具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的应用

摘要

本发明公开了具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白酶抑制能力的阻断剂的应用，属于药物领域。它包括修饰有整合素配体序列(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly)的多肽I：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu和多肽II：Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp两种，构建出了两种与整合素有亲和性和结合能力的血管抑制多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到RA中血管翳形成过程中新生血管内皮，抑制MMPs及新生血管形成，进而达到预防或治疗血管及炎症相关疾病的效果，可用血管及炎症相关疾病包括关节炎的预防和治疗、炎症治疗、肿瘤治疗、眼科疾病的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，更具体地说，涉及具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白 酶抑制能力的血管抑制多肽的应用。

背景技术

关节炎、细菌引起的炎症、肿瘤、眼科疾病(如AMD)均被称为血管相关性疾病。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之 一。在全世界约为0.5％-1.0％，RA的发病率在我国约为0.4％。RA可发生于任何年龄，随着 年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男 女之比约1:3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜 关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及 肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状， 但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可 达1h以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。

类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关 节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨 并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节 的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性 疾病。

目前治疗RA的药物分为两大类：控制症状药和控制疾病药。由于RA病因不明，故当 今并无堪称控制疾病的药。控制症状的抗风湿药分为四类：一、非甾体类抗炎药，通常称为 一线药，这类药物种类繁多，国内市场已多达数十种。二、类固醇激素，激素是一个非常好 的止痛抗炎药，但长期单独使用不能改善病情，反而带来许多副作用，激素作为二线慢作用 药起效前的过渡性用是可以的，但用量要小，时间不宜过长。在病情较重，伴有关节外表现 的患者，短期治疗冲击，并联合二线药治疗时必须的。三、慢作用抗风湿药，通常称为二线 药，所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它们治疗RA起效慢，长期 作用对RA病情有一定缓解作用，故也称病情改善药。四、免疫抑制剂：常用有甲氨喋呤、 环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。

RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和 炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因 某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起 类风湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA 患者的滑膜内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多， 而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加 速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B细胞和单核 细胞。

此外，肿瘤、眼病、炎症都是与血管相关的疾病。肿瘤的生长和转移依赖新生血管；眼 科疾病如年龄相关性黄斑变性(AMD)主要表现是脉络膜新生血管的生成；炎症与血管新生 是两个相互联系，共同发展的病理过程。

新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创 伤愈合中是必不可少的过程。血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括：肿 瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、 溃疡性结肠类以及其它炎性障碍。

整合素是一类广泛分布于细胞表面的受体，能介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间 的相互黏附，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用参与血管生成。 目前至少有8种的整合素(α₁β₁、α₂β₁、α₃β₁、α₆β₁、α₆β₄、α₅β₁、αvβ₃、αvβ₅)参与血管生成， 其中αvβ₃发挥着重要作用。αvβ₃能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp，RGD)。 αvβ₃可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合参与肿瘤的血管生 成、侵袭、转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。因此，血管抑制多肽通过 抑制血管生成可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA 滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血 管形成的关键步骤。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类能够联合降解细胞外基质的蛋白质家族，目前已发现 20多种。生理状态下，MMPs在组织中降解和修复细胞外基质。在类风湿性关节炎(RA)以 及肿瘤转移过程中，一系列细胞因子、生长因子以及激素水平的变化引起MMPs水平升高， 使得细胞外基质成分发生不可逆降解及关节破坏。因此，通过抑制MMPs可阻止细胞外基质 的降解、关节破坏以及肿瘤转移。

经过专利检索，中国专利申请号201110182757.3公开了基质金属蛋白酶-9多肽抑制剂4 及其应用，该专利中公开多肽序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu，对其抑制基质金属 蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶以及减轻急性炎症反应对机体破坏的功能进行了初步研究， 但是该发明公开的序列药效差，对人体有很强的毒副作用，无法直接用于临床应用。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有治疗关节炎、细菌引起的炎症、肿瘤、眼科疾病等血管相关性疾病时药物靶向 作用差、治疗效果不佳等问题，本发明提供一种具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋 白酶抑制能力的血管抑制多肽，其对血管以及包括关节炎、炎症、肿瘤、眼科疾病等炎症相 关疾病具有很好预防和治疗作用，增加了其适应症范围。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽的应用。

优选地，所述的阻断剂为多肽I：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip -Arg-Gly-Glu和多肽II：Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)--Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 两种；其中，Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸，D-Pyr是D型吡啶丙 氨酸，D-Cys是D-型半胱氨酸。

优选地，用于治疗与血管新生及炎症相关疾病，包括关节炎的预防和治疗、炎症治疗、 肿瘤治疗、眼科疾病的治疗。

优选地，所述的关节炎为类风湿关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊柱炎、银 屑病关节炎、反应性关节炎、感染性关节炎和创伤性关节炎。

优选地，所述的炎症为急性炎症、亚急性炎症和慢性炎症。

优选地，所述的急性炎症为浆液炎症、纤维素炎症、化脓炎症和出血炎症，所述的亚急 性炎症为肉芽肿性炎症。

优选地，所述的肿瘤为胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胶质瘤、黑色素瘤、宫颈 癌、卵巢癌和前列腺癌。

优选地，所述的眼科疾病为虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生 血管性眼病或角膜新生血管性眼病。

优选地，所述的虹膜新生血管性眼病为新生血管性青光眼、糖尿病视网膜病变或视网膜 中央静脉栓塞引起的虹膜新生血管性眼病；所述的脉络膜新生血管性眼病为年龄相关性黄斑 变性、中心性渗出性视网膜脉络炎、眼组织胞浆菌病综合征或葡行性脉络膜病变脉络膜新生 血管性眼病；所述的视网膜新生血管性眼病为糖尿病、肿瘤、视网膜脱落、视网膜中央静脉 阻塞、视网膜静脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病或Coat病相关的视网膜新生血管性眼 病；所述的角膜新生血管性眼病为角膜接触镜所致角膜新生血管性疾病，以及碱及其他化学 物质烧伤、角膜手术、细菌感染、衣原体感染、病毒感染或原虫感染引起的角膜新生血管性 眼病。

