一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法。本发明通过构建携带人NTCP基因的微环载体，采取水动力转染的转基因方式将其导入小鼠体内，使人NTCP基因在小鼠肝脏表达。这一模型将克服现有实验小鼠不能自然感染HBV的缺陷，建成一种具有乙肝病毒功能性受体，能够支持HBV体内感染且具有正常免疫功能的小鼠模型。从而可以真实、全面地反映临床乙肝发生、发展及慢性化过程，为进一步研究HBV的致病机制，HBV感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。

说明书

技术领域

本发明属于动物模型制备技术领域，具体涉及一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球范围内影响人类健康的重大问题。由HBV感染导致的慢性进行性肝脏炎症病变，常常发展为肝硬化、肝癌并最终导致死亡。据世界卫生组织报道，全球约20亿人已感染过HBV，目前约有3.5亿人为HBV慢性感染者，这些人进展为肝硬化、肝衰竭或肝癌的风险非常高。全球范围内30%的肝硬化和超过50%的肝癌是由于HBV感染造成的，每年因HBV感染造成的死亡人数约为100万-200万。HBV感染引起的肝脏疾病仍然是一个亟待解决的重大公共卫生问题。一直以来，我国都是HBV 感染的高发区，乙肝发病率整体呈上升趋势, 且以慢性HBV感染为主。资料表明：我国现有的慢性HBV感染者约为9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，占慢性HBV感染者的1/5强。广东一直是病毒性肝炎的高发地区，传染病疫情监测信息显示：广东省乙肝表面抗原携带率为11. 10%，属于乙肝高流行区，尤其以成年人慢性乙型肝炎感染为主。由此可见，我国乙型肝炎尤其是慢性乙型肝炎的防治任务仍然十分艰巨。

慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于携带有大量的HBV，是HBV的最主要传染源。我国每年都投入大量的经费和人力物质资源用于该类人群的治疗和阻止HBV在人群中的进一步传播。然而，目前仍缺乏有效的治疗慢性HBV感染的手段。一个重要的原因是HBV 慢性感染的机制至今未能明确。而长期以来缺乏合适的动物模型，严重阻碍了HBV的研究进展。

人类HBV属于嗜肝DNA病毒科, 有较强的种属特异性，因此建立起能广泛应用的动物模型并非易事。HBV自然条件下只感染人、非人灵长类(如黑猩猩等)及树鼩。黑猩猩模型因其体积较大、成本高以及受伦理道德约束等限制了其应用；而树鼩模型则由于其感染效率低, 仅能导致短暂的轻度感染，病毒滴度很低，而难以推广应用。研究者也曾建立了HBV相关的其它嗜肝DNA病毒的小动物模型来进行相关研究，如鸭乙型肝炎模型，土拨鼠肝炎模型，地松鼠肝炎模型等，但这些模型在药代动力学和免疫学遗传背景上与人类有很大的不同，因此都无法成为人HBV相关研究的理想模型。

近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研究人员亦建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型，基因转染HBV小鼠模型及HBV转基因小鼠模型等。但是，由于HBV感染人体后在体内不断地复制，循环感染肝脏细胞，并由此引起机体的一系列免疫反应，或逃避免疫系统的监测和清除，从而在体内长期存在而导致乙型肝炎的慢性化，因此要想对HBV致病机制有一个清晰明确的认识，进而寻找出有效的治疗手段，研究人员迫切需要一种有着完整免疫系统，且能够模拟人 HBV 在人体肝脏的感染过程的动物模型。由于小鼠天然不被HBV感染，而目前所建立的乙肝小鼠模型均未能克服小鼠肝细胞感染HBV这一难题，因而也无法满足HBV研究对动物模型的要求。如，人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型能实现HBV的感染复制过程, 但这一模型是基于免疫缺陷的小鼠，因此不能够用于研究小鼠的免疫反应，而且制作难度大、成本高、成功率低，难以广泛推广运用。基因转染HBV小鼠模型，制备过程中，HBV进入小鼠体内会引起宿主的免疫反应, 产生针对HBV的细胞免疫和体液免疫，然而由于载体以及HBV自身的抗原性, 以及HBV不能感染小鼠肝细胞，导致HBV只能短暂分泌，不适用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的研究。目前已有的HBV转基因小鼠虽然可以稳定的分泌HBV病毒及抗原, 无需每次进行转染或移植，但由于模型并非通过被HBV感染的途径建立，因此无法用来进行HBV进入被感染机体和HBV在机体内的散布研究;另一方面，目前已有的HBV 转基因小鼠对HBV病毒抗原处于免疫耐受状态，机体不能产生对HBV的免疫反应,也不产生乙型肝炎病变。而且，转基因小鼠的获得需要昂贵的显微注射设备和复杂的操作, 非常耗时费力。以上原因导致了可用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的动物模型的缺失，客观上限制了对慢性乙型肝炎发病机制、免疫病理、治疗药物以及免疫治疗的相关研究。

