包含在自然洞穴条件下发酵的白桦茸发酵提取物的化妆品组合物

摘要

本发明涉及包含在自然洞穴条件下发酵的白桦茸发酵提取物的化妆品组合物，具体涉及包含白桦茸发酵提取物的化妆品组合物及白桦茸发酵提取物的制造方法。本发明的白桦茸发酵提取物制造方法是对桑黄菌丝体固体培养物培养白桦茸而获得的，因而能够提高桑黄和白桦茸提取物的生理活性促进功效，使白桦茸的多种生理活性物质发生生物转化(Biotransformation)，从而能够获得生理活性功效得到增加的多种生理活性物质。另外，本发明的白桦茸发酵提取物的美白、皱纹改善、抗氧化、抗炎效果优异，可以有用地应用于相关化妆品领域的研究及产业。

说明书

技术领域

本发明涉及包含白桦茸发酵提取物的化妆品组合物及白桦茸发酵 提取物的制造方法，特别涉及一种包含在自然石灰洞穴中发酵的发酵提 取物的化妆品组合物及白桦茸发酵提取物的制造方法。

背景技术

白桦茸(Chaga)作为寄生于桦木的药用菇，学名为桦褐孔菌 (Inonotus Obliquus)。作为西伯利亚和北美、北欧等北纬45度以上地 区的寄生于桦木的蘑菇，对癌症等成人病治疗的功效卓越，借助于病毒 而寄生，吸收树汁而生长，大约成长15～20年时间。在俄罗斯，自16 世纪左右开始作为治疗不治之症的妙药而流传至今，1951年，苏联科学 院科马罗夫科学研究所正式开始研究，目前被俄罗斯认定为正式癌症治 疗药材。

因此，正在对白桦茸进行着各种研究，作为一个示例，在大韩民国 公开专利第2013-0133477号中公开了一种包含白桦茸及桑黄提取物的 前列腺肥大症改善、粉刺改善、毛发促进用途组合物。但是，在所述现 有文献中，未对有关抗炎、抗氧化、美白、皱纹改善等的化妆品组合物 进行记载，迄今为止，利用白桦茸的抗炎、抗氧化、美白、皱纹改善效 果尚不为人知。

另一方面，作为属于担子菌类的白腐菌的桑黄在液体发酵过程时， 无人工搅拌及曝气(aeration)而接种的桑黄菌丝体无法与发酵对象物 顺利接触，在发酵过程中，发酵液的成长因其它细菌的生长而异。另外， 在不供应追加性营养成份的情况下，就借助于桑黄的发酵过程而言，如 果其期间变长，则接种的接种源的生长延缓，存在被其它细菌污染的可 能性大为增加的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：大韩民国公开专利第2013-0133477号

发明内容

为了解决如上所述的以往技术的问题，本申请发明的目的在于提供 一种在桑黄菌丝体固体培养物中接种白桦茸并培养而获得的白桦茸发 酵提取物的制造方法及包含所述白桦茸发酵提取物作为有效成份的化 妆品组合物。

为达成所述目的，本发明提供一种包含白桦茸发酵提取物作为有效 成份的化妆品组合物。

就本发明的一个实施方式而言，可以是抗炎、抗氧化、美白或皱纹 改善用化妆品组合物。

就另一实施方式而言，所述白桦茸发酵提取物可以是对桑黄菌丝体 固体培养物接种白桦茸或其粉末并培养而获得的。

就又一实施方式而言，所述桑黄菌丝体固体培养物可以是对选自扁 柏、松树、红松、桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、 栎树、桑树、麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及 胡颓子中的1种以上接种桑黄或其均质化物并进行培养而得的。

就又一实施方式而言，所述桑黄菌丝体固体培养物可以是对选自扁 柏、松树、红松、桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、 栎树、桑树、麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及 胡颓子中的1种以上接种桑黄或其均质化物并培养30至360天而得的。