上述的具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽I的制 备方法，其步骤为：

(a)膨胀：称取王树脂13g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂130mL使树 脂充分膨胀；

(b)脱帽：在步骤(a)的玻璃砂芯反应柱中加入25mL脱帽液，密封后放入振荡器中 反应5min，温度控制在室温，反应结束后将脱帽液抽干，用DMF洗涤一次，再次抽干后加 入25mL脱帽液(按体积比计，六氢吡啶：DMF＝4:1)反应15min；

(c)缩合：称取磷酰酪氨酸保护基1.0g和HOBt 2.790g，溶于15mL DMF和3.215mL  N，N'-二异丙基碳二亚胺，然后倒入反应釜中反应1.5h，温度控制在34℃；

(d)洗涤：将步骤(c)中缩合反应的反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取 20颗树脂在小试管内，加入二氢茚三酮验色剂，若为无色，说明氨基完全结合；若为蓝色， 说明氨基未完全结合，则从步骤(b)开始重新合成，在115℃条件下加热3-5min，其中二氢 茚三酮验色剂由A液、B液和C液按体积比4:3:3混合组成，A液为质量分数为80％的苯酚 乙醇溶液，B液为重蒸后的吡啶，C液为5g茚三酮溶于100mL无水乙醇中得到；

(e)切肽：将步骤(d)中抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入切割液密封反应 2h，反应结束后用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，得到多肽切割液，所述的切割液由TFA(三 氟乙酸)、苯酚、水、苯甲硫醚和EDT按体积比(88-92):(2.5-3.53):(2.5-3.5):(1.5-2.5): (1.5-2.5)组成；

(f)后处理：加无水乙醚到步骤(e)得到的多肽切割液中，离心后去除上清液，然后再 用无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽I粗品8.6g；

(g)一次纯化：用纯化水将步骤(f)中得到的多肽I粗品配置成10g/L的溶液，超声搅拌 至无颗粒状澄清溶液，用沙芯过滤器0.45μm的混合滤膜过滤得到多肽I溶液；用制备柱分离 纯化得到的多肽I溶液，制备柱先用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡10min，其中乙腈、三氟乙酸 和水的体积比为12:0.1:88，流速为60mL/min，平衡结束后上样，流速为60mL/min，采集基 线，上样结束后按照表1中的条件对制备柱中的多肽I粗品进行洗脱，收取在紫外波长220nm 处吸收大于200mv的溶液，检测纯度大于95％的溶液合并作为多肽I的一次纯化溶液；

表1.洗脱条件

(h)二次纯化：将步骤(g)中得到的多肽I的一次纯化溶液中的有机溶剂旋转蒸发掉， 然后制备柱分离纯化，制备柱用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡10min，其中乙腈、三氟乙酸和水 的体积比为14:0.1:86，流速为60mL/min，平衡结束后上样，流速为80mL/min，采集基线， 上样结束后按照表2中的条件对制备柱中的多肽I的一次纯化溶液进行洗脱，收取在紫外波 长220nm吸收大于200mv的溶液，检测纯度大于99％的溶液合并作为多肽I的二次纯化溶 液；

表2.洗脱条件

(i)冻干：将步骤(h)中得到的多肽I的二次纯化溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩， 除去残留溶剂和注射用水，然后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进 行冷冻干燥，得到多肽I的纯品。

前面所述的具有整合素亲和性和结合能力及基质金属蛋白酶抑制能力的血管抑制多肽II 的制备方法，其步骤为：

(a)膨胀：称取王树脂预装树脂14.5g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂145 mL使树脂充分膨胀；

(b)脱帽：在步骤(a)的玻璃砂芯反应柱中加入25mL脱帽液，密封后放入振荡器中 反应5min，温度控制在室温，反应结束后将脱帽液抽干，用DMF洗涤一次，再次抽干后加 入25mL脱帽液(按体积比计，六氢吡啶：DMF＝4:1)反应15min；

(c)缩合：称取磷酰酪氨酸保护基0.8g和HOBt 1.820g，溶于15mL DMF和2.098mL  N，N'-二异丙基碳二亚胺，然后倒入反应釜中反应1.5h，温度控制在34℃；

(d)洗涤：将步骤(c)中缩合反应的反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取 20颗树脂在小试管内，加入二氢茚三酮验色剂，若为无色，说明氨基完全结合；若为蓝色， 说明氨基未完全结合，则从步骤(b)开始重新合成，在115℃条件下加热3-5min，其中二氢 茚三酮验色剂由A液、B液和C液按体积比4:3:3混合组成，A液为质量分数为80％的苯酚 乙醇溶液，B液为重蒸后的吡啶，C液为5g茚三酮溶于100mL无水乙醇中得到；

(e)切肽：将步骤(d)中抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入切割液密封反应 2h，反应结束后用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，得到多肽切割液，所述的切割液由TFA(三 氟乙酸)、苯酚、水、苯甲硫醚和EDT按体积比(88-92):(2.5-3.5):(2.5-3.5):(1.5-2.5): (1.5-2.5)组成；

(f)后处理：加无水乙醚到步骤(e)得到的多肽切割液中，离心后去除上清液，然后 再用无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽II粗品8.3g；

(g)一次纯化：用纯化水将步骤(f)中得到的多肽II粗品配置成10g/L的溶液，超声 搅拌至无颗粒状澄清溶液，用沙芯过滤器0.45μm的混合滤膜过滤得到多肽II溶液；用制备 柱分离纯化得到的多肽II溶液，制备柱先用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡10min，其中乙腈、三 氟乙酸和水的体积比为12:0.1:88，流速为60mL/min，平衡结束后上样，流速为60mL/min， 采集基线，上样结束后按照表3中的条件对制备柱中的多肽II粗品进行洗脱，收取在紫外波 长220nm处吸收大于200mv的溶液，检测纯度大于95％的溶液合并作为多肽II的一次纯化 溶液；

