灰黄霉素衍生物、灰黄霉素及其衍生物的抗菌活性应用

摘要

本发明涉及灰黄霉素衍生物、灰黄霉素及其衍生物的抗菌活性应用。所涉及的灰黄霉素衍生物结构式如式Ⅰ所示，所述涉及的应用上述灰黄霉素衍生物用于制备抗植物病原菌剂的应用，以及灰黄霉素用于制备抗苹果炭疽病、番茄灰霉病、番茄早疫病药物的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及灰黄霉素衍生物的化学合成和活性测定，具体涉及以灰黄霉素 为原料进行衍生物的合成并进行抗植物病原真菌活性测试。

背景技术

灰黄霉素(griseofulvin)是Oxford等在1939年从青霉菌的菌丝中分离得到 (Oxford,A.E.et al.,Biochemical Journal,1939,33,240–248)。1958年Gentkes等 发现其对豚鼠具有良好的治疗癣菌感染效果。紧接着有研究人员发现其对人的 皮肤浅层丝状真菌，特别是对小芽孢菌、红色癣菌具有良好的抑制效果并成为 第一个口服的抗真菌感染的药物(Gentles,J.C.et al.,Nature,1958,182,476- 477)，在临床上得到广泛的应用，直到今天仍在使用。其良好的抗真菌活性引 起了广泛关注，在过去有400多个灰黄霉素的同系物用于药物筛选 (M.H.et al.,Journal of Medicinal Chemistry,2009,52(10),3342-3347； Dong,N.et al.,Organic Letters.2013,15(18),4896-4899)。研究发现灰黄霉素与 其衍生物同样也具有良好的抗癌效果和抗植物病原菌活性(M.H.et al., Journal of Medicinal Chemistry.2012,55(2),652-660；(Zhao,J.H.et al.,World  Journal of Microbiology&Biotechnology 2012,28(5),2107-2112)。

发明内容

本发明提供的一类灰黄霉素衍生物结构通式为Ⅰ所示：

式Ⅰ中：R₁代表乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、卤代乙酰基或丙烯 酰基。

本发明的灰黄霉素衍生物的合成路线如下所示：

其制备方法包括：

(1)灰黄霉素、盐酸羟氨和醋酸钠在乙醇中回流反应制备中间体；

(2)中间体与酰氯在丙酮中进行室温反应制备灰黄霉素衍生物。

步骤(1)反应物经冷却后用乙酸乙酯萃取、浓缩、柱层析分离得到中间 体。

步骤(2)反应物用乙酸乙酯萃取后用无水硫酸钠干燥，浓缩、柱层析分 离得到灰黄霉素衍生物。

本发明的灰黄霉素及其衍生物具有抗植物病原菌的活性，进一步具有抗植 物病原真菌活性。特别是具有抗苹果炭疽、番茄早疫、番茄灰霉等植物病原真 菌活性。且具有活性高、毒副作用小等优点。

具体实施方式

本发明采用商业的灰黄霉素为原料通过衍生合成得到了6个抗植物病原菌 活性较高的化合物，该化合物可开发成新的农用抗生素。

本发明的灰黄霉素结构式如下：

以下实施例中灰黄霉素是从阿拉丁试剂公司购买得到的，cas号为 126-07-8，纯度为97.0％的灰黄霉素。

按照本发明的技术方案，本发明中所提到的中间体为肟化的灰黄霉素(1)， 其结构式通式如下：

其制备方法是：将灰黄霉素(3.52g，10mmol)溶于乙醇(200ml)和水 (60ml)中，然后加入盐酸羟氨(2.26g，35mmol)和三水醋酸钠(5.88g， 43mmol)进行回流。6小时后冷却至室温加入蒸馏水(50ml)再用乙酸乙酯 (3×100ml)进行萃取。最后用无水硫酸钠干燥、浓缩、用石油醚：丙酮的混 合溶液为洗脱剂通过硅胶柱层析分离纯化。最终得到中间体(1)，经核磁确认 中间体(1)存在两个同分异构体(1a)与(1b)，为淡黄色固体，收率为93％。 熔点:228.1–230.4℃；(C＝0.19in CH₃OH)；

