传感器在侧流免疫分析中的集成和其应用

摘要

用于确定样品中的分析物的浓度的侧流免疫分析装置和用于使用这样的侧流免疫分析装置测量样品中的分析物浓度的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本发明要求在2012年10月23日提交的美国申请No.13/658,614的权 益。该申请的内容以引用方式并入。

技术领域

本发明涉及一种用于侧流免疫分析(Lateral Flow Immunoassays, LFAI's)的作为生物传感器的装置、改进这样的LFAI装置以及在诊断方法 中使用这样的LFAI装置的方法。

背景技术

最近对预测性的、预防性的和尤其个人化的医学越来越关注，其要求 具有更高保真度——例如敏感性和特异性的诊断测试。侧流免疫分析 (LFIA)装置包含这样的诊断测试并且是一种即时诊断(Point-of-Care： POC)领域中的成熟技术。低成本、相对容易制造、长货架期和容易被客 户使用是使LFIA非常有吸引力的优点中的一些。

侧流免疫分析的基本原则在图1中示出。在LFIA诊断装置的早期发展 期间，主要的焦点首先在于提供容易的是否答复的定性系统。最为人熟知 的定性侧流系统是验孕。

然而现在，对更加敏感的、定量的和复用的测量的需要越来越大，其 要求实现阅读器系统。就其本身而言，侧流免疫分析装置可以用于新市场 并且用于新应用。

毛细流动速率对于LFIA’s非常重要，因为样品中的分析物的有效浓度 随着流动速率中的增大的平方而降低。对于分析物的定量测量来说，这个 关系非常重要，因为信号强度直接与有效浓度相关。因此，样品经过分析 测试线的流动速度影响相关分析物的定量测量。例如样品粘度在正常血液 粘度变动内的30％的变化会导致直到70％的信号变动。

不同样品——例如血液样品的粘度可能显著不同。样品粘度(和因此 毛细流动速率)中的显著变动通常不影响验孕性能；然而，当要测试生物 标志物值——比如浓度并且将其与其之前的值进行比较时，分析物/生物标 志物的定量化非常重要。

在LFIA’s中，由毛细力驱使样品流动穿过膜。吸收剂材料/膜的孔大小 和样品粘度是两个对样品穿过系统的流动速度具有直接影响的参数。至于 流动速度/速率，在制造过程期间对LFIA的膜的损坏会引入多种不利地影 响流动行为的人为因素。例如，膜与垫衬物(或胶布)的分离导致样品快 速向下流到膜的边缘的无障碍的路径。这会导致凹流和测量中的伪差。

印刷电子术包括允许在极其多样的衬底——比如纸或织物上创建电路 的特定印刷方法。印刷电子术的优点是它们容许电系统的低成本、高容量、 高吞吐量生产。尤其对于小的、不贵的和用后即弃的装置，这项技术在使 用LFIA’s来提高量化诊断测试的可靠性方面可以是非常有利的。这使得印 刷电子术对一次性使用的生物传感器的领域非常有吸引力。

Jolke Perelaer等人著的《Inkjet-printed silver tracks:low temperature  curing and thermal stability investigation》(Journal of Materials Chemistry， 2008，第18卷，第3209-3215页)描述了在低温下喷墨印刷。印刷低温固 化材料的可能性增大了电极可以印刷在其上(例如印刷在温度敏感的硝化 纤维膜上)的可用材料的数量。其他印刷方法——比如卷对卷印刷和冲压 也是可能的。

一些其他影响在侧流测试中产生的信号的关键因素包括溶液的温度和 离子强度(包括pH)。包括测量和影响这样的条件的传感器和执行器在减 小所产生的信号中的变动方面也是重要的。

发明内容

包括至少一个电传感器的侧流免疫分析装置可以测量一个或更多个影 响样品中的相关分析物的信号强度的参数。侧流免疫分析装置中的集成印 刷电传感器可以测量这些参数，它们包括例如样品在当流动经过装置时的 流动速率、流形态、温度或离子浓度。

