的26779-35044所示的碱基序列具有至少80％的同一性， 且显示促进植物基因转录的活性的碱基序列。

[方案4]

一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。

[方案5]

根据方案4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序 列构成的核酸的片段。

[方案6]

根据方案4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱 基序列构成的核酸的片段。

[方案7]

一种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成：

(1)方案1～6中任一项所述的核酸，以及

(2)编码(a)～(c)规定的蛋白质的核酸，其中，

(a)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80％ 的同一性的氨基酸序列；

(b)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与 其具有至少90％的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质 中CCT基序的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列；且

(c)具有抑制LHY(Late Elongated Hypocotyl)基因及CCA1(Circadian  Clock-Associated 1)基因的转录的活性。

[方案8]

根据方案7所述的核酸，其能够增大植物的产量。

[方案9]

一种载体，其含有方案1～8中任一项所述的核酸。

[方案10]

一种转基因植物，其含有方案7或8所述的核酸。

[方案11]

根据方案10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。

[方案12]

根据方案11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。

[方案13]

一种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将方案7或8所述的 核酸或方案9的载体导入植物的工序。

[方案14]

根据方案13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。

[方案15]

根据方案14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。

[方案16]

一种使植物的产量增大的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸导入 植物。

[方案17]

一种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1 的26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中 的15～2000个碱基。

[方案18]

一种方法，其包括：对植物中方案17所述的DNA标记物进行检测，并 在检测出该DNA标记物时将该植物判断为高产性。

[方案19]

一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所示碱基序列、 或与序列号1的34845-35044所示碱基序列具有至少90％的同一性的碱基序 列的核酸来提高植物基因的转录活性。

[方案20]

一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、 或与序列号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90％的同一性的碱基 序列的核酸来提高植物基因的转录活性。

[方案21]

一种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述(1)及(2) 的核酸导入植物，其中，

(1)包含下述(a)或(b)规定的碱基序列的核酸：

(a)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部 分构成且显示促进植物基因转录的活性的片段；或

(b)与上述(a)所示的碱基序列具有至少90％的同一性且显示促进植物基因 转录的活性的碱基序列；

(2)编码下述(c)～(e)规定的蛋白质的核酸：

(c)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80％ 的同一性的氨基酸序列；

(d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与 其具有至少90％的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质 中CCT基序的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列；且

(e)具有抑制LHY(Late Elongated Hypocotyl)基因及CCA1(Circadian  Clock-Associated 1)基因的转录的活性。

[方案22]

一种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。

[方案23]

一种蛋白质，其具有序列号3所示氨基酸序列。

[方案24]

一种核酸，其由下述(1)及(2)的核酸可操作地连接而成，其中，

(1)包含下述(a)或(b)规定的碱基序列的核酸：

(a)序列号19所示碱基序列；或

(b)与序列号19所示的碱基序列具有至少80％的同一性且显示促进植物 基因转录的活性的碱基序列，

(2)对由下述(c)～(e)规定的蛋白质进行编码的核酸：

(c)序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少 80％的同一性的氨基酸序列；

(d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与 其具有至少90％的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质 中CCT基序的氨基酸序列或与其具有至少90％的同一性的氨基酸序列；且

(e)具有抑制LHY(Late Elongated Hypocotyl)基因及CCA1(Circadian  Clock-Associated 1)基因的转录的活性。

发明的效果

通过将发明的可操作地连接本启动子和PRR7的结构基因而成的构建体 导入植物，可对植物赋予高产性。

附图说明

图1为表示稻野生种长雄野生稻的染色体部分导入系统“No.645”的基因 型的图。图1中涂抹的区域为源自长雄野生稻的染色体部分。

图2为表示在第7染色体末端部发生重组且最末端以“No.645”型或 “Shiokari”型固定的7个个体的基因型的图。

图3为生长旺盛性基因周边的物理谱图。4个Fosmid克隆和实施例2中 制备的7个构建体(Fr1至Fr7)的关系示于该图。

图4为表示将Fr4片段导入稻品种“Shiokari”中形成的转化体(Fr4-4)的穗 的照片。图4的左面表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，右面表示具有Fr4 片段的基因持有个体。

图5为表示导入了以泛素启动子控制的含有源自长雄野生稻的PRR基因 的编码区域的构建体的转化体的穗(左)、和导入了仅含有对照的选择标记物基 因的构建体的转化体的穗(右)的图。左面由于未成熟，因此稻皮是绿色的，右 面由于已成熟，因此，稻皮发黄。另外，左面还可见大幅开颖的未闭颖的颖 花(箭头)。

图6为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟 南芥来源的PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的序列对比的图。假 受体结构域(红括号)和CCT基序(蓝括号)参考Takata et al.,(2010)BMC  Evolutionary Biology 10:126。

图7为表示利用分离的日本晴来源、长雄野生稻来源、高粱来源、及拟 南芥来源的PRR7基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一性(identity)％和 相似性(similarity)％的值的图。使用基因分析软件Genetyx(注册商标)网络版 ver.11.0.4(株式会社Genetyx)以默认设定(将Unit size to compare设定为2)实行 Protein vs Protein Global Homology，由此求出同一性(identity)％和相似性 (similarity)％。

图8为将制备(1)含有源自长雄野生稻的PRR基因的构建体和(2)含有源自 日本晴的PRR基因的构建体的策略图解的图。

图9中，图9A表示源自长雄野生稻的PRR基因的PCR产物被HpyCH4V 切断。图9B表示使用将“日本晴”、长雄野生稻的PRR基因通过杂交导入了 “Shiokari”的取代系统“No.240”及使用“日本晴”和“No.240”的F1并利用PCR 分析PRR基因的表达而得到的结果。

图10表示导入了源自长雄野生稻的Fr4片段的玉米转化体的T1系统 No.4的穗的照片。图10的上列表示不具有Fr4片段的基因缺失个体，图10 的下列表示具有Fr4片段的基因持有个体。

图11表示导入了含有长雄野生稻的PRR启动子和长雄野生稻的PRR基 因的构建体的玉米转化体T1系统No.11的穗的照片。图11的R表示潮霉素 抗性的基因缺陷个体，S表示潮霉素敏感性的基因保持个体。

图12表示评价长雄野生稻的PRR启动子对GUS基因的转录活性带来的 效果的实验中使用的GUS基因表达载体的结构的图。

图13为以长雄野生稻的PRR启动子区域的200碱基(P200)或2000碱基 (P2000)的核酸和GUS基因编码区域的连接构建体进行了转化的稻中，对GUS 基因的转录活性促进进行了评价的、RT-PCR分析的照片。G表示基因组DNA， -表示没有逆转录反应，+表示有逆转录反应，P表示质粒DNA。

图14为表示光周期开始后0小时和6小时长雄野生稻的PRR基因的相 对表达量的图。

具体实施方式

以下，对本发明的构成具体地进行说明。

(1)源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子

本发明人等如下述实施例所示从长雄野生稻的Fosmid文库中选择位于有 关高产性的(长雄野生稻的)第7染色体末端部的4个Fosmid克隆(Fos1、Fos2、 Fos10、Fos12)，通过引物步移解码该编码的碱基序列。将得到的碱基序列示 于序列号1。

使用上述4个Fosmid克隆制备了7个互补性试验用构建体，将利用SmaI 及PstI对Fos10进行处理而得到的最大的片段与利用PstI及SacI对Fos1进行 处理而得到的第4大的片段连接而成的片段为片段(Fr)4。Fr4为与高产性有关 的基因组片段，含有序列号1的第26779位的碱基至第49155位的碱基。

源自作为稻野生种的长雄野生稻的PRR7基因的启动子(以下，称为“本发 明的启动子”)为含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列的核酸，优选为 含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为含有序 列号1的26779-35044所示的碱基序列的核酸。

在本申请说明书中，“启动子”是指：具有对相邻下游存在的任意植物的 结构基因的转录进行活化的功能的核酸。本申请说明书中的“启动子”是以广 义的含义进行解释的启动子，并不限定于转录因子结合并具有引导正确的转 录开始作用的核心启动子区域等狭义的含义。本发明的启动子并不仅限于 PRR基因的编码区域，具有促进各种植物的任意结构基因的转录活性的作用。 即，本发明含有在植物的任意结构基因上可操作地连接了本发明的启动子的 核酸。该核酸优选不是天然来源的基因组片段。

另外，本申请说明书中促进结构基因的转录活性的作用包含通过光等刺 激诱导而促进结构基因的转录活性，由此调节或控制该活性的实施方式。在 此，启动子通过光的刺激而被诱导，从而促进结构基因的转录活性是指：在 光存在的光周期，启动子促进结构基因的转录活性，但在其以外的时期启动 子不会促进结构基因的转录活性。

本发明的启动子为含有序列号1的34845-35044所示的碱基序列的核酸， 优选为含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列的核酸，进一步优选为 含有序列号1的26779-35044所示的碱基序列的核酸。另外，本发明的启动 子并不限定于这些核酸，还包含与这些核酸具有一定以上序列同一性的核酸 及这些核酸的片段，下面对其进行叙述。

通过将该启动子与PRR7基因可操作地连接并导入植物，可对植物赋予 高产性。即，本发明的启动子优选在与编码具有序列号3所示氨基酸序列的 蛋白质的核酸可操作地连接时能够增大植物的产量。

本申请说明书中的PRR7蛋白质的定义记载在下述(2)“本发明的启动子和 PRR的结构基因可操作地连接的核酸”中。

在本申请说明书中，“高产性”是指植物的总重量、地上部分重量、产量、 茎径、茎数、秆长、叶面积、叶数、穗数、一穗粒数、穗长、总穗重、或种 子产量等中的一部分或多种增大，优选是指总穗重和/或种子产量增大，更优 选是指成熟种子产量增加。在稻、玉米等谷物中，成熟种子产量为非常重要 的性状。作为增大的指标，例如可通过与对照植物(亲本植物、非转化体等) 比较而进行评价。另外，在本申请说明书中，“高产性”和“生长旺盛性”表示相 同的含义。

在序列号1中，与26779-35044对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的 启动子区域，与35825-46721对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的编码区 域，与46722-49157对应的序列为长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域。上 述启动子区域中，序列号1的34845-35044所示的碱基序列与转录起始点的 上游区域200个碱基对应，序列号1的33045-35044所示的碱基序列与转录 起始点的上游区域2000个碱基对应。

本发明的启动子的碱基序列并不限定于序列号1的34845-35044所示的 序列、序列号1的33045-35044所示的序列、或者序列号1的26779-35044所 示的序列，还包含含有与这些碱基序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、 99％、或者99.5％的同一性，且显示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基 序列的核酸。

在其它方面，本发明的启动子为源自长雄野生稻的碱基序列，含有至少 由序列号1的34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活 性的核酸。在这样的核酸中，优选含有由序列号1的33045-35044所示的碱 基序列构成的核酸的片段，进一步含有由序列号1的26779-35044所示的碱 基序列构成的核酸的片段。在此，核酸的片段是指通过序列号1的上述特定 的碱基编号规定范围的碱基序列的一部分的核酸。虽然没有限定，但具体而 言包含由序列号1的26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上 游区域6000个碱基对应的序列、与5000个碱基对应的序列、与4000个碱基 对应的序列、与3000个碱基对应的序列、与2000个碱基或者1000个碱基对 应的序列等。