如何建立一种廉价、操作方便、有着完整免疫系统，能够模拟 HBV 在人体肝脏的感染过程的小动物模型以满足HBV研究所需成为亟待解决的关键问题。

HBV 进入肝细胞的门户是病毒的受体。研究表明，HBV具有严格的宿主易感性和嗜肝细胞性。感染早期存在于HBV外膜的抗原特定肽段与肝细胞上特异受体识别并结合,介导病毒进入细胞,启动HBV的复制周期。学者们相继报道了可能起作用的乙型肝炎病毒受体，如多聚人血清白蛋白，内连接素II，载脂蛋白H，IL-6，甘油醛三磷酸脱氢酶，中性金属蛋白酶，人肝细胞附加素等，但直到2012年底仍未确定HBV感染中起决定作用的受体。

最近，我国科学家最新的研究成果证实了钠离子牛磺胆酸共转运多肽（Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide，NTCP）是乙型肝炎病毒的关键功能性受体。NTCP广泛表达于肝细胞基侧膜，是肝细胞中最主要的钠离子依赖性牛磺胆酸吸收系统，也是肝脏中最重要的胆汁酸吸收系统，在肠肝循环中发挥重要的作用。HBV的Pre-S1区域特异识别NTCP，与它结合而感染肝细胞。研究表明，通过抑制肝细胞内源产生的NTCP，使NTCP的表达降低，降低了肝细胞中的NTCP的含量，结果极大地减少了HBV对人和树鼩肝细胞的感染。如果使能感染HBV的HepaRG细胞中NTCP减少，就能降低这些细胞感染HBV。平常不能感染乙肝病毒的Huh7和HepG2体外培养细胞系，导入NTCP基因后产生相应的蛋白质，这些细胞就能被HBV所感染。研究同时表明：尽管NTCP在小鼠、大鼠、树鼩、黑猩猩、人等多个物种中均有表达，且有较高的同源性，但是特定结合域的少数几个氨基酸的不同就能导致不同物种NTCP对HBV识别及结合能力的巨大差异，这也是HBV宿主范围狭窄的原因之一。食蟹猴的NTCP通常不能结合乙肝病毒，但实验表明，只要突变其NTCP上一段极小的区域，使之被人NTCP的相应的氨基酸取代，就能变成有效的HBV受体，介导HBV对食蟹猴肝细胞的感染。为此，人NTCP被认为是迄今为止发现的最具潜质的乙型肝炎病毒受体，引起了学者们的极大兴趣和关注，并受到高度评价，这一研究成果同时也为建立理想的HBV感染模型带来了宝贵契机。

但是现有技术中至今仍未见报道将人NTCP转入小鼠体内构建表达人NTCP的小鼠模型的方法，原因可能由于：1.NTCP最近才被证实为乙肝功能性受体，因此尚未有相关模型小鼠建成的报道；2. 动物模型制备中，外源基因的导入形式和导入方法直接影响到外源基因在动物中的存在和表达。不同的动物模型制备过程中均要经过摸索。对于这一问题，现有技术还未有有效的解决方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏表达人NTCP的小鼠模型，尤其是缺乏持续、稳定表达人NTCP的小鼠模型的缺陷，提供一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种表达人NTCP的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

S1. 从质粒pcDNA6-hNTCP 中经PCR扩增得到人NTCP基因真核表达框；

S2. 将人NTCP基因真核表达框通过分子克隆技术插入质粒ZY781的attB和attP位点间，得到携带人NTCP基因真核表达框的微环亲本质粒ZY781-CMV-hNTCP；

S3. 将微环亲本质粒ZY781-CMV-hNTCP转入E.coli ZYCY10P3S2T感受态中，经卡那霉素抗性筛选阳性克隆，所得重组质粒经阿拉伯糖诱导重组酶ФC31作用后得到携带人NTCP真核表达框的微环DNA（pMC-CMV-hNTCP）；

S4. 将微环DNA（pMC-CMV-hNTCP）通过水动力转染方法，导入小鼠体内得基因转染小鼠，基因转染小鼠经PCR，组化检测及相关生物学指标的检测后即可作为模型用与相关研究。

