miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用

摘要

本发明涉及一种miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用，主要为miRNA-153在Nrf-2/GPx1/ROS信号通路中的用途，其中miRNA-153调控GPx1的转录调控因子Nrf-2在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，该GPx1的转录调控因子Nrf-2的蛋白表达调控GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达调控胶质瘤干细胞内ROS水平，本发明首次提出miR-153通过调节Nrf-2/GPx1/ROS信号通路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分子机制开辟新途径；且过表达miR-153可有效克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发一种新的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供实验依据。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放 射增敏剂中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，约占全部脑肿瘤的35-60％。尽管近 30年来国内外针对胶质瘤的研究投入巨大，但收效有限，其复发、死亡率仍居 高不下。目前认为手术结合放化疗的综合治疗是治疗胶质瘤的最佳方案，放疗 因此成为脑胶质瘤综合治疗的重要环节之一。

国内外大量的实验研究证明在人胶质瘤实体以及体外长期培养的胶质瘤细 胞系中均存在具有肿瘤干细胞性质的细胞，它们可能对肿瘤的起源、发展、转移、 复发以及对放化疗敏感性方面起着至关重要的作用。

microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度约为21～23个核苷酸的非编码 单链小分子RNA，通过调节靶基因的表达在发育和疾病中参与了增殖、迁移、分 化和凋亡等生理性和病理性过程。越来越多的证据显示不同类型的miRNA参与 了调控肿瘤的发生、发展及放化疗抗性。miRNA的表达和胶质瘤干细胞生物学行 为之间的关系还需要进一步深入研究。

目前而言，胶质瘤干细胞在放射治疗中的抵抗作用已受到广泛关注，其机 制涉及：

(1)细胞周期检查点激活：有研究发现，代表胶质瘤干细胞的CD133⁺胶质 瘤细胞在照射后的比例明显增加，且接受过照射的CD133⁺胶质瘤细胞形成移植 瘤的效率与未接受照射的细胞一致。在接受相同剂量的照射时，CD133⁺胶质瘤 细胞的存活率显著高于CD133^-细胞，提示胶质瘤干细胞对放射线有明显的抗拒 性，可能是脑胶质瘤放射治疗后复发的根源。进一步研究发现，与CD133^-细胞 相比，CD133⁺胶质瘤细胞受照后可以更有效地激活DNA损伤检查点Chk1和 Chk2，使细胞周期停滞，提高DNA损伤修复效率。

(2)细胞凋亡：研究发现，与CD133^-细胞相比，CD133⁺胶质瘤细胞表达更 高水平的抗凋亡基因FLIP、BCL-2、BCL-XL以及IAPs家族成员 XIAP、cIAP1、cIAP2、NAIP、survivin、MELK。

(3)细胞自噬：研究发现，照射后，CD133⁺胶质瘤细胞比CD133^-细胞自噬 少，用mTOR阻滞剂雷帕霉素作用于CD133⁺细胞后，发现其产生分化，放射 敏感性增强，提示减少自噬有助于CSC维持干性和相对静止的状态，造成辐射 抵抗，而增强自噬可能引导CSC的分化，增强放射治疗的效果。

目前，肿瘤放射治疗常用的放射线作用特点主要是以间接作用为主，该作 用方式首先是放射线与细胞中的水分子相互作用，产生活性氧基团(Reactive  oxygen species，ROS)，随后由这些ROS对DNA造成损伤，此过程同时伴有 这些ROS的清除和非致死性DNA损伤的修复，其最终结果决定了细胞的存活 和损伤程度。研究发现，肿瘤干细胞(CSC)常位于血管周围，提示CSC在接 受照射后会产生更多的活性氧自由基(ROS)，而在活性氧增加的情况下要保 存自身，必须有很强的氧化清除能力。此外还有人发现乳腺癌MCF-7细胞中 CSC细胞活性氧自由基水平比未分离CSC的MCF-7低，给予10Gy照射后， MCF-7细胞系中的ROS水平明显增高，但从MCF-7中分离的CSC却未见明显 改变，提示CSC自身可能有很强的氧化清除系统，因此在经照射后CSC比普 通的肿瘤细胞更容易在ROS引起的损伤中存活。还有研究人员在乳腺癌中分离 CSC后予以ROS清除物抑制剂，发现CSC的增殖能力减弱，放射敏感性增加。 上述研究表明，肿瘤干细胞具有较强的ROS清除能力，受照后使ROS处于较 低水平，DNA的初始损伤明显少于非肿瘤干细胞，从而导致肿瘤干细胞与非肿 瘤干细胞相比更具放射抗拒性。然而，在胶质瘤干细胞中是否存在ROS清除能 力增强介导的放射抗拒性尚未见文献报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种miRNA-153(即miR-15 3)在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用，其首次提出miR-153通过调节 Nrf-2/GPx1/ROS信号通路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶 质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分子机制开辟新途径；过表达miR-153可有效 克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发一种新的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供 实验依据。