2个核酸序列的同一性％可通过视觉检查和数学计算确定，或更优选该比 较通过使用计算机程序对序列信息进行比较来进行。代表的优选计算机程序 为遗传学计算机小组(GCG；麦迪逊，威斯康星州)的威斯康星.软件包10.0程 序“GAP”(the Genetics Computer Program(GCG；Madison,Wis.)Wisconsin  Package Version 10.0 Program,GAP)(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.， 12：387)。通过使用该“GAP”程序，除了对2个核酸序列进行比较之外，还可 以进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列和氨基酸序列之间的比较。在此， “GAP”程序的优选默认参数可以使用：(1)对核苷酸的(包括对于同一物为1， 对于非同一物为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG运行、和如khwartz和 Dayhoff修订“多肽的序列和结构图谱(Atlasof Polypeptide Sequence and  Structure)”国立生物医学研究财团，353-358页，1979年所记载的Gribskov 和Burgess，Nucl.Acids Res.，14卷：6745页，1986年的加权氨基酸比较矩 阵；或其它可比较的比较矩阵；(2)对氨基酸各缺口的30个罚分和对各空位中 的各记号追加的1个罚分；或对核苷酸序列的各缺口的50个罚分和对各空位 中的各记号追加的3个罚分；(3)对末端缺口无罚分；及(4)对长缺口无最大罚 分。在本领域技术人员所使用的其它序列比较程序中，可以使用例如可以通 过美国国立医学图书馆的网站：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html使用的BLASTN程序、版本 2.2.7、或UW-BLAST2.0算法。对UW-BLAST2.0的标准默认常数的设定在 以下互联网网址：http://blaSt.wustl.edu记载。并且，BLAST算法使用带有 BL0SUM62氨基酸评分的矩阵，可以使用的选择参数如下所述：(A)包括用于 掩码下述片段的滤波器：具有低组成复杂性的查询序列的片段(根据Wootton 和及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993年)进行确定；也 可参考Wootton及Federhen，1996年“序列数据库中的组分偏移区域的分析 (Analysis of compositionally biased regions in sequence datebases)"Methods  Enzymo 1.，266卷：544-571页。)、或含有短周期性的内部重复构成的片段(根 据Claverie和States(Computers and Chemistry,1993)的XNU程序进行确定)； 及(B)用于报告对碱基序列的匹配的统计学显著性的阈值，或E-评分(按照 (Karlin和AltSchul，1990年)的统计学模型，单纯通过偶然发现的匹配的期待 确率；当起因于某个匹配的统计学显著差异比E-评分阈值大时，不报告该匹 配)，优选E-评分阈值的数值为0.5，或按照优选程度递增的顺序为0.25、0.1、 0.05、0.01、0.001、0.0001、le-5、le-10、le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、 le-50、le-75、或Ie-100。

本发明的启动子的突变体也可以为含有在严谨条件下与序列号1的 34845-35044所示的碱基序列、优选序列号1的33045-35044所示的碱基序列、 进一步优选序列号1的26779-35044所示的碱基序列的互补链杂交的碱基序 列而成的核酸，即具有启动子活性的核酸。

在此，“严谨条件下”是指在中度或高度的严谨条件下进行杂交。具体而 言，关于中度严谨条件，基于例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人 员能够容易地确定。基本条件如Sambrook等，分子克隆：实验室指南 (Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第3版，第6章，冷泉港实验室出版 社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2001中所示，例如包括下述条件的使 用：5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预清洗溶液、约42℃下的约50％ 的甲酰胺、2×SSC～6×SSC优选5×SSC～6×SSC、0.5％SDS(或约42℃下的约50％ 甲酰胺中的、Stark’s溶液等其它同样的杂交溶液)的杂交条件，及例如在约 50℃-68℃、0.1×SSC～6×SSC、0.1％SDS的清洗条件。优选中度严谨条件包括 约50℃、6×SSC、0.5％SDS(及清洗条件)。

关于高度严谨条件，基于例如DNA长度，本领域技术人员也能够容易地 确定。通常，这样的条件包括比中度严谨条件更高温度和/或更低盐浓度的杂 交(例如含有0.5％左右的SDS、约65℃，6×SSC～0.2×SSC，优选6×SSC、更优 选2×SSC、更优选0.2×SSC或者0.1×SSC的杂交)和/或清洗，例如可定义为如上 所述的杂交条件及伴随约65℃～68℃、0.2×SSC～0.1×SSC、0.1％SDS的清洗。 关于杂交及清洗的缓冲液，可以使用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH ₂PO ₄以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl及15mM柠檬酸 钠)，在杂交结束后15分钟～1小时左右进行清洗。

另外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体而言， 可以举出：使用ECL direct labeling&detection system(Amersham株式会社制 造)进行的杂交等。作为严谨的杂交，例如可以举出：向试剂盒的杂交缓冲液 中加入5％(w/v)的封闭试剂，使NaCl达到0.5M，在42℃进行4小时杂交， 清洗在0.4％SDS、0.5×SSC中以55℃清洗两次，每次20分钟，在2×SSC中， 室温条件下，清洗一次5分钟。

(2)本发明的启动子和PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸

本发明为含有本发明的启动子与编码植物的PRR7蛋白质的碱基序列的 核酸(即PRR7结构基因)可操作地连接而成的核酸。在此所谓的本发明的启动 子为在上述(1)源自“长雄野生稻的PRR7基因的启动子”项中记载的启动子。 通过将本发明的启动子与PRR7的结构基因可操作地连接而成的上述核酸导 入植物，可对植物赋予高产性。在下述实施例中，实际上显示通过导入由序 列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的本发明的启动子与PRR7的结构 基因可操作地连接而成的核酸，植物变为高产性。适宜选择由序列号1的 26779-35044得到的更短的序列、即与转录起始点的上游区域6000个碱基对 应的序列、与5000个碱基对应的序列、与4000个碱基对应的序列、与3000 个碱基对应的序列、与2000个碱基或者1000个碱基对应的序列等作为启动 子，而使用其对植物赋予高产性为可由本领域技术人员基于本申请说明书中 所公开的见解容易地进行的事项。即，本领域从业人员基于本申请说明书的 记载，使这样的序列与编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质的核酸可 操作地连接，并对导入其的植物的产量进行确认，由此可容易地选择。如上 所述可对植物赋予高产性的核酸优选为使本发明的启动子和PRR7的结构基 因结合而成的核酸，本发明的启动子具有下述活性：通过利用光等刺激诱导 而促进结构基因转录的活性，由此对该活性进行调节或控制。

本申请说明书中“可操作地连接”是指：本发明的启动子的核酸与PRR7 的结构基因的核酸以使启动子能够发挥促进结构基因的转录活性这样的启动 子活性的功能的方式进行结合。

本申请说明书中“PRR7蛋白质”是指满足以下条件的蛋白质。

(a)具有序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列的蛋白质

本说明书中的PRR7蛋白质为具有序列号3所示氨基酸序列或序列号5 所示氨基酸序列的蛋白质。源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示 的740个氨基酸构成，由序列号2所示的碱基序列的核酸进行编码。源自日 本晴的PRR7蛋白质由序列表的序列号5所示的742个氨基酸构成，由序列 号4所示的碱基序列的核酸进行编码。

本说明书中的PRR7蛋白质并不限定于含有序列号3或序列号5所示氨 基酸序列的蛋白质，包含具有下述氨基酸序列的蛋白质：与序列号3或序列 号5所示氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 97％、或者99％的同一性。

另外，本说明书中的PRR7蛋白质包含具有下述氨基酸序列的蛋白质： 与序列号3或序列号5所示氨基酸序列具有至少90％、95％、97％或者99％ 的相似性。

在本申请说明书中，氨基酸序列的相似性％是指：考虑了氨基酸的不同 的蛋白质间的相似性的程度。即，进行后述的氨基酸的保守取代等时，看作 为相似的氨基酸而求出的值为相似性％。

(b)含有PR结构域和CCT基序的蛋白质

本申请说明书中的PRR7蛋白质为含有PR结构域和CCT基序的蛋白质。 已知PRR蛋白质与植物的昼夜节律时钟相关，普遍存在于植物中。PRR蛋白 质含有高度保守的假受体(pseudo-receiver:PR)结构域和CCT基序。已知PR结 构域为PRR蛋白质的共同基序，具有蛋白质的相互作用能力。另外，CCT基 序富有碱性，认为参与蛋白质间的结合。PRR7蛋白质为PRR蛋白质之一， 含有PR结构域和CCT基序。

PR结构域在序列号3的氨基酸序列中相当于氨基酸编号62～176，在序列 号5的氨基酸序列中相当于氨基酸编号62～176。并且，CCT基序在序列号3 的氨基酸序列中相当于氨基酸编号676～722，在序列号5的氨基酸序列中相当 于氨基酸编号678～724。因此，在本申请说明书中，PR结构域是指相当于序 列号3的氨基酸序列的氨基酸编号62～176的氨基酸序列。并且，在本申请说 明书中，CCT基序是指相当于序列号3的氨基酸序列的氨基酸编号676～722 的氨基酸序列的氨基酸序列。但是，在本申请说明书中，PRR7蛋白质的PR 结构域和CCT基序的氨基酸序列并不限定于上述PR结构域和CCT基序，还 包含与这些氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或者99％的同 一性的氨基酸序列。

在PR结构域的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号64的缬氨酸 (Val)、66的亮氨酸(Leu)、67的缬氨酸(Val)、70的天冬酰胺酸(Asp)、71的天 冬胺酸(Asp)、73的苏氨酸(Thr)、74的精氨酸(Arg)、77的缬氨酸(Val)、79的 丙氨酸(Ala)、80的亮氨酸(Leu)、81的亮氨酸(Leu)、82的精氨酸(Arg)、84 的半胱氨酸(Cys)、86的酪氨酸(Tyr)、87的谷氨酸(Glu)、88的缬氨酸(Val)、 91的丙氨酸(Ala)、93的天冬酰胺(Asn)、94的甘氨酸(Gly)、97的丙氨酸(Ala)、 98的色氨酸(Trp)、101的亮氨酸(Leu)、102的谷氨酸(Glu)、103的天冬胺酸 (Asp)、106的天冬酰胺(Asn)、108的异亮氨酸(Ile)、109的天冬酰胺酸(Asp)、 111的缬氨酸(Val)、112的亮氨酸(Leu)、113的苏氨酸(Thr)、114的谷氨酸(Glu)、 115的缬氨酸(Val)、117的蛋氨酸(Met)、118的脯氨酸(Pro)、121的丝氨酸(Ser)、 122的甘氨酸(Gly)、123的异亮氨酸(Ile)、125的亮氨酸(Leu)、126的亮氨酸 (Leu)、129的异亮氨酸(Ile)、132的组氨酸(His)、138的异亮氨酸(Ile)、139 的脯氨酸(Pro)、140的缬氨酸(Val)、141的异亮氨酸(Ile)、142的蛋氨酸(Met)、 143的蛋氨酸(Met)、144的丝氨酸(Ser)、145的丝氨酸(Ser)、147的天冬胺酸 (Asp)、149的蛋氨酸(Met)、152的缬氨酸(Val)、153的苯丙氨酸(Phe)、154 的赖氨酸(Lys)、155的半胱氨酸(Cys)、156的亮氨酸(Leu)、157的丝氨酸(Ser)、 158的赖氨酸(Lys)、159的甘氨酸(Gly)、160的丙氨酸(Ala)、161的缬氨酸(Val)、 162的天冬胺酸(Asp)、163的苯丙氨酸(Phe)、164的亮氨酸(Leu)、165的缬氨 酸(Val)、166的赖氨酸(Lys)、167的脯氨酸(Pro)、169的精氨酸(Arg)、170的 赖氨酸(Lys)、171的天冬酰胺(Asn)、172的谷氨酸(Glu)、173的亮氨酸(Leu)、 174的赖氨酸(Lys)、176的亮氨酸(Leu)的氨基酸残基未被取代而保存。在本 申请说明书中，将这些氨基酸残基称为“假受体(PR)结构域保守氨基酸”。