    S3所述携带人NTCP真核表达框的微环DNA的获得条件为：将300μl微环诱导用母液接种入50ml含有50 μg /ml卡那霉素的TB培养液中，37℃、250 rpm/min培养12～18h后，向培养液中加入等体积的诱导液，32℃、250 rpm/min 培养5 h，收菌、提取微环DNA；所述诱导液含有50 ml 的LB培养液、2 ml 1N 的NaOH 溶液和300μl 20% L-阿拉伯糖。

    优选地，所述微环诱导用母液的制备方法为：亲本质粒ZY781-CMV-hNTCP转化E.coli ZYCY10P3S2T感受态，挑取单个阳性克隆接种到TB培养液中，37℃、250 rpm/min，培养15～18h至OD₆₀₀值约为4～5时，即可作为诱导用母液进行诱导产生微环DNA。

所述水动力转染方法步骤为：选取6～8周、体重26～28g的ICR小鼠，将15μg携带人NTCP真核表达框的微环DNA 溶于2.5ml生理盐水中，经小鼠尾静脉在5～8s内注射入小鼠体内。本发明同时还分别以pcDNA6和生理盐水做对照组和空白对照组试验。

本发明在前人的研究基础上设想如果将人NTCP转入小鼠体内并使其表达，那么人NTCP将可以结合人HBV，从而使小鼠肝细胞能够被HBV感染，同时这种小鼠还具有正常的免疫系统，因此这一小鼠模型将可以克服现有小鼠不能自然感染乙肝病毒的缺陷，实现最大程度的模拟临床乙肝发生、发展及转归过程，为研究乙肝病毒的感染过程，寻找新的药物靶点及探索乙肝的免疫疗法提供理想的模型。而如何将人NTCP成功转入小鼠体内，并使其在小鼠体内持续、稳定表达，是要解决的重点问题。本发明通过优化比较载体类型、基因导入方法得出一种可持续、稳定表达人NTCP的小鼠模型。所选用的载体为微环载体ZY781；微环载体ZY781是由中国科学院深圳先进技术研究院陈志英等重新改造的，微环载体ZY781除了具有一般微环载体所具有的特性之外，微环载体ZY781还可从细菌中一步获得，毋需进一步纯化，产量高达99%。所选取的基因导入方法为水动力转染技术，水动力转染技术是一种简单有效的活体基因转染技术，利用短时间内注入相当于小鼠体重约8%的注射液体量，导致溶液压力及容量超过小鼠收缩压及心输出量，使得质粒聚集于下腔静脉，并经下腔静脉直接进入与之相连的血管丰富、具有可扩张结构的肝脏与肝细胞接触，从而避免了质粒DNA经血循环而被核酸酶所降解，大大提高了转染效率，从而实现外源基因在小鼠体内的高效表达。而且，水动力转染方法具有很好的肝脏靶向性，用此方法导入体内的基因在肝脏中表达水平较其他器官中高100～1 000倍，对体内肝细胞的转染效率可高达40～90%，所以尤其适用于肝炎病毒实验动物模型及其相关的功能研究。

本发明的有益效果是：

    本发明通过构建携带人NTCP基因的微环载体，采取水动力转染的转基因方式将其导入小鼠体内，使人NTCP基因在肝脏表达。这一模型将克服实验小鼠不能自然感染HBV的缺陷，建成一种具有乙肝病毒功能性受体，能够支持HBV体内感染且具有正常免疫功能的小鼠模型。从而可以真实、全面地反映临床乙肝发生、发展及慢性化过程，为进一步研究HBV的致病机制，HBV感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。这一模型的建立将填补国内外缺乏此类动物模型的空白，使相关的研究手段更加丰富，也为抗乙肝药物的研发提供更加先进的评价体系和技术平台。

    理想的动物模型应该是可重复的，甚至是可以标准化的。本发明在制备表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型时，除了考虑要将人NTCP基因导入小鼠体内，更重要的是要考虑采取什么方式保持人NTCP基因在小鼠体内持续、稳定表达。因此，本发明通过优化比较载体类型、基因导入方法得出一种可持续、稳定表达人NTCP的小鼠模型。