在一种实施例中，提供一种用于测量分析物的侧流免疫分析装置，其 具有包括用于提供毛细流的吸收剂材料的载体，其包括：

a)用于接收样品的样品部；

b)包括缀合微粒材料的缀合部；

b)包括用于分析物的结合剂的诊断部；

c)用于提供毛细流的吸收剂材料的吸收剂部；和

d)至少一个电传感器。

其中样品部、缀合部、诊断部和吸收剂部以毛细流连接，样品由此流动经 过诊断部中的结合剂以提供样品和结合剂之间的接触。

侧流免疫分析装置中的所述至少一个电传感器连接到用于计算与样品 相关的一个或更多个参数的处理单元上。所计算的参数是那些影响来自结 合标记分析物复合物的信号的强度，借以影响样品中的分析物的浓度的计 算。例如样品的这样的参数包括样品经过诊断部的流动速率、样品经过诊 断部的流形态、样品在诊断部处的温度、样品在诊断部处的pH和样品在诊 断部处的离子浓度。

在另一种实施例中，提供一种确定样品中的分析物的浓度的方法，其 包括确定样品中的分析物和样品在侧流免疫分析装置中的参数，其中侧流 免疫分析装置包括包含用于提供毛细流的吸收剂材料的载体，所述侧流免 疫分析装置包括：

a)用于接收样品的样品部；

b)包括缀合微粒材料的缀合部；

b)包括用于分析物的结合剂的诊断部；

c)用于提供毛细流的吸收剂材料的吸收剂部；和

d)至少一个电传感器。

其中样品部、缀合部、诊断部和吸收剂部以毛细流连接，样品由此流动经 过诊断部中的结合剂以提供样品和结合剂之间的接触。

样品中的分析物的浓度通过确定结合在侧流免疫分析装置的诊断部上 的标记分析物的信号强度并且考虑确定用于流动经过侧流免疫分析装置的 诊断部的样品的参数中的一个或更多来计算。

附图说明

图1：侧流免疫分析装置的示意性表示。

图2：用于侧流免疫分析装置中的流动速度测量的设置的示意性表示。

图3：用于确定非均一的流形态的流形态传感器的电极对的示意性表 示。

图4：示出简单的侧流免疫分析装置用于测量样品的流形态的测量：a) 非均一的流形态电极(U2)在当流形态电极(U3)短路之前短路：b)示 出所测量的(余脉冲消除)电流信号的曲线图。

图5：示出由于样品体积的不同量：a)500μl的PBS(流前沿运动得 非常慢)：b)1000μl的PBS(膜被淹没)而不同的流动速度的测量的曲线 图。

图6：示出温度感测的曲线图。温度扫描在30℃开始到热板上的 100℃。

图7：电传感器在侧流免疫分析装置的载体上的集成的替代示意性表 示：a)电传感器在载体的与诊断部不同的部分上：b)电传感器的集成穿 过支持层/膜在诊断部的膜下方：c)电传感器集成穿过载体的诊断部的膜中 的空隙。

图8：印刷传感器在侧流装置中的集成的示意性表示。测试线路的强 度通过来自流动速度测量的数据来调整，所述流动速度测量可以由例如 CMOS传感器来执行，该CMOS传感器发送信号到显示器。

具体实施方式

电传感器可以集成到侧流免疫分析(LFIA)装置中，用于确定样品的 参数，所述参数影响测量这样的样品中的相关分析物的浓度的准确度。提 供可以集成到侧流免疫分析中的不同种类的印刷电传感器(流动速度传感 器、流形态传感器、温度传感器)。几乎每一种印刷工艺可以用于印刷这些 导电电极，例如丝网印刷、凹版印刷或喷墨印刷还有喷涂或刷涂技术。用 于这些电传感器的材料包括例如银、铂、碳、铜或金墨或浆。

由于一些导电材料溶剂能够腐蚀用在LFIA的诊断部中的膜(尤其是硝 化纤维)，电极也可以施加在系统的不同的部分上(例如在硝化纤维膜下方 背衬上——穿过背衬)。例如在图7中示出用于将印刷电极传感器集成在 LFIA装置中的特定替代方案。这些替代方案包括在膜下方的背衬或支撑材 料上印刷电极，其中电极可以穿过背衬或载体材料。如同例如在图7b中举 例示出的那样，其中电极可以容易地穿过背衬连接。替代地，在诊断部(诊 断膜)上或在LFIA装置的这样的诊断部的间隙中印刷电极。在另一种替代 方案中，电极不是印刷电极但包括施加到LFIA装置的不同部分中的一个或 多个上的非印刷电极或者穿过所述不同部分中的一个或多个的非印刷电 极。