就又一实施方式而言，所述白桦茸发酵提取物可以是对桑黄菌丝体 固体培养物中接种白桦茸或其粉末并在5至30℃培养而得的。

就又一实施方式而言，所述白桦茸发酵提取物可以是对桑黄菌丝体 固体培养物中接种白桦茸或其粉末并在pH 4.5至7.5下培养而得的。

就又一实施方式而言，所述白桦茸发酵提取物可以在化妆品组合物 中包含0.001至10重量％。

就又一实施方式而言，所述白桦茸发酵提取物可以是对桑黄菌丝体 固体培养物接种白桦茸或其粉末、以及选自灵芝、冬虫夏草、落叶松茸、 绣球菌及其粉末中的1种以上并培养而得的。

就又一实施方式而言，所述化妆品组合物可以为柔软化妆水、营养 化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、清洁霜、洁面泡沫、卸妆水、 面膜、喷雾或粉的剂型。

另外，本发明提供一种白桦茸发酵提取物的制造方法。

一个实施方式可以是包括以下步骤的制造方法：对选自扁柏、松树、 红松、桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、栎树、桑 树、麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及胡颓子中 的1种以上接种桑黄或其均质化物并培养，制造桑黄菌丝体固体培养物 的步骤；以及在所述桑黄菌丝体固体培养物中接种白桦茸或其粉末并培 养而获得的步骤。

就另一实施方式而言，所述桑黄菌丝体固体培养物可以是对选自扁 柏、松树、红松、桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、 栎树、桑树、麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及 胡颓子中的1种以上接种桑黄或其均质化物并培养30至360天而得的。

就又一实施方式而言，所述获得的步骤可以是对菌丝体固体培养物 接种白桦茸或其粉末并在5至30℃下培养。

就又一实施方式而言，所述获得的步骤可以是对菌丝体固体培养物 接种白桦茸或其粉末并在pH 4.5至7.5下培养。

另外，本发明提供一种化妆方法，其特征在于，包括将所述化妆品 组合物涂布于皮肤的步骤，具有选自抗炎、抗氧化、美白及皱纹改善中 的1种以上的效果。

本发明的白桦茸发酵提取物制造方法是在桑黄菌丝体固体培养物 中培养白桦茸并获得，因而能够提高桑黄与白桦茸提取物的生理活性促 进功效，使白桦茸的多种生理活性物质发生生物转化 (Biotransformation)，从而能够获得生理活性功效得到增加的多种生 理活性物质。另外，本发明的白桦茸发酵提取物的美白、皱纹改善、抗 氧化、抗炎效果优异，可以有用地应用于相关化妆品领域的研究及产业。

附图说明

图1表示了实施例1.2的利用桑树圆形木片制造的桑黄菌丝体固体 培养物的照片。

图2表示了根据实施例1.3，在不同培养时间(Incubation time (week))的桑黄菌丝体桑树固体培养物中提取并测定的游离葡萄糖的 浓度(累积释放葡萄糖(Cumulative glucose released)(mg/L))。

具体实施方式

本发明人确认了对桑黄菌丝体固体培养物接种白桦茸并培养而获 得的提取物的抗氧化、美白、抗炎或皱纹改善效果非常优异，因而完成 了本发明。

下面详细说明本发明。

本发明提供一种包含白桦茸发酵提取物作为有效成份的化妆品组 合物。

所述白桦茸发酵提取物可以是对桑黄菌丝体固体培养物接种白桦 茸或其粉末并培养而获得，根据发明目的，可以在桑黄菌丝体固体培养 物中添加或接种白桦茸之外的物质并培养而获得。例如，所述白桦茸发 酵提取物可以对桑黄菌丝体固体培养物接种白桦茸或其粉末和药用菌 类或其粉末而培养。所述药用菌类可以是灵芝(Ganoderma lucidum)、 冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、落叶松茸(Agaricus)、绣球菇等。

在本发明中，包括白桦茸、桑黄的菌类可以为野生或栽培的菌类， 可以以干燥或未干燥的状态使用。

就所述培养并获得而言，为了显示出皮肤的有效功效，所述培养可 以在适当温度下进行。例如，所述培养可以在5至30℃，优选可以在5 至15℃进行。

就所述培养并获得而言，为了显示出皮肤的有效功效，所述培养可 以在适当的pH条件下进行。例如，所述培养可以在pH 4.5至7.5下， 优选可以在pH 5.5至6.5下进行。