本发明的技术方案是：

本发明公开了miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用。

本发明公开了miRNA-153在Nrf-2/GPx1/ROS信号通路中的用途。

本发明公开了miRNA-153调控GPx1的转录调控因子Nrf-2在胶质瘤干细 胞中的蛋白表达，该GPx1的转录调控因子Nrf-2的蛋白表达调控GPx1在胶质 瘤干细胞中的蛋白表达，GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达调控胶质瘤干细 胞内ROS水平。

本发明公开了miRNA-153作用于Nrf-2 3’UTR。

本发明公开了miRNA-153的成熟序列为SEQ ID NO:1，所述Nrf-2 3’UTR 的序列中含有miRNA-153的靶点序列SEQ ID NO:2。

本发明公开了包括miRNA-153的靶点序列SEQ ID NO:2在构建过表达 miRNA-153成熟序列慢病毒表达载体中的用途。

本发明公开了转染miRNA-153成熟序列使胶质瘤干细胞中Nrf-2和GPx1 的蛋白表达明显下降，胶质瘤干细胞的放射敏感性增强。

本发明公开了过表达miR-153导致胶质瘤干细胞肿瘤内干性标志CD133和 nestin的蛋白表达下降，分化标志GFAP和Tuj-1的蛋白表达增强。

本发明公开了过表达miRNA-153使胶质瘤干细胞移植活体平均生存时间延 长。

本发明公开了所述胶质瘤干细胞的细胞株为U87s和SU-2。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明首次提出miR-153通过 调节Nrf-2/GPx1/ROS信号通路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐 释胶质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分子机制开辟新途径；且过表达miR-153 可有效克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发一种新的胶质瘤干细胞放射增敏 剂提供实验依据。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附 图详细说明如后。

附图说明

图1为具体实施例中常氧和乏氧条件下U87s和U87放射敏感性示意图；

图2为具体实施例中常氧和乏氧条件下SHG44和SU-2放射敏感性示意图；

图3为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记U87s和U87 的ROS水平曲线图，其中n＝3；

图4为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记SHG44和SU- 2的ROS水平曲线图，其中n＝3；

图5为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记U87s和U87 的ROS水平柱状图，其中n＝3，且*P<0.01vs U87s.^#P<0.01vs U87；

图6为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记SHG44和SU- 2的ROS水平柱状图，其中n＝3，且*P<0.01vs SHG44s.^#P<0.01vs SHG44；

图7为具体实施例中Catalase、MnSOD和GPx1在U87、U87s、SHG44和SU- 2中蛋白表达水平示意图；

图8为具体实施例中Catalase在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状 示意图，其中n＝3，P<0.01vs U87或SHG44；

图9为具体实施例中MnSOD在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状 示意图，其中n＝3，P<0.01vs U87或SHG44；

图10为具体实施例中GPx1在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状示 意图，其中n＝3，P<0.01vs U87或SHG44；