(1a)的核磁数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.09(s,1H,H-5),5.60(s, 1H,H-3＇),4.00(s,3H,H-10),3.95(s,3H,H-9),3.53(s,3H,H-11),3.11(dd,J＝ 16.8,4.9Hz,1H,H-5＇),2.67(dd,J＝16.8,13.0Hz,1H,H-6＇),2.60–2.50(m, 1H,H-5＇),0.93(d,J＝6.7Hz,3H,H-8).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ194.3 (C-3),169.6(C-2＇),164.4(C-7a),158.4(C-4＇),157.6(C-6),155.13(C-4), 105.8(C-3a),99.4(C-3＇),97.3(C-7),91.7(C-5),89.3(C-2),57.0(C-10),56.4 (C-9),56.0(C-11),35.4(C-5＇),31.1(C-6＇),14.50(C-8)。

(1b)的核磁数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.26(s,0.7H,H-5),6.09(s, 0.7H,H-3＇),4.00(s,2.1H,H-10),3.95(s,2.1H,H-9),3.59(s,2.1H,H-11),2.99 –2.93(m,0.7H,H-5＇),2.60–2.50(m,0.7H,H-6＇),2.39(dd,J＝15.1,4.2Hz, 0.7H,H-5＇),0.92(d,J＝6.8Hz,2.1H,H-8).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ194.2 (C-3),169.6(C-2＇),164.4(C-7a),161.0(C-4＇),157.6(C-6),151.9(C-4), 105.8(C-3a),97.3(C-7),92.8(C-3＇),91.6(C-5),89.3(C-2),57.0(C-10),56.4 (C-9),56.20(C-11),36.6(C-5＇),25.6(C-6＇),14.4(C-8).分子式： C₁₇H₁₈ClNO₆,ESI-MS m/z 368.13[M+H]⁺,390.13[M+Na]⁺。

以下是发明人给出的灰黄霉素衍生物合成的实例：

实施例1：4'位乙酰肟基灰黄霉素(衍生物2)的制备

在室温下，取肟化的灰黄霉素(91.95mg,0.25mmol)溶于丙酮(5ml) 中，然后加入乙酰氯(0.26mmol)和三乙胺(35μL,0.28mmol)，反应混合物 搅拌5小时至反应完全，然后加入蒸馏水(5ml)并用乙酸乙酯(3×10ml) 进行萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后用石油醚丙酮通过柱层析分离纯化得到目 标化合物为淡黄色固体，经核磁确认衍生物2存在两个同分异构体2a与2b， 2a：2b＝0.9：1，收率为89％。熔点：186.2–189.2℃；(C＝0.11 in CH₃OH)；2a的核磁数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.11(s,0.9H,H-5), 6.11(s,0.9H,H-3＇),4.01(s,2.7H,H-10),3.96(s,2.7H,H-9),3.57(s,2.7H, H-11),3.09–3.04(m,0.9H,H-5＇),2.64–2.59(m,0.9H,H-6＇),2.58–2.56(m, 0.9H,H-5＇),2.19(s,2.7H,-CH₃),0.95(d,J＝6.7Hz,2.7H,H-8).¹³C NMR(125 MHz,CDCl₃)δ193.4(C-3),169.6(C-2＇),169.1(-NOOC-),164.6(C-7a),164.2 (C-4＇),158.2(C-6),157.8(C-4),105.5(C-3a),98.2(C-3＇),97.3(C-7),91.1 (C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5(C-9),56.4(C-11),35.5(C-5＇),27.5(C-6＇), 19.8(-CH₃),14.4(C-8).2b的核磁数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ6.10(s, 1H,H-5),5.78(s,1H,H-3＇),4.01(s,3H,H-10),3.96(s,3H,H-9),3.64(s,3H, H-11),3.09–3.04(m,1H,H-5＇),2.86–2.80(m,1H,H-6＇),2.64–2.59(m,1H, H-5＇),2.21(s,3H,-CH₃),0.95(d,J＝6.7Hz,3H,H-8).¹³C NMR(125MHz, CDCl₃)δ193.5(C-3),169.6(C-2＇),168.7(-NOOC-),164.6(C-7a),162.1 (C-4＇),161.4(C-6),157.7(C-4),105.5(C-3a),97.3(C-7),92.9(C-3＇),90.9 (C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5(C-9),56.5(C-11),36.5(C-5＇),30.9(C-6＇), 19.9(-CH₃),14.4(C-8).分子式：C₁₉H₂₀ClNO₇,ESI-MS m/z 409.88[M+H]⁺, 432.13[M+Na]⁺。