说明书附图

图1. pcDNA6-hNTCP质粒图谱。

图2.ZY781空载体图谱。

图3. ZY781-CMV-hNTCP 微环亲本质粒图谱。

图4. pMC-hNTCP微环真核表达载体图谱。

图5.构建表达hNTCP的小鼠模型的流程图。

图6.hNTCP基因真核表达框PCR扩增电泳鉴定图。

图7.ZY781-CMV-hNTCP BglII-SalI双酶切鉴定结果图。

图8.pMC-hNTCP 及ZY781-CMV-hNTCP NdeI单酶切结果图。

图9.基因转染小鼠PCR鉴定结果图。

图10. 基因转染小鼠肝组织hNTCP免疫组化鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。

pcDNA6-hNTCP质粒是由北京生命科学研究所李文辉研究员惠赠，其结构图如图1所示；E.coli ZYCY10P3S2T和ZY781空载体由中科院深圳先进技术研究院陈志英教授惠赠，ZY781空载体结构图如图2所示。本发明构建表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的流程图如图5所示。

实施例1

采用PCR技术从pcDNA6-hNTCP中获取人NTCP基因真核表达框并引入BglII- SalI双酶切位点，然后将其插入质粒zy781的attB和attP位点间，经阿拉伯糖诱导重组酶ФC31作用后得到携带人NTCP真核表达框的微环DNA（pMC-CMV-hNTCP）。

S1.人NTCP基因真核表达框的获得：以pcDNA6-hNTCP质粒（质粒序列如SEQ ID NO：1所示）为模版，设计扩增人NTCP基因真核表达框的正向（带BglII酶切位点）和反向引物（带SalI酶切位点）：

正向引物F：5’- GAAGATCTCCCGATCCCCTAT -3’

反向引物 R：5’- ACGCGTCGACCCATAGAGCCCACC -3’

PCR反应体系及反应程序如下：

反应条件：

PCR反应结束后，回收PCR产物，获得2260bp的CMV-hNTCP-BGHpolyA基因片段，CMV-hNTCP-BGHpolyA基因片段经BglII（NEB）和SalI（NEB）双酶切获得CMV-hNTCP-BGHpolyA（2248bp），即hNTCP基因真核表达框。PCR结果琼脂糖凝胶电泳鉴定如图6所示。

S2.将人NTCP基因真核表达框插入质粒ZY781的attB和attP位点间，得到携带人NTCP基因序列的微环亲本质粒ZY781-CMV-NTCP，其序列如SEQ ID NO：2所示，将微环亲本质粒ZY781-CMV-NTCP转化入E.coli ZYCY10P3S2T感受态中，经阿拉伯糖诱导重组酶ФC31作用后得到携带人NTCP真核表达框的微环DNA。具体步骤为：

酶切所用酶：hNTCP基因真核表达框和ZY781空载体均用BglII（NEB）和SalI（NEB）进行双酶切。

酶切反应体系及条件：反应温度37℃，酶切15h。酶切反应体系如下：

酶切产物纯化方法：切胶回收，采用胶回收试剂盒（TaKaRa, DV805A）纯化。

酶切产物连接：采用连接试剂盒（NEB，M2200S），连接体系如下：

BglII-SalI双酶切的PCR产物(50ug/μl)     1.4μl；

BglII-SalI双酶切的ZY781(30ug/μl)       1.67μl；

ddH₂O                                          6.93μl ；

2x quick ligation buffer                  10μl；

Quick T4连接酶                        1μl。

按以上连接体系配置好溶液后，彻底混匀后在25℃反应5min， 冰上冷却后，用于转化或于-20℃保存。

成功连接的产物即为ZY781-CMV-hNTCP质粒，即微环亲本质粒；ZY781-CMV-hNTCP质粒的质粒图谱图如图3所示。是否连接成功通过下一步的转化及卡那霉素抗性筛选可初步确定，后续通过酶切鉴定进一步确认。

转化：采用氯化钙法制备E.coli ZYCY10P3S2T感受态细胞，将构建的ZY781-CMV-hNTCP质粒转入E.coli ZYCY10P3S2T感受态中，通过亲本质粒携带的卡那霉素抗性初步筛选得到阳性克隆，提取质粒，BglII-SalI双酶切电泳鉴定。电泳鉴定结果如图7。（外源基因2248bp，载体4066bp）

S3.携带人NTCP真核表达框的微环DNApMC-CMV-hNTCP的制备。 阿拉伯糖诱导重组酶ФC31作用后得到携带人NTCP真核表达框的微环DNA。具体步骤如下：微环亲本质粒转化感受态后，筛选阳性克隆，阳性克隆接种到TB培养液中，37℃， 250 rpm/min，培养12～18h至OD₆₀₀值约为4～5时得微环诱导用母液，即可进行诱导携带人NTCP基因真核表达框的微环质粒的产生。携带人NTCP基因真核表达框的微环质粒的产生步骤为：将300 μl微环诱导用母液接种入50 ml 的含卡那霉素( 50μg /ml) 的TB 培养液中， 37℃、250 rpm/min培养18h后，向培养液中再加入相同体积的诱导液（50 ml 的LB 以及2 ml 1N 的NaOH 溶液和300 μl 20% L-阿拉伯糖），32℃，250 rpm/min 培养5 h，收菌，采用去毒素质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.? Endotoxin Free Plasmid Isolation System，D6915）提取携带人NTCP基因真核表达框的微环质粒DNA（pMC-hNTCP），其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。经NdeI单酶切鉴定。（亲本质粒切出4411bp，1903bp两条带，微环切出2315bp一条带）电泳鉴定结果如图8所示。hNTCP基因微环真核表达载体pMC-hNTCP的图谱如图4所示。