在PR结构域的氨基酸序列中，进一步优选除上述的“假受体(PR)结构域 保守氨基酸”以外，序列号3的氨基酸编号68的谷氨酸(Glu)、72的丝氨酸(Ser)、 75的谷酰胺(Gln)、76的缬氨酸(Val)、78的丝氨酸(Ser)、89的异亮氨酸(Ile)、 90的脯氨酸(Pro)、92的谷氨酸(Glu)、100的酪氨酸(Tyr)、105的谷酰胺(Gln)、 110的亮氨酸(Leu)、127的丝氨酸(Ser)、134的异亮氨酸(Ile)、135的半胱氨 酸(Cys)、136的赖氨酸(Lys)、146的天冬酰胺(Asn)、175的天冬酰胺(Asn)的 氨基酸残基也未被取代而保存。另外，关于氨基酸编号68的谷氨酸(Glu)，也 可以为序列号5的氨基酸编号68的天冬胺酸(Asp)。另外，在PR结构域的氨 基酸序列中，进一步优选除上述的“假受体(PR)结构域保守氨基酸”以外，序列 号3的氨基酸编号62的异亮氨酸(Ile)、65的亮氨酸(Leu)、96的谷酰胺(Gln)、 131的天冬酰胺(Asn)、137的天冬酰胺(Asn)、150的甘氨酸(Gly)、168的异亮 氨酸(Ile)的氨基酸残基也未被取代而保存。

在CCT基序的氨基酸序列中，优选序列号3的氨基酸编号676的谷酰胺 (Gln)、678的谷氨酸(Glu)、682的丙氨酸(Ala)、683的丙氨酸(Ala)、686的赖 氨酸(Lys)、687的苯丙氨酸(Phe)、688的精氨酸(Arg)、690的赖氨酸(Lys)、 691的精氨酸(Arg)、692的赖氨酸(Lys)、694的精氨酸(Arg)、696的苯丙氨酸 (Phe)、698的赖氨酸(Lys)、699的赖氨酸(Lys)、700的缬氨酸(Val)、701的精 氨酸(Arg)、702的酪氨酸(Tyr)、703的谷酰胺(Gln)、704的丝氨酸(Ser)、705 的精氨酸(Arg)、706的赖氨酸(Lys)、708的亮氨酸(Leu)、709的丙氨酸(Ala)、 710的谷氨酸(Glu)、711的谷酰胺(Gln)、712的精氨酸(Arg)、713的脯氨酸(Pro)、 714的精氨酸(Arg)、715的缬氨酸(Val)、716的精氨酸(Arg)、717的甘氨酸(Gly)、 718的谷酰胺(Gln)、719的苯丙氨酸(Phe)、720的缬氨酸(Val)、721的精氨酸 (Arg)的氨基酸残基未被取代而保存。在本申请说明书中，将这些氨基酸残基 称为“CCT基序保守氨基酸”。

另外，在CCT基序的氨基酸序列中，进一步优选除上述的“CCT基序保 守氨基酸”以外，序列号3的氨基酸编号677的谷酰胺(Gln)、氨基酸编号695 的天冬氨酸(Asn)、697的甘氨酸(Gly)、707的精氨酸(Arg)、722的谷酰胺(Gln) 的氨基酸残基也未被取代而保存。另外，关于氨基酸编号677的谷氨酸(Glu)， 也可以为序列号5的氨基酸编号679的精氨酸(Arg)。另外，在CCT基序的氨 基酸序列中，进一步优选除上述的“CCT基序保守氨基酸”以外，序列号3的 氨基酸编号689的谷氨酰胺(Gln)、693的谷氨酸(Glu)的氨基酸残基也未被取 代而保存。

本申请说明书中的与PR结构域具有同一性的氨基酸序列可以保持PR结 构域保守氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中，未对PR结构域保守氨基 酸以外的氨基酸进行修饰。

本申请说明书中的与CCT基序具有同一性的氨基酸序列可以保持CCT 基序保守氨基酸，且在CCT基序氨基酸序列中，未对CCT基序保守氨基酸 以外的氨基酸进行修饰。

这些氨基酸的修饰可以为氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加。另外， 氨基酸的取代也可以为保守取代，其对特定的氨基酸残基利用具有类似的物 理化学特性的残基进行取代。保守取代的非限定性的例子包含Ile、Val、Leu 或Ala互相的取代这样的含有脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代、Lys及 Arg、Glu及Asp、Gln及Asn相互的取代这样的极性基团残基之间的取代等。

(c)具有抑制LHY(Late Elongated Hypocotyl)基因及CCA1(Circadian  Clock-Associated 1)基因的转录的活性

本发明人等发现，位于长雄野生稻的第7染色体末端，且具有序列号2 所示碱基序列的PRR基因、及位于“日本晴”的第7染色体末端，且具有序列 号4所示碱基序列的PRR基因(OsPRR37)为与高产性有关的基因。这些PRR 蛋白质被归类为PRR7，PRR7蛋白质具有对LHY(Late Elongated Hypocotyl) 基因及CCA1(Circadian Clock-Associated 1)基因转录进行抑制的活性。即，在 申请说明书中，PRR7蛋白质具有抑制LHY(Late Elongated Hypocotyl)基因及 CCA1(Circadian Clock-Associated 1)基因的转录的活性。

如下述的实施例所示通过使由源自长雄野生稻的PRR7的启动子与源自 日本晴的PRR7结构基因可操作地连接而成的核酸导入植物，可增大植物的 产量，即对该植物赋予高产性。因此，在得到本发明的效果时，本发明的源 自长雄野生稻的PRR7的启动子发挥重要的作用。

并且，本发明为如下得到的核酸：将与序列号3所示氨基酸序列或序列 号5所示氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 97％或者99％的同一性的氨基酸序列、且编码在与源自长雄野生稻的PRR7 基因的启动子可操作地连接时具有增大植物产量的活性的蛋白质进的核酸与 源自长雄野生稻的PRR7基因的启动子可操作地连接而成。将该核酸导入植 物也可对植物赋予高产性。在本发明的优选的实施方式中，这样的核酸可以 对含有PR结构域和CCT基序的蛋白质进行编码、和/或对具有对LHY基因 及CCA1基因的转录进行抑制的活性的蛋白质进行编码。另外，该核酸可用 作下述(3)～(6)中记载的本发明的核酸。

(3)载体，其含有本发明的启动子或者含有将本发明的启动子与PRR7结 构基因可操作地连接而成的核酸

本发明为单独含有本发明的启动子的载体、或者含有本发明的启动子与 含有编码PRR7蛋白质的碱基序列的核酸(PRR7的结构基因)可操作地连接而 成的核酸的载体。这样的载体用于对植物赋予高产性。

并且，本发明为下述载体在对植物赋予高产性的用途：含有本发明的启 动子与含有对PRR7蛋白质进行编码的碱基序列的核酸(PRR7的结构基因)可 操作地连接而成的核酸。

载体可简单地通过利用常规方法将期望的基因连接于本领域中可获得的 重组用载体来制备。在使用本发明的核酸对植物赋予高产性的情况下，植物 转化用载体特别有用。本发明中所使用的载体只要用于在植物细胞中实现本 发明的目标效果就没有特别限定，例如可以使用pBI系的载体、pBluescript 系的载体、pUC系的载体等。作为pBI系的载体，例如可以举出：pBI121、 pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI221等。从能够经由土壤秆菌向植物导入目 标DNA的方面考虑，优选pBI系的载体等双元载体。另外，作为pBluescript 系的载体，例如可以举出：pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II  KS(+)、pBluescript II KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)等。作 为pUC系的载体，可以举出：pUC19、pUC119等。从能够向植物直接导入 DNA的方面考虑，优选pBluescript系的载体、pUC系载体。并且，也可优选 使用pGreen系列(www.pgreen.ac.uk)、pCAMBIA系列(www.cambia.org)等双元 载体或pSB11(Komari et al,1996,Plant J,10:165-174)、pSB200(Komori et al, 2004,Plant J,37:315-325)等超级双元载体。

另外，上述载体优选包含含有转录产物的稳定化所需的多聚腺苷酸化位 点的转录终止子序列。该领域从业人员可适当地选择转录终止子序列。

转录终止子序列只要具有作为转录终止部位的功能就没有特别限定，也 可以为公知的序列。例如可优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区域(Nos 终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区域(CaMV35S终止子)等。在上述 重组表达载体中，通过将转录终止子序列配置于适当的位置，可以在导入于 植物细胞后对不必要地合成较长转录物的现象等的发生进行防止。

另外，上述重组表达载体中也可以进一步含有其它的DNA片段。该其它 的DNA片段没有特别限定，可以举出：转化体筛选标记物、增强子、用于提 高翻译效率的碱基序列等。另外，上述重组表达载体也可以进一步具有T-DNA 区域。特别是在使用土壤秆菌将上述重组表达载体导入植物体的情况下， T-DNA区域可提高基因导入的效率。

作为转化体筛选标记物，例如可以使用药物抗性基因。作为这种药物抗 性基因的一个具体例子，例如可以举出：针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、 庆大霉素、氯霉素等的药物抗性基因(对抗生素卡那霉素或庆大霉素为抗性的 新霉素磷酸转移酶基因、对潮霉素为抗性的潮霉素磷酸转移酶基因)。另外， 也可利用对除草剂膦丝菌素为抗性的草铵膦乙酰转移酶基因等。由此，通过 对在含有上述抗生素或除草剂的培养基中生长的植物体进行选择，可容易地 筛选进行了转化的植物体。

作为用于提高翻译效率的碱基序列，例如可以举出：源自烟草花叶病毒 的omega序列。通过将该omega序列配置于启动子的非翻译区域(5’UTR)， 可提高上述融合基因的翻译效率。