实施例2：4'位氯乙酰肟基灰黄霉素(衍生物3)的制备

合成方法同实施例1。所用酰氯是氯乙酰氯，得黄色固体，经核磁确认衍 生物3存在两个同分异构体3a与3b，3a：3b＝0.8：1，产率：72％。熔点： 154.5–156.3℃；(C＝0.15in CH₃OH)；3a核磁数据：¹H NMR (500MHz,(CD₃)₂CO)δ6.52(s,0.8H,H-5),5.75(s,0.8H,H-3＇),4.47(s,1.6H, -CH₂Cl),4.09(s,2.4H,H-10),3.97(s,2.4H,H-9),3.70(s,2.4H,H-11),3.15(dd, J＝17.1,4.9Hz,0.8H,H-5＇),2.74–2.69(m,0.8H,H-6＇),2.66–2.59(m,0.8H, H-5＇),0.92(d,J＝6.7Hz,2.4H,H-8).¹³C NMR(125MHz,(CD₃)₂CO)δ192.9 (C-3),170.2(C-2＇),165.9(C-7a),165.8(C-4＇),165.7(-NOOC-),163.4(C-6), 158.9(C-4),105.9(C-3a),98.0(C-3＇),97.1(C-7),91.5(C-2),91.2(C-5),57.9 (C-10),57.1(C-9),56.9(C-11),41.2(-CH₂Cl),36.2(C-5＇),27.7(C-6＇),14.5 (C-8).3b的核磁数据：¹H NMR(500MHz,(CD₃)₂CO)δ6.53(s,1H,H-5),6.28(s, 1H,H-3＇),4.48(s,2H,-CH₂Cl),4.09(s,3H,H-10),3.98(s,3H,H-9),3.71(s, 3H,H-11),3.04–3.00(m,1H,H-5＇),2.66–2.59(m,1H,H-6＇),2.53(dd,J＝ 15.3,4.2Hz,1H,H-5＇),0.95(d,J＝6.7Hz,3H,H-8).¹³C NMR(125MHz, (CD₃)₂CO)δ192.7(C-3),170.2(C-2＇),166.0(C-7a),165.7(-NOOC-),164.0 (C-4＇),160.2(C-6),159.0(C-4),105.9(C-3a),97.1(C-7),93.1(C-3＇),91.6 (C-2),91.3(C-5),57.9(C-10),57.2(C-9),56.9(C-11),41.3(-CH₂Cl),37.25 (C-5＇),31.1(C-6＇),14.5(C-8).分子式：C₁₉H₁₉Cl₂NO₇,ESI-MS m/z 465.93[M+Na]⁺。