就所述培养并获得而言，为了显示出皮肤的有效功效，培养时间可 以适当调节。例如，所述培养可以进行30至360天。

另外，必要情况下，在所述获得后，可以进一步使用本领域公知的 过滤和/或浓缩和/或冻干方法。

所述桑黄菌丝体固体培养物可以对诸如扁柏、松树、红松、桧柏、 日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树等针叶树或诸如栎树、 桑树、麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树、胡颓子 等阔叶树接种桑黄(phellinus linteus)或其均质化物并培养。所述针叶 树或阔叶树可以以木片使用，所述木片可以按照适当大小截断使用。例 如，所述桑黄菌丝体固体培养物可以对桑树圆形木片接种桑黄并培养。 另外，所述木片为了更好地培养而可以进行灭菌。就接种所述桑黄或其 均质化物并培养而言，为了增加作为营养源的游离葡萄糖的浓度，培养 时间可以适当调节。例如，所述培养可以进行30至360天，优选可以 进行60至90天。

优选所述白桦茸发酵提取物的含量相对于组合物总重量包含0.001 至90重量％。当所述发酵提取物的含量不足0.001重量％时，会不出现 皮肤改善效果，例如，不出现抗炎、抗氧化、皱纹改善或美白效果，当 超过90重量％时，效果随含量增加而增大的程度微小，在剂型上的安 全及稳定性方面存在问题，会发生不够经济的问题。

所述化妆品组合物可以进一步包含化妆品组合物中通常可以包含 的成份，例如，可以包含选自抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜 料、香料及载体中的一种以上，但并非限定于此。

所述化妆品组合物可以制成溶液、混悬液、乳浊液、膏、胶、霜、 洗液、粉、皂、含表面活性剂洁面霜、不含表面活性剂洁面霜、油、粉 底、粉底液、粉底蜡或喷雾等剂型，但并非限定于此。更详细而言，所 述化妆品组合物优选为柔软化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精 华素、眼霜、清洁霜、洁面泡沫、卸妆水、面膜、喷雾或粉等剂型，但 并非限定于此。

当所述化妆品组合物的剂型为膏、霜或胶时，作为载体成份，可以 包括动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、 聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等。

当所述化妆品组合物的剂型为粉或喷雾时，作为载体成份，可以包 括乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，当为喷雾 时，还可以进一步包括诸如氯氟化碳、丙烷、丁烷或二甲醚的推进体。

当所述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成份，可 以包括溶剂、溶解化剂或乳浊化剂，更具体而言，可以包括水、乙醇、 异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁 二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。

当所述化妆品组合物的剂型为混悬液时，作为载体成份，可以包括 水、乙醇或丙二醇的液态之类的稀释剂，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯 山梨醇酯及聚氧乙烯山梨醇酯之类的混悬剂，微结晶性纤维素、偏氢氧 化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。

当所述化妆品组合物的剂型为含表面活性剂洁面霜，作为载体成 份，可以包括脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙 基磺酸盐、咪唑衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫 酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸双乙醇酰胺、 植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

当所述化妆品组合物的剂型为皂、含表面活性剂洁面霜或不含表面 活性剂洁面霜时，涂布于皮肤后可以擦去或揭开或用水洗掉。作为具体 示例，所述皂为皂液、皂粉、固体皂或油皂，所述含表面活性剂洁面霜 剂型为洁面泡沫、卸妆水、洁面巾或洁面面膜，所述不含表面活性剂洁 面霜剂型为洁面霜、清洁洗液、卸妆水或清洁胶，但并非限定于此。

本发明提供一种白桦茸发酵提取物制造方法。

所述白桦茸发酵提取物制造方法可以包括：对选自扁柏、松树、红 松、桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、栎树、桑树、 麻栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及胡颓子中的1 种以上接种桑黄或其均质化物并培养，制造桑黄菌丝体固体培养物的步 骤；及对所述桑黄菌丝体固体培养物接种白桦茸或其粉末并培养而获得 的步骤。

所述制造菌丝体固体培养物的步骤可以对选自扁柏、松树、红松、 桧柏、日本柳杉、冷杉、云杉、臭冷杉、桧柏、榧树、栎树、桑树、麻 栎树、梧桐树、榆树、刺槐、椴树、五角枫、白蜡树及胡颓子中的1种 以上接种桑黄或其均质化物并培养30至360天，优选培养60至90天。 另外，可以添加或接种桑黄或其均质化物之外的物质，这与前面说明的 内容相同。