同样地，提供一种用于测量分析物的侧流免疫分析装置，其具有包括 用于提供毛细流的吸收剂材料的载体，其包括：

a)用于接收样品的样品部；

b)包括缀合微粒材料的缀合部；

b)包括用于分析物的结合剂的诊断部；

c)用于提供毛细流的吸收剂材料的吸收剂部；和

d)至少一个电传感器，

其中样品部、缀合部、诊断部和吸收剂部以毛细流连接，样品由此流动经 过诊断部中的结合剂以提供样品和结合剂之间的接触。样品中的分析物(和 缀合物)与结合剂的位于诊断部的测试线上的结合会导致在该地点处产生 的信号。所产生的信号的强度是施加在装置的样品部上的样品中的相关分 析物的浓度的指标。

在这样的装置中，样品部、缀合部、诊断部和吸收剂部可以置于单一 载体或背衬材料上。该载体或背衬材料可以是柔韧的但是惰性的并且提供 足够的支持来维持样品穿过吸收剂材料的不同部分的毛细流。

侧流免疫分析装置的诊断部可以使用膜来准备。这样的诊断膜例如可 以从硝化纤维膜、聚偏二氟乙烯膜、(可选地)荷电尼龙膜和聚醚砜膜中选 择。诊断膜进一步包括用于分析物的固定的结合剂。这样的结合剂可以是 任意分子或生物分子，分析物这样与所述分子或生物分子相互作用以便产 生固定到诊断膜上的结合剂分析物复合物。这样的结合剂的示例可以是抗 体、抗原、蛋白质、酶或其部分、基质或其部分、肽、DNA或RNA。

优选地，集成在这样的LFIA装置中的电传感器为印刷电传感器。该电 传感器可以具有一个或更多个印刷在LFIA装置的载体上的电极对。电极对 的印刷可以在载体的样品部、诊断部和/或吸收剂部中的任一个上。优选地， 电极印刷在装置的包含用于与分析物相互作用的结合剂材料的诊断部上。 替代地，所实施的电极为非印刷电极。

电传感器可以连接到用于计算样品的一个或更多个参数的处理单元 上。这样的处理单元可以包括例如用于处理所获得的数据、确定样品的相 关参数的值和计算在LFIA装置的诊断部/膜上探测的分析物的浓度的 CMOS单元。样品的这样的参数可以是样品经过诊断部的流动速率、样品 经过诊断部的流形态、样品在诊断部处的温度、样品在诊断部处的pH和/ 或样品在诊断部处的离子浓度。

附加地，处理单元优选包括显示屏，例如用于显示样品中的分析物的 浓度或分析物的相关的任何其他所测量或所计算的值。此外，处理单元可 以集成在LFIA装置中或者处理单元在外部连接到LFAI装置上。

在一种实施例中，LFAI装置设有流动速度传感器，该流动速度传感器 包括至少一个、优选至少两个集成在侧流装置的诊断部上的电极对。在一 种这样的实施例中，使用两个电极对，其中一个电极对在流动方向上位于 诊断部上的测试线前面，并且第二电极对在流动方向上位于诊断部的测试 线后面。相应的电极之间的电阻测量提供关于样品的流动速度的信息。当 样品经过电极对时，电阻会由于样品(流体)与干测试带或诊断膜的导电 性相比更高的导电性而降低。图8示出这样的传感器系统是怎样包括到侧 流免疫分析装置中的示例。例如，可以通过从流动速度测量所获得的信息 来调整来自色彩或者荧光测量的信息。所述调整例如可以通过CMOS传感 器来完成。

用于分析物的标记/信号读取和样品的流动速率的组合补偿例如粘度 变化的影响。

在另一种实施例中，LFIA装置设有流形态传感器。流形态传感器包括 集成在侧流免疫分析装置的诊断部上的电极对，如同例如在图3中示出的 那样。多个电极对相互并排地施加成与样品经过LFIA装置的流动方向垂直 的阵列。根据所期望的分辨率可以在诊断部/膜上集成任意数量的电极。仅 有的限制是诊断部/膜的宽度和电极的宽度。当流形态为非均一的时，几个 电极会比其他电极更早地短路。例如，在诊断膜上出现凸的流形态的地方， 诊断部/膜的中间的电极会比外部的电极更早地短路。可以测量电流信号中 的这些变化。通过汇编来自多个电极对的数据可以确定流形态的几何形状， 所述几何形状然后可以用于获得关于沿着反应线的信号强度的重要信息。

