一种多倍体金线莲有机培养一次性成苗诱导方法

摘要

本发明属于药用植物金线莲染色体增加倍数后一次性成苗有机培养的方法，更具体涉及我国传统珍贵药材兰科开唇兰属一种多年生草本植物野生金线莲植株无菌体系建立及染色体增加倍数后多倍体一次性成苗有机培养的方法。本方法通过无菌体系的建立、秋水仙素的多倍体诱导、增殖培养、移栽，获得多倍体金线莲植株健壮完整种苗。本发明通过进行金线莲多倍体诱导并进行产业化生产，为获得生态适应性强、药用成分含量高的金线莲多倍体新品种和大量诱导多倍体植株提供技术支持。本发明的方法诱导率高，变异植株成活率高，该技术瓶苗培养周期短、扩繁系数高、栽培适应性强。

说明书

技术领域

本发明属于药用植物金线莲染色体增加倍数后一次性成苗有机培养的方法，更具体涉及我国传统珍贵药材兰科开唇兰属一种多年生草本植物野生金线莲植株无菌体系建立及染色体增加倍数后多倍体一次性成苗有机培养的方法。

背景技术

金线莲(Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl)是传统的珍贵药材之一，属于兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus）植物，含糖类、牛磺酸、强心甙类、酯类、生物碱、甾体，多种氨基酸，微量元素及无机元素等，常用于治疗糖尿病、风湿性关节炎、肺热咳嗽、破伤风、急慢性肝炎等。因其药用价值而深受人们的喜爱，市场需求量大增。近年来自然环境遭受严重破坏和人为的大量掠夺性采摘，导致野生金线莲越来越少，加之金线莲对生长环境要求苛刻，自然繁殖率低，商品价格居高不下。在金线莲生产上对优良品种选育更新是一项亟待展开的工作。自然界中普遍存在多倍体植株，与二倍体植株相比，它们具有优势性状，主要有植株营养器官如根、茎、叶等的巨大性，抗逆性增强，环境适应性强、生长速率快，有机合成速率加快，有效药用成分增加。金线莲所有的营养器官都可药用，因而金线莲多倍体育种具有重要实际应用价值。

关于金线莲组织培养报道虽然很多，但是采用经过多倍体育种后一次性成苗有机培养获多倍体植株方面未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多倍体金线莲有机培养一次性成苗诱导方法，进行金线莲多倍体诱导并进行产业化生产，为获得生态适应性强、药用成分含量高的金线莲多倍体新品种和大量诱导多倍体植株提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

（1）无菌体系的建立

将采集的野生金线莲植株经消毒处理，接种到诱导培养基上建立无菌体系，诱导培养基为White+1.0mgL^-16-BA+0.3mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件:温度23±2℃，光照强度500-1000lx，光照时间10h/d；

（2）多倍体诱导

选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金线莲组培瓶苗为试验材料，切取诱导的无菌离体茎段，采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法或加入培养基法进行处理，然后接种于多倍体一次性成苗培养基中培养；培养条件：培养室温度为23±2℃，先暗培养10天，10天后光照逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-2000lx，光照时间12h/d；多倍体一次性成苗培养基：White+蛋白胨2g/L+花宝2号1g/L +土豆100g/L+蔗糖3%+琼脂0.65%+活性炭0.2%；

    （3）增殖培养：将步骤（2）得到的生长良好的多倍体金线莲植株瓶苗剪取切成1-2cm带节茎段，接种在多倍体一次性成苗培养基中增殖培养；

   （4）移栽：将经过4-5个月增殖培养的多倍体金线莲植株瓶苗，置自然光下炼苗5-7天，打开瓶盖炼苗1-2 天；然后用摄子从培养瓶中取出栽培瓶苗，洗去附着在根系上的培养基，移入混合基质中，放置在温度15 ～ 30℃、湿度75％～ 85％、避免阳光直射环境下种植，获得多倍体金线莲植株健壮完整种苗。