所述获得的步骤可以对桑黄菌丝体固体培养物接种白桦茸或其粉 末并在5至30℃培养，优选在5至15℃下培养。另外，所述获得的步 骤可以对桑黄菌丝体固体培养物接种白桦茸或其粉末并在pH 4.5至7.5 下培养，优选在pH 5.5至6.5下培养。所述对桑黄菌丝体固体培养物接 种白桦茸或其粉末并培养的时间可以优选进行30天至360天。

本发明提供一种化妆方法，其特征在于，包括将所述化妆品组合物 涂布于皮肤的步骤，具有选自抗炎、抗氧化、美白及皱纹改善中的1种 以上的效果。

本发明的化妆方法涵盖将本发明的化妆品组合物涂布于人的皮肤 的所有化妆方法。即，将化妆品组合物涂布于皮肤的本领域公知的所有 方法均属于本发明的化妆方法。

本发明的化妆品组合物可以单独或重复涂布使用，或与本发明之外 的其它化妆品组合物重复涂布使用。另外，本发明的皮肤角质剥离效果 优异的化妆品组合物，可以按照通常的使用方法使用，可以根据使用者 的皮肤状态或取向而改变其使用数次。

下面利用实施例，更详细地说明本发明。但是，下述实施例用于对 本发明进行举例，本发明并非限定于下述实施例，可以多样地修改及变 更。

实施例1.利用桑黄菌丝体制造白桦茸发酵提取物

1.1准备桑黄菌丝体接种源

将受让于江原大学生物学系环境微生物学研究室的担子菌类、作为 白腐菌的桑黄(Phellinus linteus)菌丝体在5℃、PDA(Potato Dextrose  Agar，马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基中进行继代培养(Subculture)， 用于确保菌丝体的液体培养在25℃、150rpm、YMG(酵母提取物：4 g/l,麦芽提取物：10g/l,葡萄糖：4g/l)培养基中进行振荡培养。

将在PDA平板培养基中培养20天的桑黄菌丝体琼脂块(直径：1 cm)10～20个放入盛有100ml灭菌3次蒸馏水的250ml三角烧瓶中， 用均质器(X120,CAT,德国)使得均质化30～60秒。将均质化的桑黄 菌丝体在6,140g离心分离30分钟后，去除上清液后，在离心分离的菌 丝体中添加灭菌3次蒸馏水300ml，在往复式摇床(recipro shaker)(垂 直往复提取(vertically reciprocating extractor))中使其再混悬20分钟， 反复该过程，直到在离心分离的上清液中检测不到葡萄糖(glucose)、 磷、氮时为止。测定去除了残留YMG培养基成份的桑黄菌丝体的湿润 重量(wet weight,以下标识为“w wt”)，混合灭菌的3次蒸馏水，制 造了均质化的40％(w wt/v)桑黄菌丝体接种源。

1.2制造桑黄菌丝体固体培养物

将在山上采集的桑树用滚动锯(scroll saw)截断，裁断成圆形木片 (直径：8～12cm,厚度：1～1.5cm)形态使用。将裁断的桑树圆形木片 进行121℃湿式灭菌后，在80℃烘箱中干燥48小时而去除水份后，用 作桑黄菌丝体的基质。

在灭菌的3L烧杯中，混合所述实施例1.1中准备的均质化的40％ (w wt/v)桑黄菌丝体接种源1L与灭菌3次蒸馏水1L，稀释成20％(w wt/v)桑黄菌丝体接种源后，将所述灭菌干燥的桑树圆形木片浸渍10 分钟。取出浸渍的桑树圆形木片，投入灭菌的20L广口玻璃水槽(D： 30cm,H：50cm)，在25℃下静置培养8周，在桑黄菌丝体固体培养物 的制造中使用的玻璃水槽中，添加预先灭菌的蒸馏水1L，在培养期间 保持玻璃水槽内湿度，将其结果显示于图1中。