另外，作为增强子，可以举出含有CaMV35S启动子内的上游侧的序列 的增强子区域。如上所述，在上述重组表达载体中，可以根据其目的而含有 各种DNA片段。

关于重组表达载体的构建方法也没有特别限定，只要在适宜选择的作为 母体的载体中以指定顺序导入本发明的启动子、PRR7的结构基因、及终止子 序列、以及根据需要的上述其它DNA片段即可。为了将上述基因插入作为母 体的载体，可使用依据常规方法将提纯的基因的DNA以适当的限制酶切断， 并插入于适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点的方法等(例如，分子 克隆(Molecular Cloning),5.61-5.63)。

对本领域从业人员而言，可通过一般的基因工程技术适宜制备具有期望 基因的载体。通常，可通过利用市售的各种载体来容易地制备。

(4)导入了本发明的启动子和PRR7的结构基因的转基因植物

并且，本发明为一种将含有本发明的启动子与含有编码PRR7蛋白质的 碱基序列的核酸(PRR7的结构基因)可操作地连接而成的核酸导入植物的转基 因植物。上述核酸通常被插入于适当的载体，导入于作为转化对象的植物细 胞中。即，本发明提供一种持有上述核酸或重组表达载体的植物细胞(转基因 植物)。上述植物细胞包含各种形态的植物细胞、例如悬浮培养细胞、原生质 体、植物体中的细胞。另外，作为本发明的转化体，不仅包含植物细胞，还 包含植物体整体、植物器官(例如根、茎、叶、花瓣、种子、果实、成熟胚、 未成熟胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、 软组织、木质部、维管束等)、它们的切片、愈伤组织、芽原基、多芽体、毛 状根及培养根等中的任一者。

作为在宿主细胞内使上述基因表达的方法，可以举出：将上述基因导入 适当的载体，例如通过聚乙二醇法、土壤秆菌法、脂质体法、阳离子脂质体 法、磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(电穿孔)(Current protocols in Molecular  Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section 9.1-9.9)、 脂质体介导法(GIBCO-BRL株式会社制造)、微注射法、基因枪法等本领域从 业人员公知的方法导入生物体内的方法。在本发明中，可优选使用土壤秆菌 法。在向植物体内导入本发明的基因的情况下，基因也可使用微注射法、电 穿孔法、聚乙二醇法等直接导入植物细胞，但也可以组入用于向植物导入基 因的质粒并将其作为载体，经由具有植物感染能力的病毒或者细菌，间接地 导入植物细胞。作为这种病毒，例如作为代表性的病毒，可以举出：花椰菜 花叶病毒、烟草花叶病毒、双生病毒群等，作为细菌，可以举出土壤秆菌等。 在通过土壤秆菌法进行向植物的基因导入的情况下，可以使用市售的质粒。

另外，本发明不仅包含直接导入了上述核酸或载体的植物细胞，还包含 使植物细胞生长而成的植物体、该植物的后代、子孙或克隆的植物以及繁殖 材料(例如种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等)。 原子转基因植物细胞的植物体的再生可以根据植物细胞的种类使用本领域从 业人员公知的方法来进行。上述技术已经确立，并广泛应用于本发明的技术 领域，在本发明中，可优选使用上述方法。

对转化的植物细胞进行再分化而再生植物体的方法根据植物细胞的种类 而不同，例如，若为稻，则可以举出：Fujimura等(Plant Tissue Culture  Lett.2:74(1995))的方法，若为玉米，则可以举出：Shillito等(Bio/Tec  hnology 7:581(1989))的方法和Gorden-Kamm等(Plant Cell 2:603(1990)) 的方法。通过上述方法再生，且栽培的转基因植物体中所导入的外来基因的 存在可通过如下操作进行确认：通过公知的PCR法或DNA杂交法对植物体中 的DNA的碱基序列进行分析。此时，DNA自转基因植物体的提取可依据公知的 J.Sambrook等的方法(分子克隆(Molecular Cloning)、第2版、冷泉港实验 室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989)实施。

例如，在使用PCR法对在再生的植物体中存在的本发明的基因进行分析 的情况下，以如上所述从再生植物体中提取的DNA作为模板进行扩增反应。 另外，也可以使用具有依据本发明的基因或者经修饰的基因的碱基序列而进 行了适当选择的碱基序列而合成的寡核苷酸作为引物，在混合了它们的反应 液中进行扩增反应。在扩增反应中，若反复进行几十次DNA的改性、退火、 延伸反应，则可得到含有本发明的基因的碱基序列的DNA片段的扩增产物。 若将含有扩增产物的反应液供于例如琼脂糖电泳，则可使所扩增的各种DNA 片段分级，并对该DNA片段与本发明的基因对应情况进行确认。

若一旦得到在基因组内导入有本发明的基因的转基因植物体，则可由该 植物体通过有性繁殖或无性繁殖得到子代。另外，也可以由该植物体或其子 代或者克隆得到繁殖材料，并以它们为基础批量生产该植物体。本发明中包 含导入有本发明的基因或重组表达载体的植物细胞、含有该细胞的植物体、 该植物体的子代及克隆以及该植物体、其子代、及克隆的繁殖材料。即，本 发明中包含作为实施了转化处理的再分化一代的“T0代”、作为T0代的植物 的自体受精种子的“Tl代”等后代植物、及以它们作为一个亲本进行杂交而得 到的杂种植物或其后代植物。

如上制备的植物体与通常的植物相比，可期待具有高产性这样的有利的 特性。用作本发明中进行转化的对象植物没有特别限定，可通过本发明的方 法制备具有高产性的各种转基因植物。

在本发明的优选的实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植 物，进一步优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优 选实施方式中进行了转化的植物为短日照植物。

在下述的实施例中，示出制备导入了本发明的启动子和源自长雄野生稻 的PRR结构基因的转化玉米。

(5)制备使用本发明的启动子和PRR7的结构基因使产量增大的转基因植 物的方法

并且，本发明为一种制备使产量增大的转基因植物的方法，其包括：将 下述核酸导入植物的工序：所述核酸是将本发明的启动子和含有编码PRR7 蛋白质的碱基序列的核酸(PRR7的结构基因)可操作地连接而成的。更具体而 言，制备本发明的启动子序列和编码PRR7蛋白质的的核酸(PRR7的结构基 因)可操作地连接而成的核酸，并将所述核酸导入植物细胞，由导入有核酸的 上述植物细胞再生植物体，由此可制备使产量增大的转基因植物。作为用于 导入核酸的植物材料，例如可以举出：根、茎、叶、种子、成熟胚、未成熟 胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉等植物组织或其切片、细胞、愈伤组织、 对其进行酶处理而除去了细胞壁的原生质体等植物细胞，可优选使用成熟胚 或未成熟胚。制备本发明的转基因植物的方法没有特别限定，可以使用本技 术领域中一般使用的各种植物的转化方法。例如可适宜使用上述(4)中记载的 转化方法。

在本发明的优选实施方式中转化的植物为被子植物，优选为单子叶植物， 进一步优选为稻、玉米、高粱，最优选为稻和玉米。另外，本发明的优选的 实施方式中转化的植物为短日照植物。在下述的实施例中，示出通过将本发 明的启动子和源自长雄野生稻的PRR结构基因导入玉米，可对玉米赋予高产 性。

(6)使植物的产量增大的方法

并且，本发明为一种使植物的产量增大的方法，其包括：使核酸导入植 物，所述核酸通过使含有本发明的启动子序列和编码PRR7蛋白质的碱基序 列的核酸(PRR7的结构基因)可操作地连接而成。通过上述(2)中叙述的核酸导 入植物，可增大植物的产量。本方法中使用的PRR7蛋白质满足上述(2)中所 规定的PRR7蛋白质的定义。即为与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所 示氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、 或者99％的同一性的氨基酸序列，含有PR结构域和CCT基序，且具有抑制 LHY基因及CCA1基因转录的活性的蛋白质。与PR结构域具有同一性的氨 基酸序列可以保持PR结构域的保守氨基酸，且在PR结构域的氨基酸序列中， 未对PR结构域保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。与CCT基序具有同一性 的氨基酸序列可以保持CCT基序保守氨基酸，且在CCT基序氨基酸序列中， 未对CCT基序保守氨基酸以外的氨基酸进行修饰。

与编码PRR7蛋白质的碱基序列可操作地连接的启动子优选为由序列号 1的34845-35044所示的碱基序列、序列号1的33045-35044所示的碱基序列、 或者序列号1的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸。本方法中所使用 的启动子并不限定于这些核酸，还包含由序列号1的34845-35044所示的碱 基序列的一部分、序列号1的33045-35044所示的碱基序列的一部分、或者 序列号1的26779-35044所示的碱基序列的一部分构成的片段，即含有显示 促进植物基因转录的活性的碱基序列的核酸。并且，本方法中所使用的启动 子含有下述核酸：其与序列号1的34845-35044所示的碱基序列、序列号1 的33045-35044所示的碱基序列、或者序列号1的26779-35044所示的碱基序 列具有80％、85％、90％、95％、97％、99％或者99.5％的同一性，且显示促 进植物基因转录的活性的碱基序列。并且，本发明中所使用的启动子包含下 述核酸：其是源自长雄野生稻的碱基序列，即至少含有由序列号1的 34845-35044表示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。

(7)本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因作为DNA标记物 的应用

本发明的启动子和源自长雄野生稻的PRR7结构基因的整体或部分序列 用作植物高产性的DNA标记物。在植物中检测出本发明的启动子的序列或者 源自长雄野生稻的PRR7结构基因的序列时，可期待该植物显示长雄野生稻 样的高产性的性状。作为这样的标记物，更优选源自本发明的启动子的碱基 序列。

在这样的目的下，使用的本发明的DNA标记物优选含有序列号1的 26779-35044所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的 15～2000个碱基，进一步优选含有序列号1的26779-35044所示的碱基序列和 /或序列号1的35825-46721所示的碱基序列的20～500个碱基，进一步优选含 有序列号1的26779-35044所示的碱基序列和/或序列号1的35825-46721所 示的碱基序列的30～100个碱基。但是，本发明的高产性的DNA标记物并不 限定于此。

作为优选的1实施方式，对本发明的启动子的碱基序列或长雄野生稻的 PRR结构基因的碱基序列与日本晴的对应部分的碱基序列进行比较，选择相 当于两者之间发现差异的区域的长雄野生稻部分序列作为上述叙述的DNA 标记物。

在植物中检测本发明的DNA标记物，且存在该DNA标记物时，可以判 定该植物为高产性。例如，关于通过将日本晴和长雄野生稻杂交而得到的植 物，在选择高产性的稻品种时，可以使用如上所述的相当于在长雄野生稻和 日本晴间存在差异的区域的长雄野生稻部分序列作为DNA标记物。