表3.洗脱条件

(h)二次纯化：将步骤(g)中得到的多肽II的一次纯化溶液中的有机溶剂旋转蒸发掉， 然后制备柱分离纯化，制备柱用乙腈-三氟乙酸水溶液平衡10min，其中乙腈、三氟乙酸和水 的体积比为14:0.1:86，流速为60mL/min，平衡结束后上样，流速为80mL/min，采集基线， 上样结束后按照表4中的条件对制备柱中的多肽II的一次纯化溶液进行洗脱，收取在紫外波 长220nm吸收大于200mv的溶液，检测纯度大于99％的溶液合并作为多肽II的二次纯化溶 液；

表4.洗脱条件

(i)冻干：将步骤(h)中得到的多肽II的二次纯化溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩， 除去残留溶剂和注射用水，然后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进 行冷冻干燥，得到多肽II的纯品。

本发明的难点在于：现有技术中的序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu具有一定的 基质金属蛋白酶抑制能力和血管抑制活性，但因为基质金属蛋白酶是一类对人体非常重要的 蛋白酶类，在组织中能降解和修复细胞外基质，过度抑制其活性会扰乱人体的正常生理功能， 而小分子多肽序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu在实验研究过程中发现有很强的毒副 作用，无法直接应用于临床。本发明在研究中意外地发现，如果将RGD序列(即 Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp序列)与Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)- Bip-Arg-Gly-Glu连接，能显著增加修饰后的Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu的靶向性， 使得改造后的多肽能够特异性地到达整合素表达异常的细胞或组织，增强其药效且无毒副作 用。多肽类分子是一类特殊的生物大分子，即使一个氨基酸的改变，也可能使其失去活性， 所以不是有一个想法就可以很轻易地得到目的分子和达到目的效果。本发明在设计将序列 Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu两端连接RGD序列时，进行了大量的试验筛选和活性检 测，以保证修饰后的序列活性不变。本发明综合利用计算机模拟和实验相结合的方法，首先 对RGD序列修饰前后的Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu序列进行靶点结合的计算机模 拟，优化结合条件，寻找最佳的结合方式，同时在体外进行实验，比较修饰前后的序列对几 种靶点酶(基质金属蛋白酶MMP-3，MMP-8，MMP-9及肿瘤坏死因子释放酶)的IC50值， 通过试验发现，修饰后的多肽安全性更好，活性提高，且具有靶向性强，半衰期相对延长的 优点。因此，本发明中修饰了RGD序列的Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu序列(即本 发明中的多肽I和多肽II)更具有新药开发价值。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明中的多肽序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu具有抑制基质金属蛋白 酶肿瘤坏死因子释放酶的作用，Arg-Gly-Asp(RGD)序列是整合素的一个重要配体，含有 RGD序列的多肽Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp能够特异性的识别整合素；本发明中的多肽是 在序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu的N端或者C端连接上与整合素家族具有亲和性 和结合能力的Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly或者Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp序列，构建出 了两种与整合素有亲和性和结合能力的整合素阻断剂多肽，由于RGD序列的靶向性，本发明 的多肽不仅具有抑制基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶以及减轻急性炎症反应对机体 破坏的功能，而且可以靶向到RA血管翳形成过程中的新生血管内皮，抑制MMPs及新生血 管形成，进而达到预防或治疗血管及炎症相关疾病的效果，且多肽II的效果好于多肽I；

(2)本发明在序列Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu的基础上，多肽I、II加入RGD 序列(Arg-Gly-Asp)，使该多肽序列对整合素具有靶向结合作用和亲和性，并通过抑制胞内细 胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用，来抑制细胞与细胞外介质及细胞与细胞间的信号 传导，从而抑制血管生成，前期研究发现多肽能够抑制内皮细胞的增殖、迁移，并发现其能 抑制多种肿瘤细胞的生长；进一步研究证实其对类风湿性关节炎有一定的治疗作用，此外对 眼科疾病也就有很好的治疗效果；

(2)本发明经过大量实验获知多肽I和多肽II不仅能够对Wistar大鼠棉球肉芽肿的亚急 性炎症具有很好的抑制作用，并且能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和CAB/1小鼠胶原型类 风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果，并且副作用少， 用量少成本降低；

(3)本发明中的血管抑制多肽在体外能够明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、 迁移，对人宫颈癌HeLa细胞、人结肠癌HCT 116细胞、人脑胶质瘤U87细胞、人乳腺癌 MDA-MB-231等多种肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用；

(4)本发明中的多肽I和多肽II经实验证实均能够抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC) 的增殖，在一定范围内呈剂量依赖关系；在鸡胚尿囊绒膜(CAM)体内血管生成活性实验中， 两种阻断剂多肽显现出了抑制鸡胚尿囊绒膜新生血管生成的活性，实验结果表明，本发明的 整合素阻断剂能够抑制蛋白酶活性和血管的新生，具有潜在的治疗新生血管性疾病的作用；

(5)本发明的血管抑制多肽对小鼠角膜新生血管和兔虹膜新生血管的作用，表明多肽I 和多肽II均能够抑制角膜和虹膜新生血管的生长，有潜力开发为治疗角膜新生血管性眼病和 虹膜新生血管性眼病的药物，同时通过对大鼠脉络膜新生血管的作用，表明两种多肽能够抑 制大鼠脉络膜新生血管的生成，说明本发明的多肽对脉络膜新生血管性眼病具有一定的治疗 作用；

(6)本发明中对OIR小鼠模型施用多肽I、多肽II后，两种多肽均能够改善视网膜病理 性新生血管的形成，减少了视网膜中新生血管丛，说明本发明的血管抑制多肽能够抑制小鼠 眼部视网膜的新生血管形成，在一定程度上能够预防或治疗视网膜新生血管性眼病；同时对 早产儿视网膜病变大鼠模型以及新生血管和糖尿病视网膜病变大鼠模型新生血管的作用，表 明多肽I、多肽II均能够抑制视网膜病理性新生血管的生长，从而有希望作为治疗视网膜新 生血管性眼病的药物；