图1表示了利用桑树圆形木片制造的桑黄菌丝体固体培养物的照 片。

如图1所示，桑黄菌丝体在圆形木片表面生长，可以获得作为接种 源的桑黄菌丝体固体培养物。

1.3测定桑黄菌丝体固体培养物的游离葡萄糖浓度

回收根据所述实施例1.2生长了桑黄菌丝体的桑树圆形木片，用镊 子去除菌丝体后，在10g桑树圆形木片中放入50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，在4℃下静置24小时，提取了经生物分解的木片中包含的游离葡 萄糖。提取的游离葡萄糖通过棉袋过滤器(cotton filter)，第1次去除 残留桑黄菌丝体，在6,140g条件下离心分离40分钟后，只回收上清液。 利用0.45μm HPLC用过滤器过滤回收的上清液，利用HPLC[柱A： RS tech,NH₂柱(250mm×46mm),柱号：091264AE,柱温：40℃,流 动相：75:25(乙腈:水),流速：1.2ml/min,检测器：RI]测定游离葡 萄糖，将其结果显示于图2中。

图2显示了从不同培养时间(Incubation time(week))的桑黄菌丝 体桑树固体培养物中提取并测定的游离葡萄糖的浓度(Cumulative  glucose released(mg/L))。“●”意味着从接种桑黄菌丝体并培养8周 的桑树圆形木片中提取的游离葡萄糖浓度，“○”意味着从未接种桑黄 菌丝体的桑树圆形木片中提取的游离葡萄糖浓度。

如图2所示，桑黄菌丝体桑树固体培养物的游离葡萄糖的浓度在第 8周为305mg/L，显示出比菌丝体未接种对照组的17mg/L高约18倍 的游离葡萄糖浓度。因此，对桑树圆形木片接种的桑黄菌丝体对桑树进 行生物分解并发酵过程中，可以获得持续的碳源供应。

另外，将测定游离葡萄糖浓度时用镊子去除的菌丝体集中在一起， 添加超纯水蒸馏水后，以均质器在13000rpm条件下均质化1分钟，以 15000rpm条件进行离心分离后，去除上清液后测定w wt，其结果显示 平均约为83g。因此，就普通发酵液的接种源而言，对桑黄菌丝体进行 液态培养，将回收的菌丝体利用均质器进行均质化后，经过离心分离、 清洗过程，确保83g(w wt)的菌丝体并使用。

1.4制造白桦茸发酵提取物

对干燥的白桦茸(来源：大光药业社)进行细切后再次粉碎，获得 粉末状。在获得的白桦茸粉末中加入按所述实施例1.2准备的桑黄固体 培养物，在pH 5.5～6.5、温度5～15℃的条件的洞穴(江原道旌善画岩洞 穴)中培养180天，准备了白桦茸发酵培养物。 为了提取所述白桦茸发酵培养物内的有效成份，利用0.2μm大小的过滤 器去除高分子沉淀物及菌丝体，获得白桦茸发酵提取物。

比较例1.制造利用了酵母的白桦茸发酵提取物

对干燥的白桦茸进行细切后再次粉碎，获得粉末状。将获得的白桦 茸粉末添加于1.2L的基本培养基(YM Broth)，使得达到30重量％， 将pH调节为5.5～6.5，在常温下静置2小时，使得充分含水。

将受让于韩国生命工学研究院生物资源中心的酵母(酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisia))在35℃下液体培养24小时，准备了白桦 茸发酵培养物。

在含有所述白桦茸粉末的培养基中稀释所述酵母，按10⁶CFU/ml 进行接种，在pH 5.5～6.5、5～15℃的条件的洞穴中培养180天，准备利 用了酵母的白桦茸发酵培养物。为了提取所述发酵培养物内的有效成 份，利用0.2μm大小的过滤器，去除高分子沉淀物及菌体，获得利用了 酵母的白桦茸发酵提取物。