本发明的DNA标记物的检测方法没有特别限定，可以使用PCR、RFLP 或者碱基序列解码等本技术领域中已知的各种方法。并且，本发明的DNA标 记物的检测也可在通过杂交而得到的植物成长的任一阶段进行。关于通过杂 交而得到的植物，在幼苗的阶段进行DNA标记物的检测在本发明中较为合 适，由此，可以在交配的植物生长之前判定该植物是否为高产性。

(8)使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法

本发明提供一种使用本发明的启动子提高植物基因的转录活性的方法。 即，本发明为一种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所示的 碱基序列、或使用含有与序列号1的34845-35044所示的碱基序列具有至少 90％的同一性的碱基序列的核酸来提高植物基因的转录活性。并且，本发明 为一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、 或含有与序列号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90％的同一性的 碱基序列的核酸来提高植物基因的转录活性。另外，本发明为一种方法，其 包括：使用含有下述核酸来提高植物基因的转录活性：所述核酸是源自长雄 野生稻的碱基序列，至少含有由序列号1的34845-35044表示的碱基序列， 且显示促进植物基因转录的活性。在这样的核酸中，优选含有由序列号1的 33045-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段，进一步优选含有由序列号1 的26779-35044所示的碱基序列构成的核酸的片段。在下述的实施例中，实 际上确认到含有序列号1的34845-35044和相当于序列号1的33045-35044的 碱基序列的核酸具有促进GUS基因转录的活性。

(9)源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸

并且，本发明提供一种源自长雄野生稻的PRR7蛋白质和编码其的核酸。 如上所述，源自长雄野生稻的PRR7蛋白质由序列号3所示氨基酸构成，由 序列号2所示的碱基序列的核酸进行编码。因此，本发明涉及具有序列号3 所示氨基酸序列的蛋白质和编码该蛋白质的核酸。本发明还涉及具有序列号2 所示碱基序列的核酸。在下述的实施例中，与向源自长雄野生稻的PRR7启 动子导入结合有编码源自日本晴的PRR7蛋白质的基因的构建体的情况相比， 向相同的启动子导入结合有编码源自长雄野生稻的PRR7蛋白质的基因的构 建体的情况显示更明显的高产性赋予效果。即，在与源自长雄野生稻的PRR7 启动子可操作地连接而表达的情况下，与对源自其它植物的PRR7蛋白质进 行编码的核酸相比，对源自长雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸具有 可对植物赋予更好的高产性的特性。因此，在对植物赋予高产性时，对源自 长雄野生稻的PRR7蛋白质进行编码的核酸与源自长雄野生稻的PRR7启动子 一起使用，在本发明中较为合适。并且，本发明鉴于这样的编码源自长雄野 生稻的PRR7蛋白质的核酸的特征，提供一种对具有序列号3所示氨基酸序 列的蛋白质进行编码的核酸在植物赋予高产性中的应用；提供一种使植物的 产量增大的方法，其将对具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的 核酸导入植物中；以及提供一种产量增大的转基因植物的制备方法，其将对 具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸导入植物中。

(10)源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可操作地连接而成的 核酸

并且，本发明为一种源自高粱的PRR7启动子与高粱PRR7结构基因可 操作地连接而成的核酸。源自高粱的PRR7启动子为含有示于序列号19的 9049个碱基序列所示的碱基序列的核酸。本说明书中的源自高粱的PRR7启 动子的碱基序列并不限定于示于序列号19的碱基序列，也包含含有与这些碱 基序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、99％、或者99.5％的同一性， 且显示促进植物的编码区域的转录的活性的碱基序列的核酸。

源自高粱的PRR7蛋白质由序列号17所示的765个氨基酸构成，由序列 号16所示的碱基序列的核酸进行编码。本申请说明书中的源自高粱的PRR7 蛋白质并不限定于此，包含与序列号17所示氨基酸序列具有至少50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或者99％的相似性 的氨基酸序列的蛋白质。并且，本申请说明书中的源自高粱的PRR7蛋白质 与上述(2)中源自长雄野生稻的PRR7蛋白质相关叙述的蛋白质同样地含有PR 结构域和CCT基序，且具有对LHY基因及CCA1基因转录进行抑制的活性。 源自高粱的PRR7蛋白质的PR结构域在序列号17的氨基酸序列中相当于氨 基酸编号80～194，CCT基序相当于氨基酸编号709～752。但是，在本申请说 明书中，源自高粱的PRR7蛋白质的PR结构域和CCT基序的氨基酸序列并 不限定于上述PR结构域和CCT基序，还含有与这些氨基酸序列具有至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或者99％的同一性的氨基酸序列。

使用源自高粱的PRR7启动子和高粱PRR7结构基因可操作地连接而成 的核酸，可使植物的产量增大。在下述的实施例中，显示通过将含有序列号 19所示的碱基序列的核酸和序列号16所示的碱基序列的核酸的构建体导入 稻，确认到产量增加的效果。

实施例

实施例1：具有稻野生种长雄野生稻所具有的高产性的稻栽培系统的制备和高产性基因区域的确定

已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻(O.longistaminata)虽然与作为栽培 种的栽培稻(O.sativa L.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生 物质。本发明者认为为了将长雄野生稻所具有的这样的优良性状导入栽培种， 持续进行了稻栽培品种“Shiokari”和长雄野生稻的杂交、选择，结果得到与 “Shiokari”相比显示高产性的BC7F6系统“No.645”。该“No.645”的大部分的农 业性状超越“Shiokari”，特别是，特征为基秆直径变粗(表1)。关于该高产性系 统，使用覆盖全部12条染色体的80个DNA标记物研究基因型，结果可知，仅 具有长雄野生稻的第3染色体末端部和第7染色体末端部(图1)。

因此，本发明人为了明确与“No.645”所具有的高产性相关的基因区域， 使用将使“No.645”与回归亲本“Shiokari”杂交而成的F2的133个个体进行与产 量相关性状有关的QTL分析。其结果，在第7染色体末端部检测出与到出穗为 止的天数、秆长、穗长、每穗颖花数、基秆直径有关的QTL(表2)。接着，杂 交后代F3个体中，选择第7染色体末端部为杂合(hetero)，且其它第7染色体区 域为“Shiokari”型的个体和“No.645”型的个体，使用其后代4313个个体和4944 个个体对末端部的重组个体进行选择。其结果，可选择最末端固定为“No.645” 型的3个个体(F4-No.1,No.2,No.3)和最末端固定为“Shiokari”型的4个个体 (F4-No.4,No.5,No.6,No.7)(图2)。最末端固定为“No.645”型的个体的性状与 “No.645”大致相同。另外，最末端固定为“Shiokari”型的个体的性状与 “Shiokari”大致相同(表3)。标记物CH15377-1由于距PAC克隆P0627E10的图2 的右末端约180kb，因此，可推测长雄野生稻所具有的高产性的基因区域可缩 小至第7染色体末端部约180kb。

[表1]

Shiokari和No.645的产量相关性状的比较

[表2]

Shiokari和No.645的杂交F2集团中农业性状的QTL分析

[表3]

在第7染色体末端部发生重组且最末端以“No.645”型或“Shiokari”型固定的7个体的生长特 性

实施例2：通过长雄野生稻的第7染色体末端部区域的转化试验进行的互补性检验(1)

通过实施例1的遗传学分析，可以将长雄野生稻所具有的高产性的基因区 域缩小至第7染色体末端部的约180kb。制备网罗了其中约82kb的区域的7个构 建体，分别进行转化至“Shiokari”而得到的转化体的性状评价。

使用Fosmid载体pCC1FOS(EPICENTRE株式会社)制备“No.645”的基因 组文库。通过实施例1的遗传学分析，显示与高产性有关的基因位于第7染 色体的长臂末端部，因此，使用作为该区域的DNA标记物的C213及 C728(Harushima et al,1998)筛选文库，选择4个克隆(Fos1、2、10、12)。对各 克隆的末端碱基序列进行解码，与日本晴基因组序列比较，由此可明确互相 的位置关系。并且，进行引物步移，对该编码的碱基序列进行解码。将所解 码的碱基序列示于序列号1。

使用上述4个Fosmid克隆制备下述的7个互补性试验用构建体(图3)。

(1)Fr3的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit(QIAGEN株式会社)，利用琼脂糖将对用 NotI处理Fos12而得到的最大的片段(包含序列号1的第15961号的碱基至第 37129号的碱基)进行提纯。

将质粒载体pSB200(具有潮霉素抗性基因盒的中间载体)用NotI完全消化 后，通过乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解于TE溶液后，通过 CIAP(TAKARA-BIO株式会社)进行脱磷酸化。将反应液利用琼脂糖凝胶进行 电泳后，使用QIAEXII Gel Extraction Kit利用凝胶对载体片段进行提纯。

对通过上述操作准备的2个片段进行测试，使用DNA Ligation Kit “Mighty Mix”(TAKARA-BIO株式会社)进行连接反应。反应后，通过乙醇沉淀 回收DNA。将回收的DNA溶解于纯水(通过Millipore株式会社制造装置制备) 后，与大肠秆菌DH5α混合，供试于电穿孔。将电穿孔后的溶液在LB培养基 中进行振荡培养(37℃、1小时)后，在含有壮观霉素(50μg/ml)的LB板上扩展 并保温(37℃、16小时)。对生成的菌落中的24个菌落分离质粒，研究限制酶 切断长度模式及边界部碱基序列，由此选择期望的大肠秆菌。

(2)Fr1的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用NotI处理Fos12而得 到的第二大的片段(包含序列号1的第3号的碱基至第9746号的碱基)进行提 纯。

对该片段与(1)中使用的NotI-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试， 使用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然后，依据(1)中记载的方 法选择期望的大肠秆菌。

(3)Fr7的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用NotI处理Fos1而得到 的最大的片段(包含序列号1的第58805号的碱基至第82355号的碱基)进行提 纯。

对该片段与(1)中使用的NotI-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试， 使用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然后，依据(1)中记载的方 法选择期望的大肠秆菌。

(4)Fr5的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用NotI处理Fos1而得到 的第二大的片段(包含序列号1的第42409号的碱基至第58808号的碱基)进 行提纯。

对该片段与(1)中使用的NotI-CIAP处理后的pSB200片段一起进行测试， 使用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然后，依据(1)中记载的方 法选择期望的大肠秆菌。

(5)Fr2的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用NotI处理Fos1而得到 的第二大的片段(包含序列号1的第6929号的碱基至第19723号的碱基)进行 提纯。

将该片段与(1)中使用的NotI-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使 用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然后，依据(1)中记载的方法 选择期望的大肠秆菌。

(6)Fr6的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用NotI处理Fos1而得到 的第二大的片段(包含序列号1的第51665号的碱基至第62366号的碱基)进 行提纯。

将该片段与(1)中使用的NotI-CIAP处理后的pSB200片段一起测试，使 用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然后，依据(1)中记载的方法 选择期望的大肠秆菌。

(7)Fr4的制备

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用SmaI及PstI处理Fos10 而得到的最大的片段(包含序列号1的第26779号的碱基至第46059号的碱基) 进行提纯。