(7)本发明申请的多肽I、多肽II科学合理、可行有效，能作为制备治疗血管以及包括 关节炎、炎症、肿瘤、眼科疾病等炎症相关疾病的药物，极大拓展了该类基质金属蛋白酶治 疗谱，为将来药物开发提供新的思路和前景。

附图说明

图1为RP-HPLC检测血管抑制多肽I的纯度；

图2为RP-HPLC检测血管抑制多肽II的纯度；

图3为MS检测血管抑制多肽I的分子量；

图4为MS检测血管抑制多肽II的分子量；

图5为多肽I对佐剂型原发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

图6为多肽I对佐剂型继发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

图7为多肽I对大鼠佐剂型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；

图8为多肽I对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型左足足爪肿胀度的影响；

图9为多肽I对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型右足足爪肿胀度的影响；

图10为多肽I对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；

图11为多肽II对佐剂型原发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

图12为多肽II对佐剂型继发性关节炎模型大鼠足爪肿胀度的影响；

图13为多肽II对大鼠佐剂型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；

图14为多肽II对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型左足足爪肿胀度的影响；

图15为多肽II对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型右足足爪肿胀度的影响；

图16为多肽II对DAB/1小鼠胶原型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；

图17为多肽I对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制作用；

图18为多肽II对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制作用；

图19为多肽I、多肽II对多种肿瘤细胞增殖抑制作用；

图20为多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

图21为多肽II对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

图22为多肽I、多肽II对大鼠脉络膜新生血管的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

血管抑制多肽合成肽I的制备及检验

多肽I Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(D-Pyr)-(D-Cys)--Bip-Arg-Gly-Glu的固相合成方 法，其以wang resin为起始原料，用保护氨基酸依次接一肽至十四肽，接肽工作完成后充分 洗涤，然后切肽、后处理得到多肽I粗品。用制备型高效液相对粗品进行两次纯化，最后浓 缩冻干得到纯品。分析型RP-HPLC测定多肽的纯度。该方法不仅能保证合成的效率，还可提 高产物纯度。

具体步骤如下：

一、合成：

称取Wang resin(王树脂)13g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂130mL使 树脂充分膨胀。

脱帽：加入25mL脱帽液，密封后放入振荡器中反应5min，温度控制在室温，5min 后将脱帽液抽干，用DMF洗涤一次，然后再加入25mL脱帽液(按体积比计，六氢吡啶： DMF＝4:1)反应15min；

缩合：称取磷酰酪氨酸保护基1.0g和HOBt 2.790g，溶于15mL DMF和3.215mL DIC (N，N'-二异丙基碳二亚胺)，然后倒入反应釜中反应1.5h，温度控制在34℃左右；

洗涤：将反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取20颗树脂在小试管内，加入二 氢茚三酮验色剂，若为无色，说明氨基完全结合；若为蓝色，说明氨基未完全结合，则重新 开始合成，在115℃条件下加热3-5min，其中二氢茚三酮验色剂由A液、B液和C液按体积 比4:3:3混合组成，A液为质量分数为80％的苯酚乙醇溶液，B液为重蒸后的吡啶，C液为5 g茚三酮溶于100mL无水乙醇中得到；

切肽：把抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入切割液(按体积比计，TFA(三氟 乙酸)：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT＝90:3:3.5:2:2.5，密封反应2h，用砂芯漏斗将树脂与多肽 分离；

后处理：先加无水乙醚到切割液中将多肽I完全析出，然后离心弃上清，然后再用无水 乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽粗品8.6g。

二、纯化：

溶解：精密称取多肽I粗品，加入适当的纯化水配置成10g/L的溶液，超声搅拌至无颗 粒状澄清溶液。

过滤：将多肽I的溶液用沙芯过滤器0.45μm的混合滤膜过滤。

一次纯化：

平衡：制备柱用12％乙腈(含0.1％TFA)+88％水溶液(含0.1％TFA)平衡10min，流 速为60mL/min。

上样：用输液泵上样，流速60mL/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm处吸收大 于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：按照表1中的条件对多肽I粗品进行洗脱，收取在紫外波长220nm处吸收大于200 mv的溶液，检测纯度大于95％的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。

表1.洗脱条件

二次纯化

平衡：制备柱用14％乙腈(含0.1％TFA)+86％水溶液(含0.1％TFA)平衡10min，流 速为60mL/min。

上样：将一次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，流速80mL/min，并采 集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：按照表2中的条件对经过一次纯化后的多肽I粗品进行洗脱，收取在紫外波长220 nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于99％的作为合格。

表2.洗脱条件

浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。 最后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得多肽纯品。

三、纯度检测及分子量检测

收集冻干后的纯化产物，通过反相液相检测多肽纯度分析纯度，分析条件为：

流动相：ACN(含0.1％TFA)、H₂O(含0.1％TFA)；ACN线性梯度：15％-40％；流 速：1mL/min；运行时间：25min；上样量：10μL；检测波长：220nm；分析柱：4.6×250mm， Kromasil C18-5；待检品溶液制备：多肽I供试品适量，精密称定，加水溶解配制成1mg/mL 的供试品溶液。

表3.RP-HPLC检测整合素阻断剂多肽I的纯度

合成的血管抑制多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果见表3、图1，多肽I纯度为 98.49％，纯度均大于95％，符合设计要求。

质谱分析结果见图3，结果显示多肽I分子量大小均为1488.57Da，与多肽理论分子量相 符。

实施例2

血管抑制多肽合成肽II的制备及检验

Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp的固相合成方法，其 以Fmoc-Asp(OtBu)-wang resin为起始原料，用保护氨基酸依次接二肽至十四肽，接肽工作完 成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多肽II粗品。用制备型高效液相对粗品进行两次纯化， 最后浓缩冻干得到纯品。具体步骤如下：

