一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法，属于生物活性物质分离纯化技术领域，特指氯化胆碱[Ch]Cl和无机磷酸盐K3PO4组成的离子液双水相体系用于真菌多糖和蛋白质的选择性分离，其特征主要包括以下步骤：将粉碎的真菌菌丝体或子实体用石油醚脱脂后，95℃热水回流提取8 h，离心，浓缩，透析，冷冻干燥，得真菌水提物；由氯化胆碱[Ch]Cl和无机磷酸盐K3PO4组成的离子液双水相体系进行萃取分离；下层无机盐相透析，乙醇沉淀，冷冻干燥，得真菌多糖；上层离子液相用二氯甲烷萃取，浓缩，回收离子液体。本发明的离子液双水相体系适合于工业化生产活性多糖，具有绿色、快速和高效的效果，离子液体可循环使用，降低生产成本，且能普遍应用于多种真菌多糖和蛋白质的选择性分离。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法，特指离子液体氯化胆碱[Ch]Cl和无机磷酸盐K₃PO₄组成的离子液双水相体系用于真菌多糖和蛋白质的选择性分离，属于生物活性物质分离纯化技术领域。

背景技术

真菌多糖的分离纯化方法有很多，如乙醇分级沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和膜过滤等，研究者必须根据多糖的性质选择正确的分离纯化方法，才能够获得均一的活性成分。其中，乙醇分级沉淀是一种简单且行之有效的方法，但在提取多糖的同时蛋白质也随之沉淀下来，而且蛋白质含量随乙醇浓度增加而增加，这为后续多糖纯化带来一定困难。此外，离子交换色谱和凝胶过滤色谱是多糖分离纯化过程中应用最普遍的一种方法，但纯化过程具有耗时长、费用高、产品回收率低、溶剂用量大和操作繁琐等缺点，因而限制了真菌多糖的工业化应用和开发。

近年来，作为一种高效而温和的新型绿色分离体系，离子液双水相体系结合了离子液体和双水相萃取的优点，广泛地应用于蛋白质、抗生素、生物碱、药物、小分子有机化合物的分离和纯化，而且在分离过程中保持了原有生物物质的活性及构象。特别地，国内外科技工作者通过咪唑类离子液体如l-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[Bmim]BF₄）和无机盐组成的双水相体系用于多糖和蛋白质的选择性分离。然而，随着人们对离子液体研究的逐步深入，越来越多的报道发现被广泛应用的咪唑类和吡啶类离子液体对生物体具有不同程度的毒害。研究发现，胆碱类离子液体是一种生物相容性好的离子液体，且来源广泛、便宜易得。因此，利用具有生物相容性的胆碱离子液体组成双水相体系用于生物活性物质的分离具有十分重要的意义。

经检索，目前还未见利用氯化胆碱[Ch]Cl和无机磷酸盐K₃PO₄构成的离子液双水相体系用于多糖和蛋白质选择性分离的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法，以实现 “绿色”、高效、选择性分离真菌多糖和蛋白质。

为了解决以上技术问题，本发明利用胆碱离子液双水相体系用于真菌多糖和蛋白质的选择性分离，以上层离子液相中蛋白质和无机盐相中多糖提取率为指标，优化分离条件。具体技术方案如下：

一种利用胆碱离子液双水相体系分离多糖和蛋白质的方法 ，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，脱脂：将真菌菌丝体或子实体粉碎后置于索氏抽提器中，加入石油醚，沸程30~60℃，35℃回流6 h；如此脱脂两次后，自然晾干得脱脂后的真菌菌丝体或子实体；

步骤二，制备真菌水提物：将步骤一中所述脱脂后的真菌菌丝体或子实体按1:10 g/mL的料液比加入蒸馏水中，95℃回流提取8 h，再在转速为5000 rpm条件下离心10 min，浓缩，蒸馏水透析48 h后冷冻干燥得真菌水提物；

步骤三，利用离子液双水相体系选择性分离真菌多糖和蛋白质：将步骤二中所述的真菌水提物配成质量浓度为10 mg/mL的真菌水提物水溶液，取1.0 mL真菌水提物水溶液加入到双水相体系中，再置于20℃恒温水浴中振荡30 min，离心，分离上下两相即含有真菌多糖的下层无机盐相和含有蛋白质等杂质的上层离子液相；

所述的双水相体系由离子液体氯化胆碱[Ch]Cl、无机磷酸盐K₃PO₄和蒸馏水组成，所述离子液体氯化胆碱[Ch]Cl、无机磷酸盐K₃PO₄和蒸馏水的质量比例为：0.25-0.5 :0.7-1.0 :1.0；