附加地，溶液温度的变化与流动速度相关。因此，在又一实施例中LFIA 装置设有温度传感器。温度传感器可以集成在侧流装置的任何膜上。通过 在定义范围内施加导电性材料电阻的定义结构，温度传感器可以集成在装 置上。随着变化的温度，(印刷)电子温度传感器的电阻也会以定义的方式 改变。

此外，在一种具有至少一个、优选至少两个温度传感器和加热元件的 实施例中，也可以在装置已经潮湿时——比如在具有连续流的装置中测量 流动速率。如同在在此所描述的那样，电子的、这里温度传感器中的电阻 差提供样品在LFIA装置上的流动时间的测量，由所述测量可以得到流动速 率。在这样的实施例中，在具有例如连续流的装置中，在流动方向上位于 测试线或诊断部前面的加热元件提高(样品)流体的温度。这可以通过温 度传感器来测量。提高温度的(样品)流体经过LFIA装置在预先确定的距 离上的流动导致可以借助这样的温度传感器测量的差。由所确定的流动时 间可以获得流动速度/速率。类似地，这样的温度传感器的阵列的组合可以 用于测量这样已经潮湿的装置中的流形态。在这样的实施例中，具有至少 一个温度传感器和一个加热元件的LFIA装置包括垂直于流动方向位于 LFIA装置中的温度传感器的阵列。如同所描述的那样，通过这样的传感器 阵列的温度传感器中的一个测量的电阻中的变化提供由该温度传感器定义 的区域中的流动时间的测量。来自传感器阵列的不同流动时间的组合提供 样品经过LFIA装置的流形态的测量。

对于所描述的实施例中的任一个，处理单元将从电子传感器中的电子 对获得的值转化为样品的参数的测量值。余脉冲消除可以用于消除可能发 生的信号变化，以防万一。尤其当存在非常小的样品体积可用时，电流信 号会比存在大量样品体积可用时增加得慢得多地达到其最大值(见图5)。 在作为侧流免疫分析装置的毛细流装置中，样品经过包括测试线中的用于 分析物的结合剂的诊断部的流动速度/速率与毛细流时间负相关。印刷电传 感器可以确定毛细流动时间、样品穿过诊断部的吸收剂部运动定义长度所 需要的时间。毛细流时间与样品经过LFIA装置的流动速度/速率负相关。

此外，样品中的分析物的有效浓度与流动速率中的变化的平方负相关。 相应地，在确定样品中的分析物的浓度时对样品的流动速度/速率的调整 中，标定算法可以用于访问一个查找表，所述标定基于用于制造LFIA装置 并且用于使用这样的LFIA装置待测试的样品的标准溶液的(吸收剂)材料 预先确定的。

根据所述实施例中的任一个的用于LFIA装置的传感器和执行器可以 使用印刷电子装置(例如导电油墨和温度敏感材料)来准备。如同所讨论 的那样，它们可以或者直接印刷在(例如)硝化纤维上、背衬材料上，或 者直接印刷在附加在装置上的顶层上。同样地，在一种替代的实施方式中， 非印刷电极可以或者直接施加到吸收剂材料(比如硝化纤维膜)上或者穿 过装置的背衬材料。电子集成电路的接口可以通过使用柔性电路或类似技 术来制造。

在另一种实施例中，提供一种确定样品中的分析物的浓度的方法，其 包括确定样品中的分析物和样品在侧流免疫分析装置中的参数，其中侧流 免疫分析装置包括包含用于提供毛细流的吸收剂材料的载体，所述侧流免 疫分析装置包括：

a)用于接收样品的样品部；

b)包括缀合微粒材料的缀合部；

b)包括用于分析物的结合剂的诊断部；

c)用于提供毛细流的吸收剂材料的吸收剂部；和

d)至少一个电传感器，

其中样品部、缀合部、诊断部和吸收剂部以毛细流连接，样品由此流动经 过诊断部中的结合剂以提供样品和结合剂之间的接触。

在图1中示出包括样品部(2)、缀合部(3)、诊断部(4)和吸收剂部 (也被称为吸液部)(5)的载体(1)。样品(10)施加到侧流免疫分析(LFIA) 装置的样品部(2)上。样品通过毛细流的方式向装置的吸收剂材料(5) 流动。当经过缀合部(3)时，微粒缀合材料的标记与分析物相互作用形成 复合物。这样的复合物继续通过毛细作用流动经过LFIA装置的诊断部(4)。 测试线(6)上的结合剂与样品中的相关分析物相互作用并且使分析物和缀 合微粒物质位置固定在测试线(6)上，测量该标记(缀合微粒物质)的强 度来确定样品中存在的分析物的浓度。