步骤（4）中所述混合基质为质量比4: 1：1的泥炭土+粉碎杉木皮+珍珠岩的混合基质。

步骤（2）所述秋水仙素溶液浸泡法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成1-2cm带节茎段，放入经过高压灭菌的浓度为300-500mg/L的秋水仙素溶液中浸泡24-60h，将浸泡处理后的材料在超净工作台上用无菌水冲3-4遍，接种于多倍体一次性成苗培养基中培养。

步骤（2）所述涂抹法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成1-2cm带节茎段，在超净工作台中用无菌棉签蘸上经过高压灭菌的300-700mg/L秋水仙素溶液，然后用蘸上秋水仙素溶液的棉签涂抹在茎节处，再将涂抹过秋水仙素的材料接种到多倍体一次性成苗培养基中培养。

步骤（2）所述加入培养基法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成1-2cm带节茎段，接种到添加300-700mg/L秋水仙素溶液的多倍体一次性成苗培养基上，培养15-30天，然后转入多倍体一次性成苗培养基中继续培养。

    本发明应用多倍体一次性成苗培养基培养多倍体栽培瓶苗，诱导率高，变异植株成活率高。该技术瓶苗培养周期短（培养4-5个月后直接移栽）、扩繁系数高(每个茎段平均增殖8.77个芽)、栽培适应性强、茎粗直径（4-5mm）、根系多（4-6根）且发达、韧性强，纤维含量高，病虫害少，植株活力强，叶片颜色深厚，绒布状明显，叶脉金线明晰，缓苗速度快（7-10天），成活率达99%以上，生根率达99%，每株重量达3.5-5.5克，内物质含量高。

附图说明

图1：茎段诱导。

图2：多倍体瓶苗1。

图3：多倍体瓶苗2。

图4：多倍体瓶苗移栽。

图5：成活状态苗1。

图6：成活状态苗2。

图7：采收。

图8：100倍下二倍体植株气。

图9：100倍四倍体植株气孔。

图10：400倍下二倍体植株气孔大小。             

图11：400倍下四倍体植株气孔大小。

图12：二倍体染色体数。

图13：四倍体染色体数。

具体实施方式

1 多倍体材料的来源

1.1无菌体系的建立

用金线莲茎段作为外植体，将野外采回金线莲植株用洗涤剂漂洗材料表面，再置于流水中冲滴0.5-1h后用双蒸水冲洗2-3次，置超净工作台上用75%酒精消毒30s，倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl₂)处理10-12min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干接种材料表面水分，取出要接种材料放在灭过菌的培养皿，接种到诱导培养基上建立无菌体系。诱导培养基为White+1.0mgL^-16-BA+0.3mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件:温度23±2℃，光照强度500-1000lx，光照时间10h/d。

1.2多倍体诱导的取材方法

选取健壮生长一致经过4-5个月培养金线莲组培瓶苗为试验材料，切取诱导的无菌离体茎段，接种在添加300-500mg/L秋水仙素溶液的继代培养基上，培养10-30天后转入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养；或切取初代诱导的无菌离体茎段，用经过高压灭菌300-500mg/L秋水仙素溶液浸泡24-60h后，用无菌水冲3-4遍后，接种在不含秋水仙素的继代培养基上培养。继代培养基为White+3.0mgL^-16-BA+0.5mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件为温度23±2℃，光照强度1500-2000lx，光照时间10h/d。培养20天后，经过秋水仙素处理的无菌茎段部分长出新生芽，外观与对照芽差异显著。培养4个月后待苗长出根后，切取根尖做染色体检测。

1.3 多倍体的染色体鉴定

切取根尖生长点，先置于4℃的冰箱中预处理8-24h，接着用卡诺氏固定液（冰乙酸：乙醇=1:3）在室温下固定18-24h，用蒸馏水漂洗后，在90%、80%、70%的酒精各浸泡30min，再用蒸馏水漂洗后，用1molL^-1Hcl溶液在60℃水浴中解离处理10-30min，解离好的根尖用蒸馏水洗净，将其用改良的苯酚品红溶液中染色3-5分钟，压片，将压好的片子置于显微镜下镜检观察即可。

