一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法

摘要

本发明涉及制备方法，特别涉及一种酵母细胞短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法，该方法以酿酒酵母为原料，首先对酵母菌体多次离心洗净，洗净后的菌体分散调浆，进行酶解自溶，离心，取上清喷雾干燥制备酵母短肽，沉淀进行高温抽提制备甘露聚糖和β-葡聚糖；高温抽提后离心可以得到上清液和沉淀两部分；上清液经过浓缩、醇沉、干燥得到甘露聚糖；下层沉淀经过高速分散、酶解和高压微射流均质处理得到β-葡聚糖，所采用的制备条件温和，不采用强酸、强碱和有机溶剂等对环境有害的试剂，且可实现产业化规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及制备方法，特别涉及一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖 的同步制备方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种含有丰富营养物质 的工业副产物，含有50％左右的蛋白质，人体必需的八种氨基酸含量 均很高。酿酒酵母细胞壁中含有25％～35％的多糖，主要为β-葡聚糖 (约29％)和甘露聚糖(约31％)(Bacon et al，1969；Fleet et al， 1976；Kath et al，1999)，其中，β-葡聚糖的主要生理功能是维持细 胞壁的结构，保持细胞正常的生理形态；而甘露聚糖则主要负责细胞 识别和与环境的交互作用，决定酵母的免疫特性(Ruiz-Herrera， 1992)。

酵母蛋白氨基酸比例协调，用蛋白酶酶解酵母蛋白可以获得具有 高生物活性的短肽制品；β-葡聚糖位于细胞壁的最内层，而甘露聚糖 存在于酵母细胞壁外层，二者通过蛋白质连接构成酵母细胞壁的基本 组成。β-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成(葡萄糖残基通过 β-1,3-糖苷键和β-1,6-糖苷键组成(刘红芝等，2006)，两者比例为85:15， 以β-1,3-糖苷键为骨架，β-1,6-糖苷键为支链，并且β-1,6-葡聚糖的还 原端连接到β-1,3-葡聚糖非还原端的末端葡萄糖上，在氢键作用下共 同形成一个三维网络结构；甘露聚糖相对分子质量主要分布在20 000～200000(刘红芝等，2008)间，由α-甘露糖以α-1,6糖苷键形成 主链，并联结以α-1,2糖苷键和α-1,3糖苷键连接的数目不等的甘露糖 侧链(Cabib et al，1982)，其中一些侧链结合有一些可能是酵母细胞 抗原决定部位的基团，并且甘露聚糖携带一个分子量大概为100kDa 的蛋白。

酿酒酵母短肽的制备方法主要采用酸水解法、碱水解法和酶法 等。其中，蛋白质酸水解会造成某些氨基酸的损失，产生的蛋白质衍 生物包含非天然结构，或不能被人体代谢，甚至可能产生抑制作用和 毒性；而蛋白质经碱水解处理，会导致其中的氨基酸发生消旋作用， 使必需氨基酸的L-对映体减少和消化率降低，并产生有毒的D-氨基 酸。而酶法制备酿酒酵母短肽主要采用碱性蛋白酶，其在调节pH的 过程会大量引入盐离子，影响产品纯度；为提高产品纯度需对肽产品 进行脱盐处理，操作周期长且需要增加设备投入。

酵母细胞壁甘露聚糖的分离提取方法包括酸法、碱法、酶法及热 水浸提法等。其中，酸法会导致所得产品的蛋白含量较高，且甘露聚 糖在酸性条件下容易发生水解；碱法使用大量碱液，既会导致甘露聚 糖降解又会污染环境；酶法提取所得产品的蛋白含量较高，纯度较低， 需进一步纯化处理；热水浸提所得产品的纯度较低，如果在浸提过程 中加入氯化钠，会导致产品盐离子含量升高。

酿酒酵母细胞壁β-葡聚糖的制备方法主要有物理法(如超声)、 化学法(如酸法、碱法和酸碱法)和生物法(如酶法)。其中，物理 法所得产品纯度较低，需要与其他方法结合以提高纯度；化学法需要 大量使用酸碱，所得产品纯度较低，且会对葡聚糖的结构造成损失， 进而破坏其生理活性；而由于生物方法作用手段温和，需要与其它方 法结合使用来提高所制备的酵母葡聚糖的纯度。