一、合成：

称取Fmoc-Asp(OtBu)-wang resin(王树脂预装树脂)14.5g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱 中，加入CH₂Cl₂145mL使树脂充分膨胀。

脱帽：加入25mL脱帽液，密封后放入振荡器中反应5min，温度控制在室温，5min后 将脱帽液抽干，用DMF洗涤一次，然后再加入25mL脱帽液脱帽液(按体积比计，六氢吡 啶：DMF＝4:1)反应15min；

缩合：称取磷酰酪氨酸保护基0.8g和HOBt 1.820g，溶于15mL DMF和2.098mL DIC (N，N'-二异丙基碳二亚胺)然后倒入反应釜中反应1.5h，温度控制在34℃；

洗涤：将反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取20颗树脂在小试管内，加入二 氢茚三酮验色剂，若为无色，说明氨基完全结合；若为蓝色，说明氨基未完全结合，则重新 开始合成，在115℃条件下加热3-5min，其中二氢茚三酮验色剂由A液、B液和C液按体积 比4:3:3混合组成，A液为质量分数为80％的苯酚乙醇溶液，B液为重蒸后的吡啶，C液为5 g茚三酮溶于100mL无水乙醇中得到；

切肽：把抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入切割液(按体积比计，TFA(三氟 乙酸)：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT＝90:3:3.5:2:2.5，密封反应2h，用砂芯漏斗将树脂与多肽 分离；

后处理：先加无水乙醚到切割液中直至多肽II完全析出，然后离心，把清液倒掉，然后 再用无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽粗品8.3g。

二、纯化：

溶解：精密称取多肽II粗品，加入适当的纯化水配置成10g/L的溶液，超声搅拌至无颗 粒状澄清溶液。

过滤：将多肽II的溶液用沙芯过滤器0.45μm的混合滤膜过滤.

一次纯化：

平衡：制备柱用12％乙腈(含0.1％TFA)+88％水溶液(含0.1％TFA)平衡10min，流 速为60mL/min。

上样：用输液泵上样，流速60mL/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于 200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：按照表4中的条件对多肽II粗品进行洗脱，收取在紫外波长220nm吸收大于200 mv的溶液，检测纯度大于95％的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。

表4.洗脱条件

二次纯化：

平衡：制备柱用14％乙腈(含0.1％TFA)+86％水溶液(含0.1％TFA)平衡10min，流 速为60mL/min。

上样：将一次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，流速60mL/min，并采 集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。

洗脱：按照表5中的条件对经过一次纯化后的多肽II粗品进行洗脱，收取在紫外波长220 nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于99％的作为合格。

表5.洗脱条件

浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。 最后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到多肽II的 纯品。

三、纯度检测及分子量检测

收集冻干后的纯化产物，通过反相液相检测多肽纯度分析纯度，分析条件为：

流动相：ACN(含0.1％TFA)+H₂O(含0.1％TFA)；ACN线性梯度：23％-48％；流速： 1mL/min；运行时间：25min；上样量：10μL；检测波长：220nm；分析柱:4.6×250mm， Kromasil C18-5；待检品溶液制备：多肽II供试品适量，精密称定，加水溶解配制成1mg/mL 的供试品溶液。

表6.RP-HPLC检测整合素阻断剂多肽II的纯度

合成的血管抑制多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果见表6、图2，多肽II纯度 为96.14％，纯度均大于95％，符合设计要求。

质谱分析结果见图4，结果显示多肽II分子量大小均为1488.57Da，与多肽理论分子量 相符。

实施例3

血管抑制多肽对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究血管抑制多肽对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis, AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，清洁级wistar大鼠63只(由扬州大学比较 医学中心)提供，动物生产许可证号码：SCXK(苏)2012-0004)，雄性，体重为150g—180g， 随机分成9组，分别是空白对照组，模型对照组，多肽I低中高3个剂量组(3，6，9mg/kg)， 多肽II低中高3个剂量组(3，6，9mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)。除空白组 外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分 枝杆菌(H37RA，10mg/mL)完全弗氏佐剂0.08mL造成大鼠佐剂性关节炎模型。第19天出现 继发性炎症开始皮下注射给药：多肽I低中高3个剂量组(3，6，9mg/kg)：每日一次，连 续10天；多肽II低中高3个剂量组(3，6，9mg/kg)：每日一次，连续10天；阳性药对照 组(甲氨蝶呤1mg/kg)：每五天一次，连续3次；空白对照组和模型对照组(生理盐水)：连 续10天。分别于造模后第1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31天称重，造模后第 19，22，25，28，31天进行关节评分以及左右后足足爪肿胀度的测量来观察药物对大鼠佐剂 型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)体重

分别于造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31天称重，并记录数据。

2)关节评分

四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾 关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝 关节在内的全部足爪肿胀。大鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后第19，22，25，28，31天进行关节评分，并记录结果。

3)测量足爪肿胀度

分别于造模前和造模后1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31用排水法测量大鼠 左后足足爪肿胀度并记录结果；造模前和造模后第19，22，25，28，31天测量大鼠右后足足 爪肿胀度并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示，用SPSS 11.0软件进行 各给药组与对照组之间进行t检验，表中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

结果：造模后大鼠与正常大鼠相比较，在大鼠左后足跎处注射含灭活的结核分枝杆菌完 全弗氏佐剂后，左后足会迅速产生原发性关节炎，出现明显的肿胀，并伴有溃烂；右后足大 约19d后开始出现继发性关节炎。血管抑制多肽在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型体内免疫保 护作用结果见表3，由表可知，血管抑制多肽I、多肽II在佐剂诱导大鼠关节炎动物模型都能 发挥体内免疫保护作用，具体结果如下：