2 试验方法

2.1 增加倍数诱导方法

本发明采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法、加入培养基法三种方法进行多倍体诱导试验，每种方法均设置了若干组处理时间和浓度梯度，研究不同取材（茎段、茎尖）、不同处理方法、不同浓度秋水仙素及不同处理时间对多倍体诱导率的影响。

2.1.1秋水仙素溶液浸泡法

选取生长一致健壮的经过5个月培养金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成1-2cm带节茎段，放入经过高压灭菌的浓度为300mg/L、500mg/L、700mg/L秋水仙素溶液分别浸泡10、20、30、40、50、60h，各处理重复3次，以清水浸泡处理材料为对照（CK），将各处理后的材料在超净工作台上用无菌水冲3-4遍，接种在一次性成苗培养基White+蛋白胨2g/L+花宝2号1g/L+土豆100g/L+蔗糖3%+琼脂0.65%+活性炭0.2%上培养,茎节和顶芽分开培养,培养条件为温度23±2℃，先暗培养10天，10天后灯光逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-2000lx，光照时间10h/d。每瓶接种4个茎段或顶芽，每个处理接种5瓶，各处理重复3次。

2.1.2 秋水仙素加入培养基

选取生长一致健壮经过5个月培养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗植株切成1-2cm的带节茎段，接种到分别添加300mg/L、500mg/L、700mg/L秋水仙素溶液的无菌培养基上，培养分别培养5、10、15、20、25、30天，以不加秋水仙素的培养基为对照（CK）。将各处理后的材料后转入不含秋水仙素的培养基中继续培养，培养基White+蛋白胨2g/L+花宝2号1g/L +土豆100g/L+蔗糖3%+琼脂0.65%+活性炭0.2%,茎节和顶芽分开培养,培养条件为温度23±2℃，先暗培养10天,10天后灯光逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-2000lx，光照时间12h/d。每瓶接种4个茎段或顶芽,每个处理接种5瓶，各处理重复3次。

2.1.3 秋水仙素蘸在材料处

选取生长一致健壮金线莲组培瓶瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗植株切成1-2cm的带节茎段，在超净工作台中用无菌棉签蘸上经过高压灭菌的秋水仙素溶液，然后用蘸上秋水仙素溶液的棉签涂抹在茎节处，再将涂抹过秋水仙素的材料接种到培养基White+蛋白胨2g/L+花宝2号1g/L +土豆100g/L+蔗糖3%+琼脂0.65%+活性炭0.2%中。秋水仙素溶液的浓度分别为300mg/L、500mg/L、700mg/L，共3个处理,茎节和顶芽分开培养,培养条件为温度23±2℃，先暗培养10天，10天后灯光逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-2000lx，光照时间10h/d。每瓶接种4个茎段或顶芽,每个处理接种5瓶，各处理重复3次，以清水处理的材料为对照（CK）。

结果表明：3种方法的诱导效果：加入培养基法>浸泡法>涂抹法。

（1）浸泡法以300 mg/L秋水仙素溶液处理48h，诱变效果最佳，诱变率为80%，秋水仙素溶液对顶芽毒害作用比对茎节严重。

（2）加入培养基试验中，以500 mg/L秋水仙素处理20d诱导率最高，达80%，秋水仙素溶液对茎段毒害作用比对顶芽严重。

（3）涂抹法以700 mg/L秋水仙素涂抹在茎节诱导效果较好，变异率为35%。

(4)培养4个月后待苗长出根后，切取根尖做染色体检测。

2.2 培养基：

（1）多倍体一次性成苗培养培养基：White+蛋白胨2g/L+花宝2号1g/L +土豆100g/L+蔗糖3%+琼脂0.65%+活性炭0.2%。

    （3）诱导培养：将经过多倍体处理的金线莲茎段，接种于经高温、高压灭菌的一次性成苗有机培养基中培养；

    （4）培养条件：培养室温度为23±2℃，先暗培养10天，10天后灯光逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-2000lx，光照时间12h/d；