使用QIAEXII Gel Extraction Kit，利用琼脂糖对用PstI及SacI处理Fos1 而得到的第四大的片段(包含序列号1的第46056号的碱基至第49155号的碱 基)进行提纯。

将质粒载体pSB200用EcoRV及SacI完全消化后，通过乙醇沉淀回收 DNA。将回收的DNA通过(1)中记载的方法进行CIAP处理，提纯载体片段。

测试这3个片段，使用DNA Ligation Kit“Mighty Mix”进行连接反应。然 后，依据(1)中记载的方法选择期望的大肠秆菌。

对通过(1)～(7)选择的7种大肠秆菌与根癌土壤秆菌(Agrobacterium  tumefaciens)菌株LB4404/pSB1(Komari et al,1996)及辅助大肠秆菌HB101/ pRK2013(Ditta et al,1980)一起进行测试，依据Ditta et al(1980)的方法进行三 亲株的交配(triparential mating)。在含有壮观霉素(50μg/ml)、四环素(15μg/ml) 及潮霉素(35μg/ml)的AB板上，使用进行了选择的土壤秆菌并依据Hiei et al (1994)的方法进行“Shiokari”的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对 各构建体培育约20个个体独立的转化体，采种T1种子。

T1代对1个构建体测试2个系统、合计18个个体(1个系统为9个个体)。播 种在2007年6月25日进行，在7月9日向放入了水稻田土壤的3.5升的桶中各移植 3个个体(1个系统为3个桶，合计9个个体)。除对照的“Shiokari”以外，作为参 考品种对将长雄野生稻的第3染色体末端区域及第7染色体末端区域导入 “Shiokari”而成的系统“No.645”进行栽培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植 物Innovation Center的重组体评价专用的封闭体系温室(14小时30分钟昼长的 长昼条件)中，在无施肥条件下进行。收获在9月21日进行。对出穗日、秆长、 穗数、基秆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精 颖花重量(以下为每穗重)进行性状调查。

将各构建体2系统的农业性状数据的平均值示于表4。供试的全部7构建体 的每穗粒数或每穗重与对照的“Shiokari”大致相同或为其以下，未发现超越 “Shiokari”的构建体。

[表4]

重组体的性状评价试验

实施例3：通过长雄野生稻的第7染色体末端部区域的转化试验进行的互补性检验(2)

虽然在2007年进行了测试，但对于未得到显示生长旺盛性的结果的7个构 建体，使每个构建体的系统数(均源自独立的T0个体)增加至5系统(1个系统为 12个个体。与在2007年测试的系统不同。)，再次进行试验。播种在2008年5 月30日进行，在6月16日向放入了水稻田土壤的3.5升的桶中各移植4个个体(1 个系统为3个桶，合计12个个体)。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物 Innovation Center的重组体评价专用的封闭体系温室(14小时30分钟昼长的长 昼条件)中在不施肥条件下进行。收获在9月8日进行。对出穗日、秆长、穗数、 基秆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重 量(以下为每穗重)进行性状调查。2008年除对照的“Shiokari”以外，对作为参 考品种的、仅将长雄野生稻的第7染色体末端区域导入“Shiokari”而成的系统 “No.240”进行栽培。

将各构建体5系统的农业性状数据的平均值示于表5。Fr4构建体与对照的 “Shiokari”相比，直到出穗为止的天数、秆长、穗长、每穗粒数、种子育性、 每穗重、基秆直径的7个性状大幅提高，与此相对，剩余的6个构建体在全部 的性状中与“Shiokari”相同或为其以下。

[表5]

重组体的性状评价试验

接着，对于Fr4系统中其特性最显著地被显示的Fr4-4，对个体分别进行 PCR，考察导入基因的有无与性状测定值大小的关系。将其结果示于表6和 图4。基因持有个体与缺失个体相比，明确在长昼条件下(14小时30分钟)， 直到出穗为止的天数、秆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基秆直径方面提高。 另外，基因持有个体与缺失个体相比，还明确了着粒密度(每1cm穗的粒数) 高。

根据以上的结果，明显教导对“Shiokari”赋予高产性的基因组片段为Fr4 片段。

[表6]

系统Fr4-4中基因的有无和产量性状的关系

2009年将在2008年栽培的Fr4-4的基因持有个体及基因缺失个体的后代 (T2代)与对照的“Shiokari”、“No.240”一起栽培(1个系统12个个体)，评价产 量性状。播种在2009年5月1日进行，在5月11日向放入了水稻田土壤的 3.5升的桶中各移植4个个体。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物 Innovation Center的重组体评价专用的封闭体系温室(14小时30分钟昼长的长 昼条件)中在无施肥条件下进行。收获在8月19日进行。对出穗日、秆长、 穗数、基秆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精 颖花重量(以下为每穗重)进行性状调查。

将结果示于表7。基因持有个体的后代Fr4-4-1和Fr4-4-2与基因缺失个 体的后代Fr4-4-3相比，明确在天长条件下(14小时30分钟)，直到出穗为止 的天数、秆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基秆直径方面提高。另外，基因 持有系统与缺失系统相比，还明确了着粒密度(穗每1cm的粒数)高。另一方 面，可知Fr4-4-3的总性状测定值与“Shiokari”大致相同。

根据以上的结果，得出了对“Shiokari”赋予多产的基因组片段为Fr4片段 的结论。若参照日本晴序列(AP005199)的注释信息，则Fr4片段中包含日本 晴全长cDNA AK066112的等位基因，推测该基因赋予高产性。另外，K066112 基因座在Murakami et al.(2005)中记载为OsPRR37。因此，推测长雄野生稻所 具有的PRR7基因为对“Shiokari”赋予多产的原因基因。而且，认为该Fr4片 段中含有对PRR7基因进行编码的区域及用于使其表达的的区域。

[表7]

系统Fr4-4的T2后代的评价试验

实施例4：长雄野生稻PRR基因的编码区域的效果的确认

根据实施例3的结果，认为长雄野生稻所具有的PRR7基因为赋予高产 性的基因。为了对其进行确认，调查长雄野生稻的PRR基因的编码区域对产 量相关性状造成的影响。

具体而言，如下制备构建体：使作为启动子的泛素启动子、作为终止子 的长雄野生稻的PRR基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因的编码区 域连接而成。泛素启动子为通常用于单子叶植物的组成型启动子，认为适合 用于观察PRR基因的效果。将这些构建体导入栽培稻“Yukihikari”而实施产量 相关性状的评价。

使用重叠延伸(overlap extension)PCR等常规方法来构建构建体：其用于 使源自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域(序列号2)在泛素启动子的控制下 进行表达。具体而言，如下制备构建体：将含有pSB200的泛素启动子及泛素 内含子的区域进行PCR扩增，并在其相邻下游，将嵌合基因插入于pSB200 的多克隆位点，所述嵌合基因通过对长雄野生稻的翻译开始点上游区域(序列 号1的第35045号碱基至第35824号碱基)、序列号2及长雄野生稻的翻译终 止点下游区域(序列号1的第46722号碱基至第49157号碱基)连接而成。另外， 使用仅持有选择标记基因(潮霉素抗性基因)的质粒作为对照。

使用上述持有2种构建体的大肠秆菌，通过实施例2中记载的方法进行 三亲交配(triparental mating)及向栽培稻“Yukihikari”的转化。转基因稻在驯化 后，在封闭体系温室中栽培。PRR7基因以及对照的构建体分别独立培育60 个个体、20个个体的转化体。供试60个个体中，观察到18个个体显示(1)植 被高度较高、(2)茎粗、(3)直到出穗为止的天数长这样的与高产性相关特性的 个体。对于该18个体，对成熟期观察穗的性状进行观察时，在全部个体中， 观察到：(1)种子育性低(低于20％)、(2)穗未从止叶充分地抽出、(3)颖花处于 开颖而未闭颖等任一种状况。而且，最终的种子产量与对照相比，大幅降低(图 5)。另一方面，剩余的42个个体显示与对照的20个体大致相同的特性，未 观察到上述的不良性状。

根据以上的结果，无法确认长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域 为赋予高产性的基因。

实施例5：将源自长雄野生稻的启动子和各种PRR基因编码区域连接而成的构建体的效果

根据实施例4的结果，无法得出长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码 区域为赋予高产性的基因的结论。因此，发明人等进行了潜心研究，结果考 虑长雄野生稻的PRR7基因的启动子区域对于长雄野生稻的PRR7基因的表达 是否是必须的，制备构建体并导入至栽培稻，实施产量相关性状的评价，所 述构建体使作为启动子的长雄野生稻的PRR7基因的启动子区域、作为终止 子的长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因的编码 区域连接而成。另外，作为用于对长雄野生稻PRR7基因的效果进行评价的 对照，制备构建体进行实验，所述构建体使通常的栽培稻“日本晴”的PRR7 基因的编码区域与上述启动子及终止子连接而成。

长雄野生稻PRR基因及栽培稻“日本晴”PRR基因的分离

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，从长雄野生稻染色体片段导入系 统“No.645”及“日本晴”的幼苗中提取总RNA。按照试剂盒的手册进行了操作， 但未使用添加于RLT缓冲液的巯基乙醇，而添加了DTT使其最终浓度为 40mM来代替。利用附属的RNase free water(40～50μl)使总RNA溶出后，进行 DNase处理(TURBO DNA-free Kit,Ambion)。将处理后的RNA溶液利用琼脂 糖凝胶电泳检查浓度及纯度，然后，通过QuantiTect Rev.Transcription kit (QIAGEN)进行cDNA合成。为了以得到的cDNA溶液作为模板分离PRR基 因的编码区域，使用以下的2种引物进行RT-PCR。下述的longi-PRR 2F与序 列号1的35847-35869所示的碱基序列对应，longi-PRR 2R与序列号1的 46713-46735所示的碱基序列对应。

longi-PRR 2F:ACCAAACCGCCGGCTCTGCCCTC(序列号6)

longi-PRR 2R:GGTAGGTAGGTAGGTCATCTGTC(序列号7)

使用该结果得到的碱基序列确定“No.645”持有的源自长雄野生稻的 PRR7结构基因的碱基序列(序列号2)。推测该碱基序列为对由740个氨基酸 构成的蛋白质(序列号3)进行编码的碱基序列。在序列号3中，相当于氨基酸 编号62～176的区域为PR结构域，相当于氨基酸编号676～722的区域为CCT 基序。另外，日本晴的PRR7结构基因的碱基序列(序列号4)也使用同样的方 法进行确定，推测该碱基序列为对由742个氨基酸构成的蛋白质(序列号5)进 行编码的碱基序列。在序列号5中，相当于氨基酸编号62～176的区域为PR 结构域，相当于氨基酸编号678～724的区域为CCT基序。

将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及拟南芥来源的PRR基因的翻 译区域所编码的氨基酸序列的序列对比示于图6。并且，将由分离的日本晴来 源、长雄野生稻来源及拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所编码的氨基酸序 列的同一性(identity)％和相似性(similarity)％的值示于图7。