血管抑制多肽I对大鼠原发性关节炎足爪肿胀度的影响见图5，大鼠阳性对照组左后足足 爪肿胀度与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)；血管抑制多肽I中、高剂量组左后 足足爪肿胀度与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，实验结果具有统计学意义。血管抑 制多肽I对大鼠继发性关节炎足爪肿胀度的影响见图6，大鼠阳性对照组、血管抑制多肽I高 剂量组右后足足爪肿胀度与模型组比较，有极显著性差异(P<0.01)；多肽I低、中剂量右 后足足爪肿胀度与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。血管抑制多肽I对佐剂型关节炎 大鼠临床评分的影响见图7，多肽I低、中剂量组四肢评分极显著低于模型对照组(P＜0.01)； 高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P<0.05)，与模型对照组比较差异均有统计学意义。 血管抑制多肽I对佐剂型关节炎大鼠体重影响见图8，多肽I高、中、低剂量组体重增加值都 高于模型对照组。

血管抑制多肽II对大鼠原发性关节炎足爪肿胀度的影响见图13，大鼠阳性对照组左后足 足爪肿胀度与模型组比较，有极显著性差异(P<0.01)；血管抑制多肽II低、中高剂量组左 后足足爪肿胀度都低于模型组，实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽II对大鼠继发性关 节炎足爪肿胀度的影响见图14，大鼠阳性对照组、血管抑制多肽II中剂量组右后足足爪肿胀 度与模型组比较，有极显著性差异(P<0.01)；多肽II低、高剂量组右后足足爪肿胀度与模 型组比较，有显著性差异(P<0.05)。血管抑制多肽II对佐剂型关节炎大鼠临床评分的影响 见图15，多肽II中剂量组四肢评分极显著低于模型对照组(P＜0.01)；而低、高剂量四肢 评分显著低于模型对照组(P<0.05)，与模型对照组比较差异均有统计学意义。血管抑制多 肽II对佐剂型关节炎大鼠体重影响见图16，多肽II高、中、低剂量组体重都高于模型对照组。

表7.血管抑制多肽对佐剂型类大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01.

结论：血管抑制多肽I和多肽II对AA大鼠关节炎具有治疗作用，比较而言多肽I组的 作用效果要高于多肽II。

实施例4

血管抑制多肽在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究血管抑制多肽对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen  induced arthritis,CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DAB/1小鼠90只(由上海 西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab.Animal Ltd)提供，动物生产许可证 号码：SCXK((沪)2008-0016)，雄性，7-8周龄，体重为18-22g，随机分成9组，分别是 空白对照组，模型对照组，多肽I低中高3个剂量组(6，12，18mg/kg)多肽II低中高3个剂量 组(6，12，18mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤2mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建 立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨II型胶原(cII)用0.1mol/L醋酸溶解成4mg/mL的溶液，于4℃冰 箱过夜。实验当天用II型胶原与含4mg/mL Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv的完全弗氏 佐剂(CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50μl进行致 敏，21d后用4mg/mL的II型胶原(cII)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的 乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30d起皮下注射给药：多肽I3个剂量组(6，12，18mg/kg)： 每日一次，连续10天；多肽II3个剂量组(6，12，18mg/kg)：每日一次，连续10天；阳性 药对照组(甲氨蝶呤2mg/kg)：每五天一次，连续3次；空白对照组和模型对照组(生理盐水)： 连续10天。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分考察血管抑制多肽对小鼠 佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

1)体重

分别于造模后第21天至第70天每3天称重，并记录数据。

2)关节评分

四肢:按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾 关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包 括踝关节在内的全部足爪肿胀。小鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后第21天至第70天每3天进行关节评分，并记录结果。

3)测量足爪肿胀度

分别于造模前和造模后第21天至第70天每3天用排水法测量小鼠左、右足足爪肿胀度， 并记录结果。

试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean±SD)表示,用SPSS 11.0软件进行 各给药组与对照组之间进行t检验,表中*表示p<0.05，**表示p<0.01。

结果：造模后小鼠与正常小鼠相比较，在小鼠尾部皮内注射含灭活的结核分枝杆菌完全 弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂，21天后尾部皮内注射不完全弗氏佐剂和胶原等体积混 合的乳化剂左后，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60 天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。血管抑制多肽在 胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用见表4。

由表可知，血管抑制多肽I、多肽II在胶原诱导小鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护 作用，具体结果如下：

血管抑制多肽I对小鼠胶原型关节炎左足足爪肿胀度的影响见图9，阳性对照组、血管抑 制多肽I高、中、低剂量组左后足足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(P<0.01) 实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽I对小鼠胶原型关节炎右足足爪肿胀度的影响见图 10，阳性对照组、血管抑制多肽I高、中、低剂量组右后足足爪肿胀度与模型组比较，均有 极显著性差异(P<0.01)，实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽I对胶原型关节炎小鼠 临床评分的影响见图11，多肽I低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P＜0.01)， 与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽I对胶原型关节 炎小鼠体重影响见图12，多肽I高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组(P＜0.01)，与 模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。

血管抑制多肽II对小鼠胶原型关节炎左足足爪肿胀度的影响见图17，阳性对照组、血管 抑制多肽II高、中、低剂量组左后足足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(P<0.01) 实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽II对小鼠胶原型关节炎右足足爪肿胀度的影响见图 18，阳性对照组、血管抑制多肽II高、中、低剂量组右后足足爪肿胀度与模型组比较，均有 极显著性差异(P<0.01)，实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽II对胶原型关节炎小鼠 临床评分的影响见图19，多肽II低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P＜0.01)， 与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。血管抑制多肽II对胶原型关节 炎小鼠体重影响见图20，多肽II高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组(P＜0.01)， 与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。

表8.血管抑制多肽对胶原型类小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01.