实施例3：4'位丙酰肟基灰黄霉素(衍生物4)的制备

合成方法同实施例1。所用酰氯是丙酰氯，得淡黄色固体，经核磁确认衍 生物4存在两个同分异构体4a与4b，4a：4b＝0.8：1，产率：95％。熔点：178.2 –180.1℃；(C＝0.12in CH₃OH)；4a的和次数据：¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ6.11(s,0.8H,H-5),5.79(s,0.8H,H-3＇),4.02(s,2.4H),3.97(s, 2.4H,H-9),3.57(s,2.4H,H-11),3.14–3.03(m,0.8H,H-5＇),2.67–2.59(m, 0.8H,H-6＇),2.58(m,0.8H,H-5＇),2.48(m,1.6H,-CH₂-),1.22(d,J＝7.5Hz, 2.4H,-CH₃),0.95(d,J＝6.6Hz,3H,H-8).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.4 (C-3),172.0(-NOOC-),169.5(C-2＇),164.6(C-7a),161.9(C-4＇),158.2(C-6), 157.67(C-4),105.4(C-3a),97.2(C-7),92.9(C-3＇),90.9(C-2),89.4(C-5),57.1 (C-10),56.5(C-9),56.4(C-11),35.4(C-5＇),27.2(C-6＇),26.5(-CH₂-),14.4 (C-8),9.3(-CH₃).4b的核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.11(s,2H, H-5,H-3＇),4.02(s,3H,H-10),3.97(s,3H,H-9),3.64(s,3H,H-11),3.14–3.03 (m,1H,H-5＇),2.83(m,1H,H-6＇),2.67–2.59(m,1H,H-5＇),2.48(m,2H, -CH₂-),1.24(t,J＝7.5Hz,3H,-CH₃),0.95(d,J＝6.6Hz,3H,H-8).¹³C NMR (100MHz,CDCl₃)δ193.6(C-3),172.2(-NOOC-),169.5(C-2＇),164.6(C-7a), 164.0(C-4＇),161.4(C-6),157.7(C-4),105.5(C-3a),98.3(C-3＇),97.3(C-7), 91.1(C-2),89.4(C-5),57.1(C-10),56.5(C-9,C-11),36.5(C-5＇),30.9(C-6＇), 26.6(-CH₂-),14.4(C-8),9.3(-CH₃)。分子式：C₂₀H₂₂ClNO₇,ESI-MS m/z 424.04[M+H]⁺,446.22[M+Na]⁺

实施例4：4'位丙烯酰肟基灰黄霉素(衍生物5)的制备

合成方法同实施例1。所用酰氯是丙烯酰氯，得到黄色固体，经核磁确认 衍生物5存在两个同分异构体5a与5b，5a：5b＝0.8：1，产率：80％熔点： 135.3–137.7℃；(C＝0.11in CH₃OH)；5a核磁数据：¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ6.56(br.s,0.8H,-C＝CH₂),6.32–6.19(m,0.8H,-CH＝CH₂), 6.11(s,0.8H,H-5),5.90(br.s,H,-C＝CH₂),5.84(s,0.8H,H-3＇),4.02(s,2.4H, H-10),3.97(s,2.4H,H-9),3.65(s,2.4H,H-11),3.16–3.02(m,0.8H,H-5＇), 2.66–2.59(m,0.8H,H-6＇),2.42(dd,J＝16.9,4.4Hz,0.8H,H-5＇),0.97(d,J＝ 6.5Hz,2.4H,H-8).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.5(C-3),170.9(-NOOC-), 169.6(C-2＇),164.6(C-7a),162.2(C-4＇),159.0(C-6),157.8(C-4),131.8 (-CH＝),126.8(＝CH₂),105.0(C-3a),98.3(C-3＇),97.4(C-7),91.1(C-2),89.5 (C-5),57.1(C-10),56.5(C-9),56.5(C-11),35.5(C-5＇),31.0(C-6＇),14.4(C-8). 5b核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.52(br.s,1H,-C＝CH₂),6.32–6.19 (m,1H,-CH＝CH₂),6.13(s,1H,H-5),6.11(s,1H,H-3＇),5.93(br.s,1H,-C＝CH₂), 4.02(s,3H,H-10),3.97(s,3H,H-9),3.59(s,3H,H-11),3.16–3.02(m,1H, H-5＇),2.88–2.80(m,1H,H-6＇),2.66–2.59(m,1H,H-5＇),0.97(d,J＝6.5Hz,3H, H-8).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.5(C-3),170.9(-NOOC-),169.6(C-2＇), 164.6(C-7a),164.4(C-4＇),162.1(C-6),157.7(C-4),131.9(-CH＝),126.8 (＝CH₂),105.0(C-3a),97.4(C-7),92.9(C-3＇),90.9(C-2),89.5(C-5),57.1 (C-10),56.5(C-9),56.5(C-11),36.6(C-5＇),27.3(C-6＇),14.4(C-8).分子式： C₂₀H₂₀ClNO₇，ESI-MS m/z 422.02[M+H]⁺,444.26[M+Na]⁺。