图11为具体实施例中检测敲低GPx1对U87s放射敏感性的影响；

图12为具体实施例中检测敲低GPx1对SU-2放射敏感性的影响；

图13为具体实施例中Real-time RT-PCR检测GPx1mRNA表达水平，其中 *P<0.01vs U87或SHG44；

图14为具体实施例中Western blot检测Nrf-2和Keapl蛋白表达；

图15为具体实施例中免疫共沉淀检测Nrf-2与Keapl的相互作用；

图16为具体实施例中Real-time PCR检测候选microRNA表达水平变化， 其中*P<0.01vs U87；

图17为具体实施例中miR-153在Nrf-2 3’UTR上可能的结合位点；

图18为具体实施例中miR-153转染对荧光素酶活性的影响，*P<0.01vs  Scramble Control；

图19为具体实施例中miR-153转染胶质瘤干细胞株U87s和SU-2的Real- time PCR结果示意图；

图20为具体实施例中Western blot法检测miR-153的靶基因Nrf-2和GPx1 的蛋白表达结果示意图；

图21为具体实施例中GPx1在过表达miR-153转染胶质瘤干细胞株U87s 和SU-2活性示意图；

图22为具体实施例中GR(谷胱甘肽还原酶)在过表达miR-153胶质瘤干 细胞U87s和SU-2活性示意图；

图23为具体实施例中GSH在control、lu-scr、lv-mir-153表达示意图；

图24为具体实施例中GSSG在control、lu-scr、lv-mir-153表达示意图；

图25为具体实施例中GSH/GSSG比率示意图；

图26为具体实施例中CellROX^TM Deep Red检测胶质瘤干细胞ROS水平示 意图；

图27为0Gy和5Gy X射线照射后lv-scr和lv-miR-153胶质瘤干细胞凋亡情 况示意图；

图28为0Gy和5Gy X射线照射后lv-scr和lv-miR-153胶质瘤干细胞凋亡百 分比；

图29为利用克隆存活实验比较过表达miR-153胶质瘤干细胞与转染随机序 列胶质瘤干细胞放射敏感性的差异结果示意图；

图30为利用神经球形成实验检测胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球形成能力中细 胞球直径的电镜图；

图31为利用神经球形成实验检测胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球形成能力中形 成百分率的变化示意图；

图32为利用细胞免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞干性标志CD133和nestin 以及分化标志GFAP和Tuj-1的蛋白表达电镜图；

图33为利用细胞免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞干性标志CD133和nestin 以及分化标志GFAP和Tuj-1的蛋白表达柱状图；

图34为过表达miR-153的胶质瘤干细胞移植裸鼠和转染随机序列胶质瘤干 细胞的移植裸鼠的生存时间对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以 下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、克隆存活法检测细胞放射敏感性。

首先利用克隆存活法进行试验来比较常氧(21％氧浓度)和乏氧(1％氧浓 度)培养下胶质瘤干细胞株U87s和SU-2与相应的胶质瘤细胞株U87和SHG- 44放射敏感性的差异，其具体做法如下所述：

常氧或乏氧培养(1％O₂,5％CO₂,94％N₂)72h，收集细胞，在6孔细胞培 养板中接种1×10³细胞/孔，每组设3个复孔，给予0，2，4，6和8Gy X射线 照射，采用德国西门子PRIMUS直线加速器照射，6MV X射线，球靶距100 cm，剂量率2Gy/min。照射后继续培养11d，甲醇固定，Giemsa染色，低倍光 学显微镜下计数大于50个细胞的克隆。按下式计算克隆存活率：克隆存活率 (％)＝(实验组克隆数/对照组克隆数)×100％。采用多靶单击模型拟合细胞存 活曲线：S＝1-(1-e^-D/D0)^N，其中，S为存活分数，D为照射剂量，D₀为平均致死 剂量，N为外推值。

根据上述试验发现，发现常氧或乏氧培养下胶质瘤干细胞株辐射抗性均明 显强于胶质瘤细胞株，且OER值较低，即胶质瘤干细胞株放射敏感性受氧效应 影响相对较小，提示胶质瘤干细胞株可能具有较强的ROS清除能力(参见图 1、图2和表1)。

表1 克隆存活实验检测胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞放射敏感性差异(n＝3)

  U87 U87s SHG44 SU-2 Normoxic D₀2.12Gy 3.40Gy 2.23Gy 3.98Gy Hypoxic D₀3.89Gy 4.92Gy 4.07Gy 5.02Gy OER 1.83 1.45 1.82 1.26

二、H2DCFH-DA检测细胞ROS水平

利用H2DCFH-DA检测胶质瘤干细胞U87s和SU-2与相应的胶质瘤细胞 U87和SHG-44中ROS水平的差异，其具体做法如下所述：

取对数生长期细胞，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，加入终浓度为10μM的 DCFH-DA，37℃5％CO₂培养箱中静置0.5h，每隔3-5min混匀一下，使探针 和细胞充分作用。用无血清的培养基洗涤细胞3次，去除未进入细胞内的 DCFH-DA。收获各组细胞，上流失细胞仪检测ROS，激发光488nm，发射光 525nm。