实验例1.细胞毒性评价–MTT分析

将韩国细菌株银行提供的HaCaT细胞在96-孔板中按1×10⁵cells/ml 浓度接种，在37℃下，在5％CO₂培养箱中培养24小时。培养后，将 培养基全部去除，在不含有血清的培养基中，阳性对照组是不进行处理 并培养24小时，实施例1的白桦茸发酵提取物与比较例1的利用了酵 母的白桦茸发酵提取物是在不含血清的培养基中分别稀释为25、50、 100、200ug/ml，每孔(well)各处理100ul后，培养24小时。培养24 小时后，各放入利用PBS溶解为5mg/ml浓度的MTT试剂20μl，培养 4小时。将包含MTT试剂与提取物的培养基全部去除，在各孔中添加 100μl异丙醇酸(0.04N HCl在异丙醇中)，在振荡器中搅拌10～15分钟， 利用酶标仪(ELISA Reader)，在570nm下测定了吸光度，利用吸光度 求出细胞生存能力(％)(数学式1)，将其显示于下表1中。

[数学式1]

细胞生存能力(％)＝(实验组吸光度)/(阳性对照组吸光度) ×100

实验组吸光度：处理实施例1或比较例1中制造的提取物时测定的 吸光度

阳性对照组吸光度：无处理组的吸光度

[表1]

如表1所示，实施例1中制造的白桦茸发酵提取物与比较例1中制 造的利用了酵母的白桦茸发酵提取物全部以高浓度200ug/ml在作为角 质形成细胞的HaCaT中进行处理时，所述细胞的生存能力显示为80％ 以上，确认无细胞毒性。

实验例2.确认抗炎功效-NO(一氧化氮)检测

一氧化氮(nitric oxide,NO)作为具有高反应性的生物生成分子， 利用NOS(NO synthase，一氧化氮合成酶)而从L-精氨酸生成，所述 一氧化氮与神经传递、血管的松驰及细胞介质性免疫反应相关，如果生 物体陷入过敏性皮肤炎之类的炎症状态，则iNOS(诱导型一氧化氮合 成酶(inducible NOS))表达，生产大量的一氧化氮。如此生成的一氧 化氮之类的炎症促进介质，被认为使过敏性皮肤炎进一步恶化，为了确 认抗炎功效而实施一氧化氮检测(No assay)。

具体而言，作为RNS(Reactive nitric species)的一氧化氮的过度 生成诱导炎症反应，为了对其进行功效测定，以LPS (lipopolysaccharide)刺激细胞，诱导一氧化氮的生成后，利用以格里 斯试剂(Griessreagent)测定因试料导致的一氧化氮生成降低效果的原 理，测定了实施例1中制造的白桦茸发酵提取物、比较例1中制造的利 用了酵母的白桦茸发酵提取物的抗炎效果。将韩国细菌株银行提供的 Raw 264.7细胞(小鼠巨噬细胞(Mouse macrophage))按1×10⁵cells/ml 的浓度接种于24-孔板，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。利 用包含100ng/ml LPS而不含血清的培养基，稀释使得实施例1及比较 例1的组合物的最终浓度达到25、50、100、200ug/ml，各用500μl对 细胞进行处理后，培养24小时。培养后，回收培养基，在4℃、12000rpm 条件下离心分离10分钟后，只回收上层液，取上层液50ul放入96-孔 板，与等量的格里斯试剂(Griessreagent)反应10分钟后，利用酶标 仪(ELISA reader)，在540nm下测定吸光度，利用吸光度求出一氧化 氮生成抑制能力(％)，将其结果显示于下述表2中。

[数学式2]

一氧化氮生成抑制能力(％)＝(试料的吸光度/LPS处理吸光度) ×100

[表2]

如表2所示，确认了将无处理时的一氧化氮生成量视为100％时， 实施例1中制造的白桦茸发酵提取物具有比比较例1中制造的利用了酵 母的白桦茸发酵提取物更优异的抗炎功效。

实验例3.确认抗氧化功效-DPPH基清除分析

普通自由基的反应性强而不稳定，而DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基) 自由基作为比较稳定的自由基，当以自由基状态存在时能够在517nm 下通过吸光而测定，应用DPPH，测定了实施例1中制造的白桦茸发酵 提取物与比较例1中制造的利用了酵母的白桦茸发酵提取物的自由基清 除功效(Blois,M.S.nature 181,1190,1958)。