具有电极对(U1和U2)的、位于载体或载体的一部分——比如LFIA 装置的诊断部(4)上的电传感器如同在图2中那样可以用于确定样品的参 数，比如样品经过LFIA装置的诊断部(4)的流动速度/速率。可以使用处 理单元(20)来计算流动速度，该处理单元可以包括不同的组件——诸如 例如印刷控制板(21)、数据获取板(22)和计算机程序(23)。在图3中， 多个这样的具有电极对(U2，U3，U4，U5，U7，U8和U9)的电传感器 的阵列与电极对(U1)一起印刷在LFIA装置的诊断部(4)上用于确定样 品经过诊断部(4)的流形态。同样地，电极对(U2和U3)的阵列与电极 对(U3)一起在图4a中用于确定样品经过诊断部(4)的流形态。

在图7中，印刷电极对(U1和U2)可以集成在载体的不同于诊断部 (4)的部分上，比如在7a中电极对(U1)印刷到样品部(2)上并且电极 对(U2)印刷到吸收剂部(5)上的地方。在替代方案中，在图7b中电极 对(U1和U2)印刷在以诊断部(4)的硝化纤维膜覆盖的背衬或载体(1) 上。电极对(U1和U2)可以穿过背衬/载体(1)。在图7c中示出另一替代 方案，其中印刷电极对(U1和U2)印刷在诊断部(4)的硝化纤维膜中的 间隙中。这些实施例的其他变型方案也可以是可能的。

印刷传感器在侧流免疫分析装置中的集成可以如同在图8中那样。电 极对(U1和U2)印刷在侧流免疫分析装置的诊断部(4)上。测量来自测 试线(6)的信号强度——比如色彩强度或荧光强度并且将其与来自电极对 (U1和U2)的测量值一起由处理单元(20)计算，该处理单元可以包括 CMOS传感器(30)和集成的或外部的显示屏(40)。

示例

侧流免疫分析使用以下材料来准备。诊断膜(Hiflow Plus HFB 13504)、 缀合板(G041玻璃纤维缀合板)和吸收剂板(C083纤维素吸收剂)都来 自Millipore。样品板(CF5)来自Whatman。缀合板的准备使用S.Wang等 人的《Development of a colloidal gold-based lateral flow immunoassay for the  rapid simultaneous detection of zearalenone and deoxynivalenol》(Anal. Bioanal.Chemistry，2007)的方案来完成。处理硝化纤维诊断膜的方案在 《Lateral Flow Tests》(Technote，Bangs Laboratories.Inc.2008)中描述。

示例1(流动速度传感器)

使用艺术笔刷将导电银墨(DuPont 4929N)施加到经处理的硝化纤维 膜上。电极连接到印刷电路板(PCB)上(见图2)。v＝1V的固定电压施 加到每一个电极对之间并且通过PCB上的仪表放大器测量相应的电流。来 自National Instruments的数据获取板用作PCB和计算机(Matlab- Mathworks)之间的接口。

具有不同粘度的两种不同的溶液(PBS，硝酸盐缓冲液，和甘油以1:3 稀释在PBS中)施加在LFIA的样品板上。1:3PBS甘油的溶液降低流动速 度至以纯PBS溶液测量的流动速度的大约1/4。

为了说明错误的样品施加在流动速度上的影响，将非常小的样品体积 (500μl)和大的样品体积(1000μl)相互比较。小体积的样品的流前沿沿 着诊断膜非常慢地运动(v≈3cm/min)，而大体积的样品的流前沿非常快地 运动(v≈1cm/min)并且甚至浸没了膜。图5示出流速度测量的结果。

示例2(流形态传感器)

使用艺术笔刷将导电银墨(Dupont 4292N)施加到经处理的硝化纤维 膜上。所使用的设置在图4a中示出，其中多个电极对施加到经处理的硝化 纤维膜上。通过在样品板的左边施加大得多数量的样品体积有意地造成非 均一的流形态。所造成的流形态看起来类似于在图4a中表明的流形态。结 果(余脉冲消除)在图4b中示出。由于非均一的流前沿，电极2在电极3 短路之前短路。

示例3(温度传感器)

导电铂墨(DuPont BQ321)印刷在LFIA的样品板上。电阻设置为室 温下110Ω。热板的温度缓慢地增加到100℃。观察到类似于标准铂Pt100 温度传感器的电阻的增大。