步骤四，制备真菌多糖：将步骤三中所述的含有真菌多糖的下层无机盐相蒸馏水透析48 h，利用浓度为95%的乙醇对真菌多糖透析液进行沉淀；所述乙醇的体积是真菌多糖透析液的4倍；4℃静置过夜，再在转速为5000 rpm的条件下离心 10 min，收集沉淀物后冷冻干燥，得真菌多糖；

步骤五，回收离子液体：将步骤三中所述含有蛋白质等杂质的上层离子液相用二氯甲烷萃取3~5次，二氯甲烷相浓缩时温度≤45℃，回收离子液体[Ch]Cl。

所述真菌为桑黄、香菇、灵芝、灰树花、冬虫夏草、金针菇、杏鲍菇中的任一种。

本发明具有有益效果。本发明通过将由[Ch]Cl/K₃PO₄组成的离子液双水相体系用于真菌多糖和蛋白质的选择性分离，以上层离子液相中蛋白质和无机盐相中多糖提取率为指标，从而优化了分离条件，达到“绿色”、高效、选择性分离桑黄多糖和蛋白质的目的。本发明的胆碱离子液双水相体系适合于大规模工业化生产活性多糖，离子液体可循环使用，降低生产成本，且能普遍应用于真菌如桑黄、香菇、灵芝、灰树花、冬虫夏草、金针菇和杏鲍菇等活性多糖和蛋白质的选择性分离。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本发明以上层离子液相中蛋白质的提取率和下层无机盐相中多糖的提取率来综合评价[Ch]Cl/K₃PO₄组成的离子液双水相体系选择性分离真菌多糖和蛋白质的效果。蛋白质提取率定义为上层离子液相蛋白质质量与真菌水提物中蛋白质质量的比值，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝染色法。多糖提取率定义为下层无机盐相多糖质量与真菌水提物中多糖质量的比值，多糖含量测定采用苯酚-硫酸比色法。

实施例一：以桑黄菌丝体为研究对象

步骤一，脱脂：桑黄菌丝体粉碎，脱脂棉布包裹，置于500 mL索氏抽提器中，加入200~300 mL石油醚（沸程：30~60℃），35℃回流6 h，如此脱脂处理2次，自然晾干，得脱脂的桑黄菌丝体。

步骤二，制备桑黄水提物：称取步骤一中脱脂后桑黄菌丝体100 g按1:10g/mL的料液比加入蒸馏水1000 mL，置于2000 mL圆底烧瓶中，充分搅拌均匀后，于95℃回流提取8 h。混合物用300 mL塑料离心管，5000 rpm、10 min离心，上清液合并于45℃旋转蒸发器减压蒸发，浓缩至原体积的1.5倍，蒸馏水透析48 h，真空冷冻干燥，得桑黄水提物。

步骤三，利用离子液双水相体系选择性分离桑黄多糖和蛋白质：

将1.0 mL质量浓度为10 mg/mL的桑黄水提物溶液加入到由1.0 g离子液体[Ch]Cl、2,8 g K₃PO₄和4.0 mL蒸馏水组成的离子液双水相体系中，三者的质量比为0.25:0.7:1.0。充分振荡使离子液体和无机盐完全溶解，置于20℃恒温水浴中振荡30 min，3000 rpm、10 min离心，分离上下两相。测得上层离子液相中蛋白质的提取率为75.1%，下层无机盐相中桑黄多糖的提取率为78.8%。

步骤四，制备桑黄多糖：下层含桑黄多糖的无机盐相蒸馏水透析48 h，桑黄多糖透析液用4倍体积的95%乙醇沉淀，4℃静置过夜，离心，冷冻干燥，得桑黄多糖；

步骤五，回收离子液体：上层离子液相用二氯甲烷萃取3~5次，二氯甲烷相浓缩（≤45℃），回收离子液体[Ch]Cl。

实施例二：以香菇子实体为研究对象

试验处理过程同实施例一，其不同之处在于其中离子液体[Ch]Cl 2.0 g、K₃PO₄ 4.0 g和蒸馏水4.0 mL，三者的质量比为0.5:1.0:1.0测得上层离子液相中蛋白质的提取率为86.3%，下层无机盐相中香菇多糖的提取率为55.5%。

实施例三：以冬虫夏草菌丝体为研究对象

试验处理过程同实施例一，其不同之处在于其中离子液体[Ch]Cl 1.2 g、K₃PO₄ 3.2 g和蒸馏水4.0 mL，三者的质量比为0.3:0.8:1.0，测得上层离子液相中蛋白质的提取率为85.7%，下层无机盐相中冬虫夏草多糖的提取率为71.9%。

通过以上实施例可以看出，[Ch]Cl/K₃PO₄组成的离子液双水相体系能够用于桑黄、香菇、冬虫夏草多糖和蛋白质的选择性分离，且具有绿色、快速和高效的效果。