发现基础条件下胶质瘤干细胞内ROS水平明显低于相应的胶质瘤细胞株。8 Gy X射线照后1h，胶质瘤细胞ROS水平明显升高，而胶质瘤干细胞内ROS 水平有增高趋势，但无明显统计学差异，表明胶质瘤干细胞ROS清除能力明显 强于胶质瘤细胞，这可能是导致胶质瘤干细胞辐射抗性明显增强的重要原因之 一(参见图3、图4、图5和图6)。

三、Western blot检测细胞蛋白表达水平

为探求胶质瘤干细胞ROS清除能力显著增强的机制，我们首先检测几种重 要的抗氧化酶：过氧化氢酶(Catalase)，锰超氧化物歧化酶(MnSOD),铜/ 锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)在胶质瘤干 细胞U87s和SU-2与相应的胶质瘤细胞U87和SHG-44之间蛋白表达水平是否 存在差异，其具体做法如下所述：

采用单去污剂裂解法提取总蛋白，采用BCA Protein Assay Kit按其操作说 明测定总蛋白浓度，将提取出的细胞蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS- PAGE)电泳；采用半干电转印系统(美国Bio-Rad公司)电转NC膜(美国 Amersham Biosciences公司)；用含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液室温 封闭4小时；将相应抗体与含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液按照需要 的比例稀释后和膜一起孵育，4℃过夜；用TBST溶液洗涤3次后，将二抗与 含质量分数为5％脱脂奶粉的TBST溶液按照体积比为1∶1500的比例稀释后和 膜一起孵育，在摇床上轻摇，室温2小时；用TBST溶液洗涤3次后，采用底 物化学发光ECL试剂盒，按照说明书操作，用凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司) 自动曝光记录成像。

发现Catalase和MnSOD在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间蛋白表达水平 无明显差异，CuZnSOD在4株细胞中均无明显表达(未在图7中显示)，而 GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达水平明显高于胶质瘤细胞。进一步检测4株 细胞Catalase，MnSOD和GPx1酶活性，发现其规律与蛋白表达变化规律基本 一致(参见图7、图8、图9和图10)。

四、采用克隆存活法实验检测敲低GPx1对在胶质瘤干细胞U87s和SU-2放 射敏感性的影响。

GPx1是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPx1主要分布在 胞质溶胶，蛋白中每个亚基含有一个硒原子，GPx1是以硒代半胱氨酸(Sec)的 形式发挥作用，催化GSH分解体内的氢过氧化物。有研究者发现在胶质瘤细胞 中过表达抗氧化酶基因可导致放化疗抗性增强，推测GPx1在胶质瘤干细胞中 的蛋白表达水平和酶活性明显提高可能是胶质瘤干细胞内ROS水平明显降低和 辐射抗性明显增强的重要原因之一。为证实GPx1在胶质瘤干细胞辐射抗性中的 重要作用，利用RNA干扰技术敲低胶质瘤干细胞GPx1，其具体做法可参见前 面一中所述，结果发现胶质瘤干细胞放射敏感性明显增强(参见图11、图12和 表2)。

表2 克隆存活实验检测敲低GPx1对胶质瘤干细胞放射敏感性的影响(n＝3)

  Control Nc-siRNA GPx1-siRNA U87s D₀3.40Gy 3.18Gy 2.75Gy SU-2D₀3.98Gy 3.86Gy 3.12Gy

五、反转录和实时定量PCR检测GPx1mRNA表达和miRNA表达

(1)为分析GPx1在胶质瘤干细胞中蛋白表达上调的机制，我们首先以 Real-time RT-PCR检测GPx1转录水平在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间是否存 在差异，发现在胶质瘤干细胞中GPx1mRNA水平明显高于胶质瘤细胞(参见 图13)。GPx1转录受核因子E-2-相关因子2(Nuclear Factor-E-2-related factor 2，Nrf-2)调控，当细胞微环境内氧化还原处于平衡状态时，Nrf-2与其负性蛋 白伴侣分子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keapl)相结合，存在于细胞质而处于被抑制状态，Keapl可促进Nrf-2被泛 素蛋白酶体降解。当氧化还原失去原有的平衡，细胞质中的Keapl构像和氨基酸 会发生改变，使得Nrf-2与其解离进入核内，启动下游基因的转录，这些基因 受抗氧化反应元件(antioxidant-responsive element，ARE)序列调控，进一步 激活谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶和NAD(P)H-醌还原酶等在内的II 相解毒酶等的表达，从而扭转氧化还原失衡的状态。