实施例5：4'位丁酰肟基灰黄霉素(衍生物6)的制备

合成方法同实施例1。所用酰氯是丁酰氯，得到淡黄色固体，经核磁确认 衍生物6存在两个同分异构体6a与6b，6a：6b＝0.8：1，产率：82％，熔点： 104.4–105.7℃；(C＝0.13in CH₃OH)；6a核磁数据：¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ6.11(s,0.8H,H-5),5.80(s,0.8H,H-3＇),4.02(s,2.4H, H-10),3.97(s,2.4H,H-9),3.58(s,2.4H,H-11),3.06(m,0.8H,H-5＇),2.63– 2.59(m,0.8H,H-6＇),2.47–2.41(m,1.6H,-CH₂-),2.34–2.27(m,0.8H,H-5＇), 1.75(dd,J＝14.7,7.4Hz,1.6H,-CH₂-),1.01(t,J＝7.4Hz,2.4H,-CH₃),0.96(d,J ＝6.5Hz,2.4H,H-8).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.4(C-3),171.1 (-NOOC-),169.6(C-2＇),164.6(C-7a),162.0(C-4＇),158.3(C-6),157.8(C-4), 105.0(C-3a),98.4(C-3＇),97.5(C-7),91.1(C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5 (C-9),56.4(C-11),35.5(C-5＇),35.1(-CH₂-),27.3(C-6＇),18.7(-CH₂-),14.4 (C-8),13.9(-CH₃).6b核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.11(s,2H,H-5, H-3＇),4.02(s,3H,H-10),3.97(s,3H,H-9),3.64(s,3H,H-11),3.06(m,1H, H-5＇),2.87–2.80(m,1H,H-6＇),2.63–2.59(m,1H,H-5＇),2.47–2.41(m,2H, -CH₂-),1.75(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H,-CH₂-),1.01(t,J＝7.4Hz,3H,-CH₃), 0.96(d,J＝6.5Hz,3H,H-8).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.4(C-3),171.3 (-NOOC-),169.6(C-2＇),164.6(C-7a),164.1(C-4＇),161.4(C-6),157.7(C-4), 105.0(C-3a),97.5(C-7),93.0(C-3＇),90.9(C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5 (C-9),56.5(C-11),36.6(C-5＇),35.1(-CH₂-),31.0(C-6＇),18.7(-CH₂-),14.4 (C-8),13.9(-CH₃).分子式：C₂₁H₂₄ClNO₇，ESI-MS m/z 460.25[M+Na]⁺。