结论：血管抑制多肽I和多肽II对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用，比较而言多肽II组 的作用效果要高于多肽I。

实施例5

血管抑制多肽对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀急性炎症模型体内免疫保护作用

采用足测定方法(毛细血管放大法)，在其右后肢踩关节处用圆珠笔(或脂溶性标记笔)作一 标志，将动物右后足浸入足容积测定装置内。浸入深度以标记处为界，以该装置的刻度吸管 处读取数值即为动物右后肢的正常体积。各组皮下给药，连续给药3d，空白对照组给予等体 积的生理盐水。末次给药前测致炎前大鼠右后足容积，末次给药后1h，于大鼠右后足跖皮下 注射1％角叉菜胶0.1mL致炎，分别于致炎后1h，3h，5h，7h测量足容积。按照下列公式 计算足肿胀度：足肿胀度(mL)＝致炎后足容积-致炎前容积。比较给药组和对照组的差异。

表9.多肽I对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型急性炎症体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01

表10.多肽II对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀模型急性炎症体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01.

结果见表9和表10，多肽I低剂量在7h能够抑制角叉菜胶诱导诱导的大鼠足趾肿胀急 性关节炎模型，中剂量在1h和7h能够抑制角叉菜胶诱导诱导的大鼠足趾肿胀急性关节炎模 型，高剂量在1h和3h角叉菜胶诱导诱导的大鼠足趾肿胀急性关节炎模型。

实施例6

血管抑制多肽对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症模型体内免疫保护作用

大鼠用乙醚浅麻醉，在无菌操作下，于左、右两侧腋下各植入棉球1个，缝合皮肤。连 续给药后7d，将动物处死，取出棉球，放入小皿内，60℃烘箱2h，称重，减去原棉球重， 即为肉芽肿重量。实验设置对照组、阳性药物对照组、受试药物低中高三个剂量。术后当天 开始皮下给药，连续给药7d。比较用药组和空白对照组肉芽肿的差异。抑制率(％)＝1-给 药组肉芽肿平均值/对照组肉芽肿平均值。

表11.多肽I，多肽II对大鼠棉球肉芽肿亚急性炎症模型体内免疫保护作用

*表示p<0.05，**表示p<0.01

结果：见表11，地塞米松2.5mg/kg对大鼠棉球肉芽肿抑制率为69.63％；多肽I高中低 剂量对大鼠棉球肉芽的抑制率分别为34.89％，35.11％，30.74％；多肽II高中低剂量对大鼠棉 球肉芽的抑制率分别为34.72％，24.72％，28.22％。

多肽I，多肽II对大鼠棉球肉芽肿抑制结果表明，与空白对照组相比较，多肽I在6mg/kg 和9mg/kg对大鼠棉球肉芽肿具有显著的抑制作用。*P<0.05(和空白对照组比较有显著性差 异)。

实施例7

血管抑制多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制作用

将10mg/mL Matrigel用HUVEC专用培养基以1:2稀释，涂布于transwell小室膜上，室 温风干。将培养到对数生长期的HUVEC细胞用胰蛋白酶消化液消化，收集，用PBS洗涤两 次后用空白HUVECs专用培养基重悬。在显微镜下计数，将细胞浓度调整到1×10⁵个/mL。 配制各组的试验用液，用空白HUVECs专用培养基稀释到100μL。将细胞接种到transwell 小室中，每孔100μL，并且将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0.6mL含5％胎牛血 清和1％ECGS的内皮细胞培养液刺激细胞迁移，于5％CO₂，37℃培养24h。弃去孔中培液， 用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层 未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration  inhibition，MI)：

$\mathrm{MI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\times 100\%$

其中N_test为测试组的细胞迁移数，N_control为空白对照组的细胞迁移数。试验独立重复3 次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01 为极显著性差异。

表12.血管抑制多肽I对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表12和图17，在血管抑制多肽I的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空 白对照组相比，多肽I能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在2μg/mL 和4μg/mL两个剂量下，多肽I对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P ＜0.01)，抑制率均达到50％以上，分别为50.79％和62.21％，当剂量为4μg/mL时，血管抑 制多肽I对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值62.21％。

表13.血管抑制多肽II对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表13和图18，在血管抑制多肽II的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与 空白对照组相比，多肽II能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在2 μg/mL、4μg/mL和8μg/mL三个剂量下，多肽II对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极 显著性差异(**P＜0.01)，当剂量为4μg/mL时，血管抑制多肽II对HUVEC细胞迁移的抑制 率达到最大值63.07％。

实施例8

血管抑制多肽对多种肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法检测血管抑制多肽抑制多种肿瘤细胞增殖的活性。多种肿瘤细胞细胞在 37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞 并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔 100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将多肽I、多肽II、Taxol用培养液稀释到 各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加入 血管抑制多肽作为给药组，Taxol作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组， 在37℃，5％CO₂培养箱孵育48h。向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养 4h。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波长为630 nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

$\mathrm{PI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\times 100\%$

其中N_test为测试组的OD值，N_control为空白对照组的OD值。

表14.整合素阻断剂对多种肿瘤细胞增殖抑制作用

血管抑制多肽对多种肿瘤细胞增殖抑制作用见表14和图19，多肽I和多肽II在最佳剂 量8μg/mL和5μg/mL时，都能抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、胶质瘤、黑色素 瘤、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌等多种癌细胞的增殖，从而达到抑制这些肿瘤增殖的效果。

实施例9

血管抑制多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

采用MTT法检测血管抑制多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。HRCEC细胞在 37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞 并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔 100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。将多肽I、多肽II、Avastin用培养液稀释 到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL。以加 入血管抑制多肽作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对 照组，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48h。向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继 续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测，参比波 长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

$\mathrm{PI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\times 100\%$

其中N_test为测试组的OD值，N_control为空白对照组的OD值。试验独立重复3次，得到 的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差 异。

表15.多肽I对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用a

结果：见表15和图20，与阴性对照相比，在0.5-64μg/mL剂量下，血管抑制多肽I能够 显著抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖作用，并且呈现剂量依赖关系，当血管抑制 多肽I的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值87.49％。