(2)因此接下来检测Nrf-2蛋白表达在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间是 否存在差异，发现在胶质瘤干细胞胞浆和胞核中Nrf-2蛋白表达水平均明显高 于胶质瘤细胞，而Keapl蛋白表达水平在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间无明 显差异(参见图14)。上述结果提示，GPx1在胶质瘤干细胞中蛋白表达上调可 能是由其转录调控因子Nrf-2表达增强所介导。

上述方法中所涉及的具体实验步骤如下所述：按Trizol试剂盒说明书提取 总RNA，取总RNA 2ng为初始模板，逆转录反应体系为20μl，反应条件： 16℃下30min，42℃下30min，85℃下10min。GPx1引物序列为F- AAGGTACTACTTA TCGAGAATGTG(SEQ ID NO:3)和R- GTCAGGCTCGATGTCAATGGTCTG(SEQ ID NO:4)；内参GAPDH引物序 列为F-AACGTGTCAGTGGTGGACCT(SEQ ID NO:5)和R- TGCTGTAGCCAAATTCGTTG(SEQ ID NO:6)；PCR反应体系为20μl，反应 条件：95℃3min，95℃12s，58℃30s，40个循环。miRNA表达采用TaqMan  MicroRNA Assay试剂盒检测，按照说明书操作，用2-ΔΔCT法进行相对定量， CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数，目的基因ΔCT值＝目 的基因CT值-同一样本U6CT值，重复3次，取平均值。ΔΔCT值＝处理组目的 基因ΔCT值-对照组目的基因ΔCT值。对照组目的基因表达量为1，处理组目的 基因相对表达量采用2-ΔΔCT表示。

六、免疫共沉淀检测Nrf-2与Keapl的相互作用及采用Real-time PCR分析 microRNA在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间表达水平的变化。

为探求Nrf-2蛋白在胶质瘤干细胞中表达上调的原因；

(1)首先采用免疫共沉淀技术检测Nrf-2与其负性蛋白伴侣分子Keapl的 相互作用是否下降，其具体做法如下所述：收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲 液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，细胞裂解液于4℃，最大转速离心 30min后取上清；裂解液加1μg Keap1抗体，4℃缓慢摇晃孵育过夜；取10μl protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min；将 预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃ 缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在 4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去， 琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS上样缓冲液， 沸水煮5分钟；Western blotting分析。

结果表明在胶质瘤干细胞中Nrf-2与Keapl的相互作用与胶质瘤细胞相比无 明显差异。这可能预示着Nrf-2蛋白在胶质瘤干细胞中表达上调并非Nrf-2与 Keapl的相互作用变化所致(参见图15)。

(2)除Keapl对Nrf-2的翻译后调节之外，microRNA对Nrf-2的转录后调 控也可能是影响其蛋白表达水平的重要因素。Nrf-2 mRNA 3’UTR长428bp，可 能有若干个microRNA的结合位点，采用 miRecords(http://mirecords.biolead.org/)的microRNA靶点预测软件(整合11 种常用的microRNA靶基因预测工具的结果)对Nrf-2 mRNA 3’UTR进行生物 信息学分析，选择至少被6个数据库共同预测的microRNA作为候选，发现 miR-144，153，27a，28和142-5p可能作用于Nrf-2 mRNA 3’UTR。采用Real- time PCR实验进一步分析这5种microRNA在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间 表达水平的变化，具体实验步骤采用本领域常规方法步骤。Real-time PCR结果 显示，miR-27a在胶质瘤干细胞中表达明显上调，miR-144，28和142-5p表达 水平在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间无明显差异，而miR-153在胶质瘤干细 胞中表达明显下调。上述结果提示，miR-153可能作用于Nrf-2 mRNA 3’UTR， 转录后调控其表达(见图16)。

七、为确认miR-153对Nrf-2基因表达的调控作用，采用荧光素酶活性实验 判断miR-153是否直接作用于Nrf-2 3’UTR，具体方法如下所述：PCR扩增 Nrf-2基因3’UTR序列，将Nrf-2基因3’UTR序列(内含miR-153靶点:5’- CTTTATAAG TAATTCTATGCAA-3’(SEQ ID NO:2))连入荧光素酶报告基因 载体中，将报告基因载体、内参质粒和miR-153(5’- UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC-3’)(SEQ ID NO:1)或Scramble control (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)(SEQ ID NO:7)共转染胶质瘤干细 胞，48h后，进行firefly luciferase和renilla luciferase双荧光素酶活性检测，即 采用美国Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒进行荧光 素酶报告基因实验，计算海肾荧光/萤火虫荧光比值，分析miR-153对Nrf-2基 因的调控作用。