实施例6：4'位戊酰肟基灰黄霉素(衍生物7)的制备

合成方法同实施例1。(所用酰氯是戊酰氯)得到黄色固体，经核磁确认衍 生物7存在两个同分异构体7a与7b，7a：7b＝0.9：1，产率：92％,熔点：123.3 –126.1℃；(C＝0.18in CH₃OH)；7a核磁数据：¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ6.11(s,0.9H,H-5),5.80(s,0.9H,H-3＇),4.01(s,2.7H,H-10), 3.96(s,2.7H,H-9),3.64(s,2.7H,H-11),3.14–3.01(m,0.9H,H-5＇),2.68–2.52 (m,1.8H,H-6＇,H-5＇),2.42–2.48(m,1.8H,-CH₂-),1.74–1.66(m,1.8H, -CH₂-),1.44–1.38(m,1.8H,-CH₂-),0.94(m,5.4H,H-8,-CH₃).¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ193.4(C-3),171.5(-NOOC-),169.6(C-2＇),164.6(C-7a),164.1 (C-4＇),161.4(C-6),157.7(C-4),105.6(C-3a),98.4(C-3＇),97.4(C-7),90.9 (C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5(C-9),56.4(C-11),35.5(C-5＇),32.9 (-CH₂-),27.3(C-6＇),27.7(-CH₂-),22.4(-CH₂-),14.4(C-8),13.8(-CH₃).7b 核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.11(s,2H,H-5,H-3＇),4.01(s,3H, H-10),3.96(s,3H,H-9),3.58(s,3H,H-11),3.14–3.01(m,1H,H-5＇),2.88– 2.78(m,1H,H-6＇),2.68–2.52(m,1H,H-5＇),2.42–2.48(m,2H,-CH₂-), 1.74–1.66(m,2H,-CH₂-),1.44–1.38(m,2H,-CH₂-),0.94(m,6H,H-8,-CH₃). ¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ193.5(C-3),171.2(-NOOC-),169.6(C-2＇), 164.6(C-7a),162.0(C-4＇),158.3(C-6),157.8(C-4),105.5(C-3a),97.4(C-7), 93.0(C-3＇),91.1(C-2),89.5(C-5),57.1(C-10),56.5(C-9),56.5(C-11),36.6 (C-5＇),32.9(-CH₂-),31.0(C-6＇),27.2(-CH₂-),22.4(-CH₂-),14.4(C-8),13.8 (-CH₃).分子式：C₂₂H₂₆ClNO₇，ESI-MS m/z 451.91[M+H]⁺,474.25[M+Na]⁺。

实施例8：抗植物病原真菌活性的测定

发明采用抑制菌丝生长速率法对灰黄霉素及其衍生物进行3种抗植物病原 真菌的活性测试，分别是苹果炭疽、番茄灰霉、番茄早疫。结果发现这些化合 物具有良好的活性。

具体实施方法是：在40-50℃，无菌条件下，将配制好样品的丙酮溶液溶 入PDA培养基中，使培养基中该化合物的浓度达到100μg/mL，待培养基凝固 后接种上述病原菌，每个处理重复3次，28℃恒温培养，待培养72h或96h 后取出培养皿，观察并用卡尺量菌落直径(须十字交叉量取两次，用其平均数) 并做记录统计。如果发现有污染的必须进行重复试验。最后进行活性初筛结果 计算，恶霉灵为阳性对照。结果以抑制率表示，具体公式如下：

抑菌率(％)＝(C－T)/(C－4mm)×100％

C表示空白培养基的菌落直径，T表示加了样品或者阳性对照的菌落直 径。结果见表1。

表1化合物在100μg/mL下的植物病原菌活性测定结果

Note:C.g.,Colletotrichum gloeosporioides,苹果炭疽；B.c.,Botrytis cinerea,番茄灰霉；A.s., Alternaria solani,番茄早疫；Hy.,Hymexazol,恶霉灵。

初筛后对抑制率达到70％以上的化合物进行IC₅₀的测试，将化合物依次配 成100,50,25,12.5,6.25,3.125，1.5625μg/mL系列的带药培养基，阳性对照为恶 霉灵。最后根据不同浓度的抑制率计算其IC₅₀值。结果见表2。

表2化合物的抗植物病原菌活性IC₅₀值

综上所述，本发明所涉及的灰黄霉素衍生物能够用于制备抗特定植物病原 真菌抗生素药物的应用。