含有各PRR基因的构建体的制备

通过以下的步骤制备下述构建体：其将分离的cDNA插入于源自长雄野 生稻的PRR7基因的启动子区域和终止子区域之间而成。PCR使用PrimeSTAR  MAX DNA Polymerase(TAKARA-BIO株式会社)，连接使用DNA Ligation Kit “Mighty Mix”(TAKARA-BIO株式会社)。另外，将下述构建体的制备策略图解 并示于图8。

(1)包含源自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域的构建体(以下为longi 构建体)

以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。 下述的longi-PRR 1F与序列号1的34019-34044所示的碱基序列对应， longi-PRR 1R与序列号1的35838-35861所示的碱基序列对应。

longi-PRR 1F:CGCTTCGAAGATATCATCATCATTCATGTATGAG(序列 号8)

longi-PRR 1R:AGCCGGCGGTTTGGTTGTGATGAG(序列号9)

接着，对得到的PCR产物和上述源自“No.645”的RT-PCR产物进行测试， 使用longi-PRR 1F及longi-PRR 2R进行重叠延伸PCR。使用 Ex-Taq(TAKARA-BIO株式会社)对得到的PCR产物添加A-Tail后，克隆于 pCR-XL-TOPO(Invitrogen株式会社)，然后，为了破坏pCR-XL-TOPO上原本 存在的PstI部位，在EcoRV处理后，进行自我连接。自我连接后，进行利用 SacI及PstI的消化以及利用CIAP(TAKARA-BIO株式会社)的脱磷酸化。利用 琼脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段(包含图8的片段1)。

另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物 进行PCR。下述的longi-PRR 3F与序列号1的46721-46744所示的碱基序列 对应，longi-PRR 3R与序列号1的49137-49157所示的碱基序列对应。

longi-PRR 3F:ACCTACCTACCTACCTACGCAATG(序列号10)

longi-PRR 3R:GCTAGAATTCGAGCTCTCCAGGGAGCAGGGA(序列号 11)

对得到的PCR产物和上述源自“No.645”的RT-PCR产物进行测试，使用 longi-PRR 2F及longi-PRR 3R进行重叠延伸PCR。将得到的PCR产物利用 SacI及PstI消化后，利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收2.6kb片段(图8的 片段2)用于插入。该2.6kb片段与序列号1的4605649156所示的碱基序列对 应(其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接而成为46056-46107和 46596-49156串联结合而成的序列)。

使用上述2种回收片段进行连接。将得到的质粒利用SacI及NotI消化后， 利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收6.5kb片段(图8的片段3)。使回收的片 段3克隆于pSB200(利用SacI及NotI进行消化后，进行CIAP处理)。对得到 的质粒进行测试，利用NotI及EcoRV进行消化以及利用CIAP进行脱磷酸化。 利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段(包含片段3)。另一方面，利用 NotI及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进行消化，利用琼脂糖对反应 液进行电泳，回收7.3kb片段(片段4)。该7.3kb片段与序列号1的26779-34022 所示的碱基序列对应，使用两片段进行连接，得到目标质粒。

(2)含有源自日本晴的PRR7基因的编码区域的构建体(以下为日本晴构建 体)

以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR 1F及longi-PRR  1R进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试， 使用longi-PRR 1F及longi-PRR 2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到 的PCR产物添加A-Tail后，克隆于pCR-XL-TOPO。利用PstI及NotI对得到 的质粒进行消化后，利用琼脂糖反应液进行电泳，回收3.9kb片段(源自日本 晴cDNA-图8的片段1)作为插入物。

另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR 3F及 longi-PRR 3R进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产 物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR 3R进行重叠延伸PCR。使用 Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克隆于pCR-XL-TOPO。利用SacI 及PstI对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收2.6kb 片段(源自日本晴cDNA-图8的片段2)作为插入物。该2.6kb片段与序列号1 的46056-49156所示的碱基序列对应(其中，46108-46595为内含子，因此受到 剪接而成为将46056-46107和46596-49156串联结合的序列)。

将上述2种插入片段与pSB200(利用SacI及NotI进行消化后，进行CIAP 处理)一起测试，进行连接。对得到的质粒进行测试，利用NotI及EcoRV进 行消化以及利用CIAP进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收载 体片段(包含源自日本晴cDNA-图8的片段3)。

另一方面，利用NotI及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进行消化， 利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收7.3kb片段(图8的片段4)。使用两片段 进行连接，得到目标质粒。该7.3kb片段与序列号1的26779-34022所示的碱 基序列对应。

使用持有(1)及(2)中得到的目标质粒的大肠秆菌，通过实施例2中记载的 方法进行三亲交配及“Shiokari”的转化。转基因稻在进行驯化后，在封闭体系 温室中栽培。对各构建体独立培育60个体的转化体，采种T1种子。从各构 建体中按照采种量从多到少的顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。

就T1代而言，1个构建体测试18个系统(1个系统为12个个体)。播种 在6月25日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮 霉素显示抗性的个体(推测为持有基因的个体)作为移植的对象。在7月12日， 在放入有稻用育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐中各移植1个个体(1个系统 为12个罐、合计12个个体)。对施肥而言，在每个罐中，将N、P、K各设 为0.21g、0.33g、0.05g。作为对照，除“Shiokari”以外，将仅将长雄野生稻的 第7染色体末端区域导入“Shiokari”而成的系统“No.240”作为参考品种进行栽 培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物Innovation Center的重组体评价专 用的封闭体系温室(14小时30分钟昼长的长昼条件)中进行。对出穗日、秆长、 穗数、基秆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精 颖花重量(以下为每穗重)进行性状调查。

将结果示于表8。首先，对于Longi构建体和日本晴构建体，分别观察全 部18个系统的平均值，与对照“Shiokari”相比，导入了两构建体的植物的直到 出穗为止的天数、秆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基秆直径均明显提高。 另外，导入了任一构建体的植物与对照“Shiokari”相比，直到出穗为止的天数、 秆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基秆直径均显著提高。并且，导入了Longi 构建体的总18个系统、及导入了日本晴构建体的总18个系统的着粒密度(穗 每1cm的粒数)的平均值分别为5.15粒/cm、4.80粒/cm，明显比“Shiokari” 的着粒密度的平均值4.40粒/cm高。

以上，确认了PRR7基因是赋予高产性的原因基因。并且，若综合考虑 实施例3和实施例4的结果，则令人吃惊的是，可得到长雄野生稻的高产性 与PRR7基因的编码区域相比，启动子区域做出贡献的可能性较高这样的结 果。

此外，在表8中，若比较Longi构建体和日本晴构建体的植物的产量， 则前者的效果比后者的效果显著。因此，作为与启动子一起导入植物的结构 基因，与日本晴PRR7基因的结构区域相比，LongiPRR7基因的结构区域更 合适。

[表8]

野生稻长雄野生稻(O.longistaminata)及栽培稻日本晴的PRR基因的 cDNA构建体的产量相关性状的评价

实施例6：长雄野生稻和“日本晴”的PRR基因表达的分析

根据实施例5的结果，推测PRR7基因的启动子区域对多产产生影响， 因此，为了对长雄野生稻的PRR7基因启动子和栽培稻“日本晴”的PRR7基因 启动子的表达的不同进行调查，使用“日本晴”和“No.240”(通过杂交将长雄野 生稻的PRR7基因导入“Shiokari”的取代系统)的F1进行PRR7基因的表达分 析。

对“日本晴”(2个个体)、“No.240”(2个个体)及“日本晴”和“No.240”的F1(4 个个体)进行测试，在播种3周后对最新的完全展开叶进行取样，通过实施例 3中记载的方法对总RNA进行提取及cDNA合成。另外，还准备未添加逆转 录酶而进行调整的样品，用作阴性对照。另外，使用在RNA提取时得到的 DNase处理前的核酸溶液的一部分，准备总DNA溶液。以得到的总DNA溶 液及cDNA溶液作为模板，使用2种引物(CGAGGTACCATACACCTGTGGC TT(序列号12)和GCATCTGAGTTTGACTTCATGTTG(序列号13))在以下的反 应条件下进行PCR。

94℃    2分钟

94℃    30秒钟

60℃    30秒钟

(将94℃、30秒钟和60℃、30秒钟进行35个循环)

利用限制酶HpyCH4V(New England Biolabs株式会社)对PCR产物(130bp) 在37℃下处理一夜后，使用3％Metaphor Agarose(TAKARA-BIO株式会社) 进行电泳。

在将日本晴的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物 被HpyCH4V切断，与此相对于，在将No.240的总DNA溶液及cDNA溶液 用作模板的情况下，PCR产物未被HpyCH4V切断(图9A)。由上可以确认， 通过本方法，可以识别来自日本晴等位基因的PCR产物和来自长雄野生稻等 位基因的PCR产物。

因此，比较使用F1的样品进行HpyCH4V处理后的条带图案，结果显示， 将cDNA溶液用作模板的情况与将总DNA溶液用作模板的情况相比，未被 HpyCH4V切断的PCR产物的比率高。根据本结果，显示向日本晴导入了长 雄野生稻基因的取代系统的F1与源自日本晴的PRR7的等位基因表达量相 比，源自长雄野生稻的PRR7的等位基因的表达量较多(图9B)

实施例7：长雄野生稻的PRR启动子及PRR基因在玉米中的效果

将实施例2中制备的Fr4片段(包含长雄野生稻的PRR7启动子及PRR7 结构基因)转化于玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。

将大小约1.2mm的玉米未成熟胚(品种：A188)从温室栽培的植物中无菌 取出并浸渍于土壤秆菌悬浮用液体培养基(LS-inf、Ishida et al.2007)。在46℃ 下热处理3分钟后，在相同液体培养基中将未生成熟胚清洗1次。接着，进 行15,000rpm、4℃、10分钟的离心处理。将离心处理后的未熟胚浸渍于 LS-inf-AS培养基(Ishida et al.2007)中，所述培养基中以约1×10⁹cfu/ml悬浮 具有实施例2中制备的Fr4构建体的土壤秆菌LBA4404。搅拌30秒，在室温 下静置5分钟后，着床于共培培养基(LS-AS、Ishida et al.2007)，在25℃、 黑暗下培养7天。

将进行了共培培养后的未成熟胚着床于含有潮霉素的选择培养基 (LSD1.5A及LSD1.5B、Ishida et al.2007)，在25℃、黑暗下进行培养。将增 殖的愈伤组织切成小片，着床于潮霉素再分化培养基(LSZ、Ishida et al.2007)， 在25℃、照明下培养2周。将再分化的植物着床于生根培养基(LSF、Ishida et  al.2007)，在25℃、照明下培养2周。将生根的植物移植于温室内的罐中进行 栽培。

抽出的雄穗在开花前拔出进行去雄。将从未转化的玉米(品种：A188)中 采集的花粉与从雌穗中充分长出的须进行交配。收获包被枯萎的雌穗，在30℃ 下干燥2周后，将种子脱粒。可以从44个个体中采种。