本发明所述的微环产生条件是发明人经过大量的探索试验总结得到的，只有在上述条件下，才能制备得到大量的重组微环载体，而且载体的纯度很高，没有杂载体如亲本质粒的污染。如果改变条件的话，不是载体数量得不到保证，就是载体的纯度无法保证，只有上述条件才能同时满足。

实施例3

    本发明同时也使用本领域常规的真核表达载体来介导人NTCP基因制备动物模型，例如将真核重组表达载体pcDNA6-hNTCP也通过水动力转染技术导入ICR小鼠体内来制备表达人NTCP基因的小鼠模型。但是结果发现：用常规的真核表达载体来介导人NTCP基因时，制备的小鼠模型不能持续表达人NTCP基因，不能满足动物模型的质量需求。而采用本发明中提及的质粒ZY781和工程菌E.coli ZYCY10P3S2T来制备携带人NTCP的微环真核表达载体，优化诱导微环产生条件，最终一步得到携带人NTCP的微环真核表达载体，减少步骤，免去提取过程，节省成本。

实施例4 以携带人NTCP基因真核表达框的微环pMC-hNTCP制备表达人NTCP的小鼠模型。

    1、水动力转染技术制备人NTCP基因转染小鼠：选取6～8周的ICR小鼠，体重26～28g。分为三组：实验组，对照组，空白对照组。实验组将携带人NTCP真核表达框的微环DNA 15μg溶于2.5ml生理盐水中，对照组将pcDNA615μg溶于2.5ml生理盐水中，空白对照组为2.5ml生理盐水，均经小鼠尾静脉在5-8s内注射入小鼠体内。

    2、PCR筛选鉴定基因转染小鼠：分别于第1、14天，每组取2只小鼠取肝组织，分别提取肝组织DNA进行PCR检测。

正向引物F：5’- CCTGGTGGCACAGTATGG -3’

反向引物 R：5’- TTTGGATTTGAGGACGAT -3’

PCR反应体系及反应程序如下：

 反应条件：

将上述PCR产物进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，结果如附图9所示，阳性为一条346bp的特异条带，表明hNTCP基因基因成功转入小鼠体内。

3. 免疫组化鉴定基因转染小鼠：于第14天，每组取2只小鼠取肝组织，置10%甲醛固定12～14h，按常规方法制作组织切片，免疫组化检测肝组织中hNTCP的表达，结果见图10。 (Anti-SLC10A1 antibody 抗体1：200稀释，Sigma， HPA042727)。

                         SEQUENCE LISTING

 <110>  中国人民解放军第四五八医院

 <120>  一种表达乙肝病毒受体——人NTCP的小鼠模型的构建方法

 <130> 

 <160>  3    

 <170>  PatentIn version 3.3

 

 <210>  1

<211>  6074

<212>  DNA

<213>  pcDNA6-hNTCP质粒序列

 

 <400>  1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     60

 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120

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 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg   2580

 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct   2640

 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa   2700

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 ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg   5760

 ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg   5820

 cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag   5880

 gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac   5940

 tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca   6000

 tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag   6060

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 <210>  2

<211>  6314

<212>  DNA

<213>  zy781-cmv-hntcp微环亲本质粒序列

 <400>  2

acattaccct gttatcccta gatgacatta ccctgttatc ccagatgaca ttaccctgtt     60

atccctagat gacattaccc tgttatccct agatgacatt taccctgtta tccctagatg    120

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 tatccctaga tgacattacc ctgttatccc agataaactc aatgatgatg atgatgatgg    720

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 <210>  3

<211>  2315

<212>  DNA

<213>  pMC- hNTCP微环真核表达载体序列

 <400>  3

cccaactggg gtaacctttg ggctccccgg gcgcgactag tgaattcaga tctcccgatc     60

 ccctatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc    120

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 gcacagccac cgagacctcc caggtggcgc ccgcttagac cggtcatcat caccatcacc   2040

 attgagttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg   2100

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