将实施例1中制造的白桦茸发酵提取物、比较例1中制造的利用了 酵母的白桦茸发酵提取物分别稀释为25、50、100、200ug/ml的试料及 0.005％(w/v)BHT(butylatedhydroxytoluene，二丁基羟基甲苯)， 在24孔板的各孔中分别加入500μl后，在溶解了0.1mM DPPH的甲醇 溶液中各添加100μl，在常温下放置30分钟后，利用酶标仪(ELISA  reader)(VICTOR3,珀金埃尔默公司)在565nm下测定吸光，利用 吸光度求出自由基清除功效(％)(数学式3)，将其结果显示于下述表 3中。作为对照组，使用了所述甲醇溶液。

[数学式3]

自由基清除功效(％)＝(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100

实验组吸光度：处理实施例1中制造的发酵提取物、比较例1中制 造的利用了酵母的发酵提取物或BHP时的吸光度

对照组吸光度：在溶解了0.1mM DPPH的甲醇溶液中的吸光度

[表3]

如表3所示，确认了实施例1中制造的白桦茸发酵提取物的自由基 清除功效显著优异于比较例1中制造的利用了酵母的白桦茸发酵提取 物。

实验例4.确认美白功效-酪氨酸酶抑制分析

为了测定实施例1中制造的白桦茸发酵提取物与比较例1中制造的 利用了酵母的白桦茸发酵提取物的酪氨酸酶活性抑制效果，从西格玛 (Sigma.)公司购入蘑菇来源的酪氨酸酶进行了实验。

在96孔板中放入使用酪氨酸作为基质的1.5mM酪氨酸溶液各 100μl，将实施例1中制造的白桦茸发酵提取物与比较例1中制造的利 用了酵母的白桦茸发酵提取物以25、50、10、200μg/ml各处理20μl后， 接种100U/ml酪氨酸酶各80μl。接种后进行混合，在37℃下反应15分 钟，反应时的缓冲溶液使用0.1M的磷酸盐缓冲溶液。与上述相同地以 曲酸(Kojic acid)1、5μg/ml处理各20μl后，接种100U/ml酪氨酸酶 各80μl后进行混合，在相同条件下反应，反应结束的孔板在490nm下 测定吸光度，利用测定的吸光度，求出酪氨酸酶活性抑制功效(％)， 将其结果显示于下述表4中。

[数学式4]

酪氨酸酶活性抑制能力(％)＝100-(试料的吸光度-对照组的吸光 度)×100

[表4]

如表4所示，实施例1中制造的白桦茸发酵提取物的酪氨酸酶活性 抑制功效比比较例1中制造的利用了酵母的白桦茸发酵提取物增大。在 抑制酪氨酸酶时，在抑制黑色素细胞生成方面，确认了实施例1中制造 的白桦茸发酵提取物在酶水平上具有美白功效。

实验例5.确认皱纹改善功效-PIP-1检测

为了测定从成纤维细胞排出到培养基的胶原蛋白合成量，使用了 procollagen type 1C-peptide ELISA kit(TaKaRa,日本)。在试剂盒中 附带的96孔板中，每孔放入100ul antibody-POD conjugate solution后， 使实施例1中制造的白桦茸发酵提取物与比较例1中制造的利用了酵母 的白桦茸发酵提取物分别达到25、50、100、200μg/mL浓度并各放入 20ul，或将分别稀释为0、10、20、40、80、160、320、640ng/ml的 PIP-1标准溶液(standard solution)各放入20ul。之后充分混合后进 行密封(sealing)，在37℃下培养3小时后吸出(suction)，以400ul 的洗涤液(washing buffer)清洗4次。全部去除所述洗涤液(washing  buffer)后，将试剂盒中包含的TBMZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺 (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))底物液(substrate solution)各 放入100ul，在常温下培养15分钟，然后再进一步放入停止液(stop  solution)(1N H₂SO₄)各100ul并混合，在结束后1小时内，在450nm 下测定吸光度。利用测定的吸光度，求出胶原蛋白生物合成能力(％)， 将其结果显示于下述表5中。

[数学式5]

胶原蛋白生物合成能力(％)＝100×(试料的吸光度/对照组的 吸光度)

[表5]

如表5所示，确认了实施例1中制造的白桦茸发酵提取物比比较例1 中制造的利用了酵母的白桦茸发酵提取物的胶原蛋白的生物合成能力增 加，有皱纹改善功效。