酵母短肽因很好地保留了啤酒酵母原有的营养和功能成分，可作 为功能性保健品原料而用于食品、医药及饲料行业。β-葡聚糖和甘露 聚糖作为主要的酵母细胞壁多糖具有多种功能活性，如免疫增强功 能、抗辐射和抗氧化功能以及霉菌吸附功能。发明一种酵母细胞短肽 与细胞壁多糖的绿色同步制备技术，不仅可以充分利用我国的酵母资 源，还可以进一步开发具备高功能活性的酵母短肽和多糖产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制 备方法。

为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：

一种酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法，包括如下步 骤：

(1)将酿酒酵母加入去离子水中得到悬浮液，向所述悬浮液中 加入中性蛋白酶进行酶解自溶，灭酶活后离心，得到上清a和沉淀a；

(2)将所述上清a经干燥后，即得酵母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得沉淀a1，然后 向沉淀a1中加入去离子水得到悬浮液，所述悬浮液抽提后离心，得到 上清b和沉淀b；

(4)将所述上清b浓缩，向所述浓缩后的上清b中加入乙醇进行 醇沉，离心后得沉淀，所述沉淀经干燥后即得酵母细胞壁甘露聚糖；

(5)向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，将所述悬浮液高 速分散，将经高速分散后的悬浮液进行酶解处理，灭酶后得酶解液， 然后进行高压微射流处理，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱 水后，经干燥即得酵母细胞壁β-葡聚糖。

具体的，步骤(1)中，酿酒酵母与去离子水的体积比为1：4～6。

为了充分酶解酿酒酵母细胞得到细胞壁，步骤(1)中性蛋白酶 的用量为200～300U/g，采用酶解进行诱导自溶时，酶解自溶的温度 为40～60℃，时间为20～30h，pH值为6.0～8.0(优选为7.0)。

具体的，所述中性蛋白酶选自Neutrase或/和Flavorzym。

步骤(3)的具体操作步骤为：向所述沉淀a中加入去离子水进 行离心清洗得到沉淀a1，然后按质量比1：3～10向沉淀a1中加去离 子水得到悬浮液，对所述悬浮液在90～100℃的条件下高温抽提3～6h， 抽提结束后进行离心处理，分别得上清b和沉淀b。

所述离心处理的离心转速为4000～5000rpm，离心时间为10～20 min；优选地，离心转速为4500rpm，离心时间为10min。

为了提高糖浓度，增强乙醇与糖的结合从而使糖完全沉淀，步骤 (4)中，所述浓缩后的上清b为浓缩前上清b体积的1/5～1/3；步骤 (4)中，所述加入乙醇进行醇沉的步骤为：先用体积分数为50％～75％ 的乙醇进行沉淀，采用去离子水复溶，复溶后再次使用60％～80％的 乙醇进行沉淀。

为了彻底分散沉淀b，使其与酶充分反应，提高高压微射流均质 效果，步骤(5)的具体操作步骤为：按质量比1：4～6向所述沉淀b 中加入去离子水得到悬浮液；采用高速分散器，在6000～8000rpm的 条件下处理5～10min，得高速分散悬浮液，将所述高速分散悬浮液加 入蜗牛酶或中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b 质量的0.02％～0.05％，在35～55℃的条件下酶解1～3h，灭酶后得酶解 液，所述酶解液在压力100～200MPa和处理流量为20～200mL/min的 条件下，高压微射循环处理3～6次，离心后得沉淀，所述沉淀采用无 水乙醇脱水后，经干燥即得酵母β-葡聚糖。

步骤(4)和步骤(5)干燥的温度均为40～65℃。

本申请中灭酶活处理为本领域的常规技术手段，具体的，灭酶活 的温度可为90℃，时间为10min。

本发明提供的制备方法以酿酒酵母为原料，首先对酵母菌体多次 离心洗净，洗净后的菌体分散调浆，进行酶解自溶，离心，取上清喷 雾干燥制备酵母短肽，沉淀进行高温抽提制备β-葡聚糖和甘露聚糖； 高温抽提后离心可以得到上清液和沉淀两部分；上清液经过浓缩、醇 沉、干燥得到甘露聚糖；下层沉淀经过高速分散、酶解和高压微射流 均质处理得到β-葡聚糖，本发明制得的产品纯度高(短肽、β-葡聚糖、 甘露聚糖的纯度均大于90％)，所采用的制备条件温和，不采用强酸、 强碱和有机溶剂等对环境有害的试剂，且可实现产业化规模生产。而 且本发明可实现工业副产物废啤酒酵母的综合利用，增加工业副产物 的利用率和附加价值，具有重大的经济效益和环保意义。