    （5）增殖培养：将经上述经4个月多倍体一次性成苗培养基得到生长良好的多倍体金线莲植株瓶苗剪取切成1-2cm带节茎段接种在多倍体一次性成苗培养基中增殖培养；

   （6）移栽：经过5个月多倍体一次性成苗有机培养基培养的多倍体金线莲植株瓶苗，置自然光下炼苗5-7天，打开瓶盖炼苗1-2 天；然后用摄子从培养瓶中取出栽培瓶苗，洗去附着在根系上培养基，移入质量比4: 1：1的泥炭土+粉碎杉木皮+珍珠岩的混合基质中，放置在温度15 ～ 30℃，湿度75％～ 85％，避免阳光直射环境下种植，种植7-10天后移栽瓶苗迅速缓苗，30天后第一根气生根迅速生长并扎入基质中，获得多倍体金线莲植株健壮完整种苗。

2.3 变异植株的形态学和解剖学观察

与对照组相比，处理组植株在株高、茎粗、叶片大小、叶片厚度、茎节等外部形态特征上发生明显的变化。茎段处理后前期诱导分化慢，营养器官明显增大，主要表现在植株高大、茎秆粗壮、茎节明显且长、叶片肥厚、叶片变小，叶脉金色加深等，与二倍体差异显著（见表1）。

表1 金线莲二倍体与四倍体形态特征比较

气孔大小、气孔密度及保卫细胞大小等可用来作为多倍体与二倍体鉴定的间接指标。如图8-13，从镜检观察发现，变异植株的气孔明显增大，气孔长度和宽度均显著大于对照植株。变异植株气孔为44.64μm×27.78μm，对照植株气孔为32.24μm×17.36μm，气孔长度和宽度分别比正常植株增加38.46%和37.51%。每个视野的气孔数目比对照植株少，存在显著性差异，为对照植株的53.84%。

表2 金线莲二倍体与四倍体气孔特征比较

2.4 变异植株根尖染色体观察

从形态学和解剖学上初步筛选出变异植株进行根尖染色体鉴定。曾雅娟等进行金线莲染色体的核型分析研究，发现金线莲的染色体数目是2n= 40条。对变异植株和对照组植株进行根尖染色体制片，由于金线莲的染色体数目较多，染色体出现重叠，未能清晰的算出染色体数目，但可以明显的看出变异植株根尖细胞体积变大，细胞核增大，部分细胞形态发生变化，染色体数目增多。

1） 金线莲多糖含量测定试验结果表明：多倍体一次性成苗植株多糖含量随着培养时间增加而增加，种植6个月以上多倍体栽培苗多糖含量高于二倍体栽培苗和野生苗含量；林下栽培多倍体苗多糖含量略高于大棚多倍体栽培苗；多倍体金线莲鲜样多糖含量略高于干样，可能烘干过程中存在多糖流失现象。因此，若以多糖含量高低作为金线莲有效成分考量指标，生产上种植时间应在6个月以上。

2）金线莲总黄酮含量测定试验结果表明：多倍体组培瓶苗黄酮含量随着培养时间增加而增多，移栽后总黄酮含量进一步增加，多倍体一次性瓶苗黄酮含量高于二倍体瓶苗，但均低于野生苗含量；林下栽培多倍体苗与大棚多倍体栽培苗黄酮含量差异不明显；多倍体金线莲干品与鲜品黄酮含量的差异与苗质量有关，烘干过程对黄酮含量影响较小。

    以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1：

（1） 野外采回得金线莲用洗涤剂漂洗材料表面，再置于流水中冲洗0.5-1h，然后用双蒸水冲洗2-3次，置超净工作台用75%的酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl₂)处理10-12min，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，取出要接种的材料放在灭过菌的培养皿，接种到诱导培养基上建立无菌体系。诱导培养基为MS+1.0mgL^-16-BA+0.3mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件为温度25℃，光照强度500lx，光照时间10h/d。