结果表明，miR-153可直接作用于Nrf-2 3’UTR导致荧光素酶活性下降 (见图18)，证明Nrf-2是miR-153的靶基因(见图17)。上述结果提示，Nrf- 2蛋白在胶质瘤干细胞中表达上调的原因可能是负性调控其表达的miR-153表 达下调。

八、为探讨miR-153对胶质瘤干细胞生物学特性的影响，利用基因工程技 术构建过表达miR-153成熟序列(5’-UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC-3’) (SEQ ID NO:1)和随机序列(5’-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3’) (SEQ ID NO:8)慢病毒表达载体。其中构建miR-153慢病毒过表达载体Lv- miR-153的过程为：从Sanger MicroRNA数据库(miRBase)获取人miR-153序 列(hsa-mir-153,MI0000463)，根据Mature sequence：84- UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC-105设计成熟寡核苷酸序列(5’- UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC-3’)(SEQ ID NO:9)和随机序列(5’- UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3’)(SEQ ID NO:10)。分别化学合成一对 互补并编码上述成熟和随机对照RNA序列的寡核苷酸链，将2μl浓度为1 μg/μl的互补寡核苷酸链等比混合，退火，形成DNA双链，经酶切、连接，定向 导入慢病毒表达质粒pGLV-GFP中，再经酶切鉴定重组过表达质粒pGLV-miR- 153和对照质粒pGLV-scr。将包装质粒PG-P1-VSVG，PG-P2-REV和PG-P3- RRE分别和上述重组质粒pGLV-miR-153和pGLV-scr，采用磷酸钙沉淀法共转 染293T细胞，待细胞出现病变，收集含病毒上清液。浓缩病毒，测定病毒滴度。

利用上述构建成功的miR-153成熟序列和随机序列分别转染胶质瘤干细胞 株U87s和SU-2。Real-time PCR结果显示，miR-153在转染miR-153成熟序列胶 质瘤干细胞中表达明显上调(见图19)。Western blot法检测miR-153的靶基因 Nrf-2和GPx1的蛋白表达，发现转染miR-153成熟序列胶质瘤干细胞中Nrf-2 和GPx1表达明显下调(见图20)。进一步分析表明，过表达miR-153胶质瘤干 细胞GPx1和GR(谷胱甘肽还原酶)活性明显下降(见图21和图22)，还原 型谷胱甘肽(GSH)明显下降，氧化型谷胱甘肽(GSSH)明显升高(见图23、 图24和图25)。利用CellROX^TM Deep Red检测胶质瘤干细胞ROS水平，发现 基础条件下或8Gy X射线照后1h，过表达miR-153胶质瘤干细胞内ROS水平 明显高于转染随机序列胶质瘤干细胞，表明过表达miR-153导致胶质瘤干细胞 ROS清除能力明显降低(见图26)。

九、利用流式细胞术检测胶质瘤干细胞凋亡水平，其具体实验方法如下所 述：收集细胞，用预冷的PBS洗两次，加入250μl Binding Buffer重悬细胞， 调节其浓度为1×10⁶细胞/ml。取100μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl  Annexin V/PE和10μl 7-AAD，轻轻混匀。避光、室温反应15min。加入400μl  Binding Buffer，混匀，于流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝578nm)细胞早期 凋亡率。通过上述实验发现，基础条件下或5Gy X射线照后48h，过表达miR- 153胶质瘤干细胞凋亡百分率明显高于转染随机序列胶质瘤干细胞(见图27和 图28)。

利用克隆存活实验比较过表达miR-153胶质瘤干细胞与转染随机序列胶质 瘤干细胞放射敏感性的差异，发现过表达miR-153导致胶质瘤干细胞放射敏感 性增强(见图29和表3)。