利用本发明的制备方法得到的产品方面具有以下优点：酵母细胞 壁短肽具有抗氧化活性，在1mg/mL浓度时，DPPH清除率达49.94％。

酵母细胞壁葡聚糖具有增强免疫的功效，在150mg/kg.d剂量时可 以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.68，是空 白对照组的2.20倍；在150mg/kg.d剂量时，小鼠NK细胞的杀伤率为 69.32％。

酵母细胞壁甘露聚糖具有增强免疫力、抑制肿瘤活性的功效。在 50mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸 光度值为0.76，是空白对照组的1.84倍，50mg/kg.d剂量时可以显著增 强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能，吞噬百分率为 20.35％；具有直接抑制HL-60肿瘤细胞生长的作用，在1.58mg/mL时 能够抑制50％的HL-60肿瘤细胞。

附图说明

图1为酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法的流程示意 图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业 途径得到。

下述实施例中的酵母细胞壁购自浙江深友生物技术有限公司。

实施例1：酵母多糖和短肽的制备

本实施例中酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法包括以 下步骤：

(1)酿酒酵母用去离子水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：6 加去离子水配制成悬浮液a，向所述悬浮液a中按加酶量200U/g加入中 性蛋白酶Neutrase，置于pH7.0和55℃的条件下在恒温去离子水浴振荡 器中酶解自溶20h，然后升温至90℃，保温10min灭酶，离心，分别 得到上清a和沉淀a；

(2)采用喷雾干燥对步骤(1)中所得上清a进行干燥即得到酵 母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然 后按质量比1：6(沉淀a1与去离子水的质量比为1：6)向沉淀a1中加 去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在90℃的条件下高温抽提3.5h， 离心，分别得上清b和沉淀b；

(4)对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行3倍浓缩(即所述浓 缩液后的体积为上清b的1/3)，所得到的浓缩液先用体积分数为50％ 的乙醇进行沉淀，采用去离子水复溶，然后使用75％体积分数的乙醇 醇沉得沉淀，将所述沉淀置于65℃的鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到 酵母甘露聚糖；

(5)对步骤(3)中所得沉淀b用去离子水洗3次去除杂质，再以 质量比1：6(沉淀b与去离子水的质量比为1：6)加去离子水配制成 悬浮液，采用高速分散器在8000rpm条件下处理5min，得高速分散悬 浮液，然后在高速分散悬浮液中加入蜗牛酶进行酶解，酶的添加量为 所述沉淀b质量的0.02％，于45℃酶解3h，升温至90℃，保温10min进 行灭酶处理；灭酶后的酶解液在压力200MPa和处理流速150mL/min 下循环处理3次，离心后得沉淀；将所述沉淀用无水乙醇溶液脱水， 然后在鼓风干燥箱中于65℃的条件下烘干，粉碎即得到酵母β-D-葡聚 糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.29％；β- 葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.89％；酵母甘露聚糖为白色 粉末，甘露聚糖含量为94.60％。

实施例2

本实施例中酵母短肽与酵母细胞壁多糖的同步制备方法包括以 下步骤：

(1)酿酒酵母用去离子水洗涤后离心去除杂质，按体积比1：4 加去离子水配制成悬浮液a，按加酶量200U/g加入中性蛋白酶 Neutrase，置于pH 7.0和55℃的条件下酶解自溶24h，升温至90℃， 保温10min灭酶，离心，分别得上清a和沉淀a；

(2)采用喷雾干燥对步骤(1)中所得上清a进行干燥即得到酵 母短肽；

(3)向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然 后按质量比1：4(沉淀a1与去离子水的质量比为1：4)向沉淀a1中加 去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在95℃的条件下高温抽提3.0h， 离心，分别得上清b和沉淀b；