（2） 选择生长3-4cm高的苗，切成带一个节的茎段，用经过高压灭菌的300-500mg/L秋水仙素溶液浸泡24-60h后，用无菌水冲3遍后，接种入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养。继代培养基为MS+3.0mgL^-16-BA+0.5mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件为温度25℃，光照强度1500lx，光照时间10h/d。培养20天后，经过秋水仙素处理的无菌茎段部分长出新生芽，外观与对照芽差异显著。培养4个月后，变异苗茎粗，叶片大、颜色深厚，茎节明显，待苗长出根后，切取根尖做染色体检测以确定植株的倍性。

（3）染色体检测。切取根尖生长点，先置于4℃的冰箱中预处理10h，接着用卡诺氏固定液（冰乙酸：乙醇=1:3）在室温下固定20h，用蒸馏水漂洗后，在90%、80%、70%的酒精各浸泡30min，再用蒸馏水漂洗后，用1molL^-1Hcl溶液在60℃水浴中解离处理20min，解离好的根尖用蒸馏水洗净，将其用改良的苯酚品红溶液中染色3分钟，压片，将压好的片子置于显微镜下镜检观察即可。茎段经300mg/L秋水仙素溶液浸泡48h,多倍体的诱导率最高,达80%。秋水仙素不同浓度、不同处理时间多倍体的诱导率见表3。

表3：秋水仙素不同浓度、不同处理时间对多倍体的诱变效果

实施例2：

（1） 野外采回得金线莲用洗涤剂漂洗材料表面，再置于流水中冲洗0.5-1h，然后用双蒸水冲洗2-3次，置超净工作台用75%的酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl₂)处理10-12min，将汞液倒入废汞瓶，用无菌水冲3-4遍后，用消毒滤纸吸干表面水分，取出要接种的材料放在灭过菌的培养皿，接种到诱导培养基上建立无菌体系。诱导培养基为White+1.0mgL^-16-BA+0.3mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件为温度25℃，光照强度500-1000lx，光照时间12h/d。

（2） 选择生长3-4cm高的苗，切成带一个节的茎段，接种在添加300-500mg/L秋水仙素溶液的继代培养基上，培养10-30天后转入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养。继代培养基为White+3.0mgL^-16-BA+0.5mgL^-1NAA+0.5mgL^-1KT+6.5gL^-1琼脂+30gL^-1蔗糖+2.0gL^-1活性炭，pH5.6-5.7，培养条件为温度25℃，光照强度1500lx，光照时间12h/d。培养20天后，经过秋水仙素处理的无菌茎段部分长出新生芽，外观与对照芽差异显著。培养4个月后，变异苗茎粗，叶片大、颜色深厚，茎节明显，待苗长出根后，切取根尖做染色体检测以确定植株的倍性。

（3）染色体检测。切取根尖生长点，先置于4℃的冰箱中预处理10h，接着用卡诺氏固定液（冰乙酸：乙醇=1:3）在室温下固定20h，用蒸馏水漂洗后，在90%、80%、70%的酒精各浸泡30min，再用蒸馏水漂洗后，用1molL^-1Hcl溶液在60℃水浴中解离处理20min，解离好的根尖用蒸馏水洗净，将其用改良的苯酚品红溶液中染色3分钟，压片，将压好的片子置于显微镜下镜检观察即可。茎段接入500mg/L秋水仙素溶液处理20天后转入不含秋水仙素的继代培养基中继续培养，多倍体的诱导率最高达80%。秋水仙素不同浓度、不同处理时间多倍体的诱导率见表4。

表4：秋水仙素不同浓度、不同处理时间对多倍体的诱变效果

本发明提供了一种金线莲染增加色体倍数后采用一次性成苗有机培养的方法，可用于金线莲多倍体育种和产业化生产，诱导率高达80%，变异植株成活率高（达99%），移栽成活率高（达99%）、叶片数量增加到10片以上。

表5 不同月龄瓶苗对移栽成活率的影响

表6 不同月龄瓶苗对移栽生根率的影响