表3

十、利用神经球形成实验检测胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球形成能力的变化， 该神经球形成实验的方法如下所述：将胶质瘤干细胞以10、100和1000/孔接种 于96孔板，培养12d，计数每孔细胞数大于20的神经球的数量，计算各组胶 质瘤干细胞神经球形成百分率。发现过表达miR-153导致胶质瘤干细胞肿瘤干 细胞球直径减小(见图30)，形成百分率下降(见图31)。

利用细胞免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞干性标志CD133和nestin以及分 化标志GFAP和Tuj-1的蛋白表达(见图32)，其具体实验方法为：固定好的 各组细胞片用PBS水化，5min×3次；滴加山羊血清(北京中杉金桥公司)， 37℃，封闭30min；各组分别滴加小鼠抗人CD133单克隆抗体(1：100，德国 Miltenyi公司)，小鼠抗人nestin单克隆抗体(1:100，美国Chemicon公司)，以及 小鼠抗人GFAP单克隆抗体(1:100，德国Miltenyi公司)和小鼠抗人Tuj-1单克隆 抗体(1:100，德国Miltenyi公司)，4℃过夜；PBS洗涤5min×3次，各组分别滴 加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100，美国Molecular Probes公司)，37℃孵育 30min后，吸去多余二抗液体，滴加20μl DAPI(美国Sigma公司)，室温孵育 10min；PBS洗涤5min×3次；滴加封片剂，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司) 下观察。发现过表达miR-153的胶质瘤干细胞CD133和nestin表达明显下降， 而GFAP和Tuj-1表达明显增强(见图33)。裸鼠颅内移植300个胶质瘤干细胞， 观察各组裸鼠生存时间，发现过表达miR-153的胶质瘤干细胞移植裸鼠平均生 存时间明显长于转染随机序列胶质瘤干细胞的移植裸鼠(见图34)。上述结果 表明过表达miR-153导致胶质瘤干细胞干性下降。

上述具体实施例可总结为如下几点：

1、发现常氧或乏氧培养下胶质瘤干细胞株辐射抗性均明显强于胶质瘤细胞 株，且OER值较低，即胶质瘤干细胞株放射敏感性受氧效应影响相对较小，提 示胶质瘤干细胞株可能具有较强的ROS清除能力。

2、发现基础条件下和射线照后胶质瘤干细胞内ROS水平明显低于相应的胶 质瘤细胞株，表明胶质瘤干细胞ROS清除能力明显强于胶质瘤细胞，这可能是 导致胶质瘤干细胞辐射抗性明显增强的原因之一。

3、发现GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达水平和酶活性明显高于胶质瘤 细胞。

4、敲低胶质瘤干细胞GPx1导致放射敏感性明显增强。

5、发现胶质瘤干细胞中GPx1 mRNA水平明显高于胶质瘤细胞，胶质瘤干 细胞胞浆和胞核中Nrf-2蛋白表达水平均明显高于胶质瘤细胞，而Keapl蛋白表 达水平在胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞之间无明显差异。提示GPx1在胶质瘤干细 胞中蛋白表达上调可能是由其转录调控因子Nrf-2表达增强所介导。

6、Nrf-2蛋白在胶质瘤干细胞中表达上调并非Nrf-2与Keapl的相互作用变 化所致。经生物信息学分析和Real-time PCR检测，发现miR-153可能作用于 Nrf-2 mRNA 3’UTR，转录后调控其表达。

7、采用荧光素酶活性实验证明Nrf-2是miR-153的靶基因。提示Nrf-2蛋白 在胶质瘤干细胞中表达上调的原因可能是负性调控其表达的miR-153表达下调。

8、利用基因工程技术成功构建过表达miR-153成熟序列(5’- UUGCAUAGUCACAAAAGUG AUC-3’)慢病毒表达载体。

9、转染miR-153成熟序列胶质瘤干细胞中Nrf-2和GPx1表达明显下调， GPx1，GR和GSH活性明显下降，GSSH明显升高，ROS清除能力明显降低， 放射敏感性增强。

10、过表达miR-153导致胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球直径减小，形成百分 率下降，干性标志CD133和nestin表达明显下降，而分化标志GFAP和Tuj-1 表达明显增强。

11、过表达miR-153使胶质瘤干细胞移植裸鼠平均生存时间明显延长。

本发明首次提出miR-153通过调节Nrf-2/GPx1/ROS信号通路调控胶质瘤干 细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分子机 制开辟新途径。过表达miR-153可有效克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发 一种新的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供实验依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还 可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。