(4)对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行5倍浓缩(即所述浓 缩后的体积为上清b的1/5)，得浓缩液，所得到的浓缩液先用70％乙醇 进行沉淀，复溶后使用相同积分数的乙醇醇沉，离心后得到沉淀，对 所述沉淀置于65℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖；

(5)对步骤(3)中所得沉淀b用去离子水洗3次去除杂质，再以 质量比1：4(沉淀b与去离子水的质量比为1：4)加去离子水配制成 悬浮液，再将所述悬浮液采用高速分散器在6000rpm条件下处理10 min，得高速分散悬浮液；然后在高速分散悬浮液中加入中性蛋白酶 Neutrase进行酶解，酶的添加量为所述沉淀b质量的0.05％，于50℃的 恒温去离子水浴振荡器中酶解2h，升温至90℃，保温10min进行灭酶 活处理；灭酶后的酶解液在压力150MPa和处理流速200mL/min下循 环处理6次，离心后得沉淀，将所述沉淀用无水乙醇溶液脱水后，置 于鼓风干燥箱中于50℃条件下烘干粉碎即得到酵母β-葡聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽纯度为90.72％，β- 葡聚糖为乳白色粉末，葡聚糖纯度为93.75％；酵母甘露聚糖为白色粉 末，甘露聚糖纯度为90.70％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中酿酒酵母与去离 子水的体积比为1：5，中性蛋白酶Flavorzyme的用量为300U/g，采用 酶解进行自溶时，温度为40℃，时间为30h，pH值为8.0。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为90.46％；β- 葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.42％；酵母甘露聚糖为白色 粉末，甘露聚糖含量为93.84％。

实施例4

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的具体操作步骤 为：向所述沉淀a中加入去离子水进行离心清洗得到沉淀a1，然后按 质量比1：3向沉淀a1中加去离子水得到悬浮液，对所述悬浮液在 100℃的条件下高温抽提6h，抽提结束后进行离心处理，分别得到上 清b和沉淀b。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.13％；β- 葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为91.08％；酵母甘露聚糖为白色 粉末，甘露聚糖含量为90.32％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(4)的主要操作步骤为： 对步骤(3)中所得上清b在70℃下进行4倍浓缩(即所述浓缩后的体 积为上清b的1/4)，得浓缩液，所得到的浓缩液先用60％乙醇进行沉淀， 复溶后再次使用相同体积分数的乙醇醇沉，离心后得到沉淀，对所述 沉淀置于鼓风干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.06％；β- 葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为94.68％；酵母甘露聚糖为白色 粉末，甘露聚糖含量为91.13％。

实施例6

本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(5)的具体操作步骤为： 按质量比1：5向所述沉淀b中加入去离子水得到悬浮液，采用高速分 散器，在6000rpm的条件下处理10min，得高速分散悬浮液，将所述 高速分散悬浮液加入中性蛋白酶Neutrase进行酶解，酶的添加量为所 述沉淀b质量的0.05％，在55℃的条件下酶解2h，灭酶后得酶解液，所 述酶解液在压力100MPa和处理流量为100mL/min的条件下，高压微 射循环处理4次，离心后得沉淀，所述沉淀采用无水乙醇脱水后，经 干燥即得酵母β-葡聚糖。

本实施例制备的酵母短肽为乳白色粉末，短肽含量为92.21％；β- 葡聚糖为乳白色粉末，β-葡聚糖含量为90.61％；酵母甘露聚糖为白色 粉末，甘露聚糖含量为94.36％。

实施例1～6制备得到的产品方面具有以下优点：酵母细胞壁短肽 具有抗氧化活性，在1mg/mL浓度时，DPPH清除率达49.94％。

酵母细胞壁葡聚糖具有增强免疫的功效，在150mg/kg.d剂量时可 以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸光度值为0.68，是空 白对照组的2.20倍；在150mg/kg.d剂量时，小鼠NK细胞的杀伤率为 69.32％。

酵母细胞壁甘露聚糖具有增强免疫力、抑制肿瘤活性的功效。在 50mg/kg.d剂量时可以显著增强ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化率，吸 光度值为0.76，是空白对照组的1.84倍，50mg/kg.d剂量时可以显著增 强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能，吞噬百分率为 20.35％；具有直接抑制HL-60肿瘤细胞生长的作用，在1.58mg/mL时 能够抑制50％的HL-60肿瘤细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。