表16.多肽II对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表16和图21，与阴性对照相比，多肽II能够抑制HRCEC的增殖作用，在4-64 μg/mL剂量下，多肽II对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)， 并且呈现剂量依赖关系。当血管抑制多肽II的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率 达到最大值89.60％。

实施例10

血管抑制多肽对BALB/c小鼠角膜新生血管的作用

(1)BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：

健康BALB/c小鼠20只，雄性，体重20-25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属 器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前1d予0.3％氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经 腹腔注射1.8％Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于1mol/L氢氧化 钠溶液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃 掉滤纸，立即用15mL的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊1min。棉签拭去过多水分，于手术 显微镜下以角膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角 膜缘，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

(2)实验动物分组及标本获取

20只小鼠按随机分组，标记为多肽I实验组、多肽II实验组和对照组，每组5只，自碱 烧伤后分别给予50μg多肽I、50μg多肽II和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1周， 碱烧伤后1d、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧 伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即以 颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4％多聚甲醛固定1.5h，含30％ 蔗糖的PBS中脱水过夜，OCT冰冻切片包埋剂包埋，-80℃冰箱中保存，8μm冰冻切片，免 疫组织化学法检测CD31的表达。

(3)角膜组织微血管密度定量测定

微血管密度(Microvessel density，MVD)是评价血管形成的指标。我们采用抗CD31抗体 免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，由此来衡量新生血管生 成的程度。统计微血管的标准：显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚，并被染成棕 黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10×20镜下计数整张切片新生血管数目， 角膜组织片照相后以图像处理软件Image J计算出整个角膜组织片面积，求出该例整张切片的 新生血管密度，并计算血管抑制多肽对血管新生的抑制率。

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05 为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表17.血管抑制多肽对小鼠角膜新生血管的作用^a

血管抑制多肽对小鼠角膜新生血管的作用结果见表17：CD31作为微血管标记物，主要 表达于血管内皮细胞胞质中，染色阳性细胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，无背景染色。 多肽I、多肽II实验组CD31阳性新生血管与对照组相比显著减少。多肽I实验组切片MVD 值为37.61±3.56，多肽II实验组MVD值为29.87±3.43与对照组72.66±6.31比较有极显著性 差异，多肽I、多肽II对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为48.24％、58.89％。实验 结果表明多肽I、多肽II两种整合素阻断剂均能够极显著抑制角膜新生血管的生长，能够作 为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

实施例11

血管抑制多肽对家兔虹膜新生血管的作用

采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA)证 实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影(IFA)显示虹膜血管与正常对照组对比荧 光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。

取造模成功的12只眼，随机分成4组，每组3只。分别标记为阴性对照组、多肽I治疗 组、多肽II治疗组，分别以生理盐水、150μg多肽I、150μg多肽II玻璃体腔注射给药，每 日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。

结果：光学显微镜下可观察到虹膜前表面是主要由纤维组织组成的纤维血管膜残迹，仅 有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。而光镜下 的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜。

治疗组虹膜的超微结构为一系列的退行性改变。虹膜基质中部的大血管的内皮细胞有正 常的细胞核、细胞质和细胞连接。虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有细胞碎 片和巨噬细胞浸润。无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。

通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明了多肽I、多肽II能够抑制新生血管形成并 使已形成的血管退化。

实施例12

血管抑制多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用

用846复合麻醉剂0.5mL/Kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前5min 用复方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大双眼瞳孔。固定动物，在-53.00D角膜接触镜辅助下， 围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝，共计8个光凝斑，激光波长为647.1 nm，功率为350mW，光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻进行眼底照相。 于光凝后3、7、14、21、28分别进行FFA、组织病理及透射电镜检查。

通过眼底照相及FFA检查证实，光凝后第21天光凝斑荧光素渗漏达到高峰。同时进行 病理组织学检查，光凝后21天，光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖，其中可见大量 新生血管，管腔内可见红细胞；镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变，内 皮细胞凝聚。表明21天后大鼠脉络膜新生血管模型形成。

将造模成功的20只大鼠，随机分成4组，每组5只大鼠。分别标记为空白对照组、多肽 I治疗组、多肽II治疗组，分别以生理盐水、多肽I(75μg)、多肽II(75μg)玻璃体腔注 射，每日1次，持续1周。给药后3天、7天、14天及28天均进行FFA检查。

表18.各实验组给药后不同时间CNV发生率

结果：见表18和图22，各实验组给药后不同时间CNV发生率(发生渗漏的光斑数/总光 斑数)。FFA检测，给药后3天，多肽I、多肽II两组治疗组荧光素渗漏与用药前相比无明显 变化；给药后7、14天，治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；给药后28天，荧光素渗漏相 比用药后14天更少。说明两种血管抑制多肽能够治疗大鼠脉络膜新生血管，有可能开发成为 治疗脉络膜新生血管性眼病的药物。

实施例13

血管抑制多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响

OIR模型的建立：在C57/B16小鼠出生后第7天至第12天将小鼠幼畜及其母鼠暴露置于 75％高氧环境中，可致其中央视网膜中毛细管迅速消失。在第12天返回到室内空气中，暴露 与高氧中的视网膜血管迅速消失，引起广泛的异常新生血管形成，视网膜的中央部分长期在 很大程度上保持无血管状态。在血管消失完全之后，于第13天向玻璃体内注射多肽(给药组， 多肽I、多肽II、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ剂量均为50μg)或生理盐水(阴性组)，在 第17天对视网膜血管进行评价(为标记未闭合的血管，将50mL德克萨斯红标记的番茄凝集 素注射入左心室并循环5min)。

表19.血管抑制多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的作用

血管抑制多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响结果见表19：对OIR小鼠施用多肽I 和多肽II后，能够改善病理性新生血管形成。与阴性对照相比，用多肽I、多肽II处理的OIR 小鼠视网膜中新生血管丛明显减少，所占的面积分别减少58.60％，61.86％。