从T0个体受精的穗中按照从大到小的顺序选择11个个体，以T1代进行 产量相关性状的评价。试验分成3次(第1次：5个系统、第2次：3个系统、 第3次：3个系统的合计11个系统)进行。在容量360ml的聚乙烯制罐中，1 个系统各播种1粒(第1次试验为16粒、合计16罐、第2次及第3次试验为 25粒、合计25罐)。播种约2周后，切取叶的一部分，浸渍于潮霉素溶液， 调查潮霉素的抗性/敏感性。使潮霉素抵抗性和敏感性的个体为一对并调整个 体数量使其能够评价产量性状，移植于容量5100cc的聚乙烯制罐中继续栽 培。植被高度在播种14天后至56天后每周进行测定。将抽出的雄穗在开花 前拔除进行去雄。记录须从雌穗中抽出的日期，并且将从未转化玉米(品种： A188)中采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获穗后，测定雌穗 长、每列粒数、穗重。对各系统进行潮霉素抗性个体(基因持有个体)和潮霉素 敏感性个体(基因缺失个体)的产量相关性状的比较。其结果，可知在全部11 个系统中的2个系统(T1-No.4、T1-No.6)中，抗性个体与敏感性个体相比，雌 穗长、每列粒数、穗重这3个性状变大(表9、图10)。并且，系统T1-No.4在 接种第35天以后，抗性个体与敏感性个体相比，植被高度变高，表明从营养 生长期开始生长旺盛。

如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子可操作地连接的PRR7 基因不仅使稻的产量增大，还使玉米的产量增大。另外，表明营养生长期的 生长液旺盛。

[表9]

效果得到确认的2系统的产量相关性状的数据

实施例8：源自长雄野生稻的PRR基因的cDNA构建体在玉米中的效果

将实施例5中制备的源自长雄野生稻的PRR7基因的cDNA构建体(以下 为Longi构建体)转化至玉米品种，以T1代进行产量相关性状的评价。

依据实施例7中记载的方法，将Longi构建体转化至玉米品种。得到的 转化体移植于温室内的罐中进行栽培。T0植物的雄穗在开花前拔除进行去雄， 将从未转化的玉米(品种：A188)中采集的花粉与从雌穗中充分抽出的须进行 杂交。收获包被枯萎的雌穗，在30℃下干燥2周后，将种子脱粒。从T0个 体受精的穗中选择可充分确保着粒数的18穗，以T1代进行产量相关性状的 评价。试验分成3次(每次6个系统)进行。在容量360ml的聚乙烯制罐中各接 种1系统、25粒。作为对照，未转化的玉米(品种：A188)也同样地进行播种。 播种约2周后，切取叶的一部分，浸渍于潮霉素溶液，调查潮霉素的抗性、 敏感性。使潮霉素抵抗性和敏感性的个体为一对并调整个体数量，使其能够 评价产量性状，移植于容量5100cc的聚乙烯制罐中继续栽培。植被高度在接 种14天后至56天后每周进行测定。抽出的雄穗在开花前拔除进行去雄。记 录从雌穗中的须抽出日，并且将从未转化玉米(品种：A188)中采集的花粉与 从雌穗中充分抽出的须进行杂交。收获穗并干燥后，测定雌穗长、每列粒数、 穗重。对各系统进行潮霉素抗性个体(基因持有个体)和潮霉素敏感性个体(基 因缺失个体)的产量相关性状的比较。对潮霉素敏感性个体(基因缺失个体)未 分离的系统进行与非重组的A188的比较。

其结果，显示在全部18个系统中的2个系统(T1-cDNA No.11、T1-cDNA  No.13)中，抗性个体与敏感性个体或非重组A188相比，雌穗长、每列粒数、 穗重这3个性状分别变大(表10、图11)。在图11中，R为潮霉素抗性个体(基 因持有个体)，S为潮霉素敏感性个体(基因缺失个体)。

如上所述，可知：与长雄野生稻的PRR7启动子连接相同基因的cDNA 而成的导入基因使玉米的产量增大。即，确认到：在长雄野生稻的PRR7基 因中，通过导入不含内含子的cDNA，可得到本发明的效果。

[表10]

效果得到确认的玉米转化体2个系统的产量相关性状的数据

实施例9：将源自长雄野生稻的启动子分别与拟南芥PRR基因编码区域、高粱PRR基因编码区域连接而成的构建体的效果

使用RT-PCR从拟南芥(Columbia)中分离PRR7基因(注册号：NM120359) 的编码区域，按照实施例5中记载的方法，通过与实施例5中制备的构建体 的长雄野生稻PRR基因编码区域进行取代，制备目标构建体。将分离的拟南 芥PRR基因碱基序列示于序列号14，将编码的氨基酸序列示于序列号15。 接着，对于连接高粱PRR基因编码区域而成的构建体，也通过同样的方法制 备。进行NCBI blastn检索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？ PROGRAM＝blastn&BLAST_PROGRAMS＝megaBlast&PAGE_TYPE＝BlastSea  rch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)，将与长雄野生稻PRR7 基因编码区域(序列号4)同一性高的基因(注册号：XM_002465391)作为PRR 基因进行分离。使用RT-PCR从高粱(品种：Gold sorgho、KANEKO种苗)中 分离该基因的编码区域序列，通过与实施例5中制备的构建体的长雄野生稻 PRR基因编码区域发生取代，得到目标构建体(序列号18)。分离的源自高粱 的PRR基因编码区域与通过NCBI blastn检索而命中的序列(注册号： XM_002465391)100％一致，2295碱基(序列号16)中，编码了765氨基酸残基 (序列号17)。这些PRR基因翻译区域的氨基酸序列的相同性及同一性如图7 所示。

对于这些构建体，通过实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 “Yukihikari”的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对各构建体培育独 立的60个个体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少 的顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。

T1代对1个构建体测试18个系统(1个系统为12个个体)。播种在9月 14日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显 示抗性的个体(基因持有个体)作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用 育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐中各移植1个个体(1个系统为12个罐、 合计12个个体)。对施肥而言，在每个罐中，将N、P、K设为各0.21g、0.33g、 0.05g。作为对照，栽培“Yukihikari”。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物 Innovation Center的重组体评价专用的封闭体系温室(14小时30分钟昼长的长 昼条件)中进行。对出穗日、秆长、穗数、基秆直径、以最大穗为对象的穗长、 每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量(以下为每穗重)进行性状调查。

将结果示于表11。首先，对拟南芥构建体观察全部18个系统的平均值， 与对照“Yukihikari”相比，秆长、每穗粒数、每穗重、基秆直径降低，认为没 有产量增大效果。接着，对于高粱构建体，与对照“Yukihikari”相比，发现秆 长、穗长、每穗粒数大致相同，但每穗中、基秆直径降低，未确认到产量增 大效果。

[表11]

结合了长雄野生稻PRR启动子的cDNA构建体的产量相关性状的评价

实施例10：源自长雄野生稻的PRR启动子和GUS基因的连接构建体

制备源自长雄野生稻的PRR7启动子和GUS基因的嵌合构建体，并调查 有无转录。如图12所示，制备在长雄野生稻的PRR7启动子区域的相邻下游 连接GUS基因而成的构建体。长雄野生稻PRR7基因的启动子区域具体而言 分别连接转录起始点上游区域200个碱基(序列号1的第34845-35044号碱基)、 2000个碱基(序列号1的第33045-35044号碱基)，制备构建体P200、构建体 P2000。制备不具有PRR7基因启动子区域的构建体P0也作为对照用。

使用制备的构建体进行栽培稻“Yukihikari”的转化。从植被高度生长至约 10cm的转基因稻的幼苗中对各构建体提取4个个体的根，并分别进行取样。 通过实施例5中记载的方法进行总RNA提取及cDNA合成。以得到的cDNA 溶液作为模板，通过PCR法调查GUS基因是否被转录。引物对设计于GUS 基因编码区域内所导入的内含子序列(190碱基)的两外侧。即，若存在受到转 录的剪接机制作用的成熟mRNA，则检测为450碱基的PCR扩增产物。其结 果，确认到在P200和P2000的转化体中存在转录活性(图13)。另外，在对照 的P0中，无法确认到源自成熟mRNA的PCR扩增产物。由上显示，P200和 P2000在植物体内均具有启动子活性。

实施例11：长雄野生稻PRR基因的表达分析

将于“Shiokari”中仅导入了长雄野生稻的第7染色体末端区域而成的系统 “No.240”在人工气象室中在光周期14小时30分钟(26℃)、暗期9小时30分 钟(20℃)的长昼条件下栽培4周。从4个个体中对光周期开始后0小时(0h)和 6小时(6h)的最新的完全展开叶分别进行取样。通过实施例5中记载的方法进 行总RNA提取及cDNA合成。以得到的cDNA溶液作为模板，通过非专利 文献13(Ogiso et al.)中记载的方法进行实时荧光定量PCR(real-time PCR)。 PRR7基因表达量以相对于同一样品的肌动蛋白基因表达量的相对值表示。其 结果，在光周期开始后0小时(0h)，PRR7基因表达量在0.21-0.32(平均0.27) 的范围，与此相对，光周期开始后6小时(6h)，可得到13.69-18.43(平均16.31) 这样的值(图14)。因此，显示长雄野生稻PRR7基因启动子不是组合型，而是 光诱导表达。

实施例12：将源自高粱的PRR启动子和高粱PRR基因编码区域连接而成的构建体的效果

通过PCR从高粱(品种：Gold sorgho、KANEKO种苗)中对实施例9中分 离的高粱PRR基因的启动子区域中的DNA片段进行扩增。使用得到的DNA 片段中的序列号19所示的序列取代实施例9中得到的构建体(序列号18)的 1-9046所示的序列，由此得到目标构建体(以下为“高粱构建体”)。

对于该高粱构建体，依据实施例5中记载的方法进行三亲交配及稻品种 “Yukihikari”的转化。转基因稻在驯化后，在温室下栽培。对得到的形状体(T0) 培育60个个体，采种T1种子。按照采种量从多到少的顺序选择18个个体， 供于T1的评价试验。

在T1代中，对18个系统(1个系统为12个个体)进行测试。接种在9月 14日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显 示抗性的个体(基因持有个体)作为移植的对象。在9月28日，在放入有稻用 育苗土的容量570ml的聚乙烯制罐中各移植1个个体(1个系统为12个罐、 合计12个个体)。对施肥而言，在每个罐中，将N(氮)、P(磷)、K(钾)各设为 0.21g、0.33g、0.05g。作为对照，栽培“Yukihikari”。栽培在日本Tobacco产业 株式会社植物Innovation Center的重组体评价专用的封闭体系温室(14小时30 分钟昼长的长昼条件)中进行。对出穗日、秆长、穗数、基秆直径、以最大穗 为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量(以下为每穗重)进行 性状调查。

将结果示于表12。对高粱构建体而言，全部18个系统中的2个系统(系 统No.8、系统No.10)与对照“Yukihikari”相比，秆长、每穗粒数、每穗重均超 出。因此，在高粱构建体中也发现产量提高效果。

[表12]

连接高粱PRR启动子和高粱PRRcDNA而成的构建体的产量相关性状的 评价