Y-27632抑制剂在CD44阳性肠干细胞分选中的应用

摘要

本发明涉及Y-27632抑制剂在CD44阳性肠干细胞分选中的应用，其是以CD44作为标记分选肠干细胞。通过使用Y-27632抑制剂并结合使用磁珠分选CD44阳性细胞，从而使分离肠干细胞的方法更加便捷，操作更简单。本发明应用膜抗原对隐窝内的肠干细胞进行分选，不伤害细胞结构，而且，采用本发明的分离方法一次可获得充足数量的肠干细胞，为后续应用的开展奠定了物质基础。

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种Y-27632抑制剂在 CD44阳性肠干细胞分选中的应用。

背景技术

近年来，Lgr5(GPCR49)蛋白在肠隐窝中的高表达被广泛接受为识别肠干细 胞的标记。2009年，日本的Sato等学者从亲代C57/B6J^{Lgr5-IRES-CRE-eGEFP}小鼠肠道 中分离出高表达Lgr5蛋白的细胞，并建立了一套完善的体外诱导分化体系。他 们证实，小鼠肠隐窝基地部高表达Lgr5蛋白的细胞能够在体外独立增殖并分化 为一个完整的微小肠上皮结构。

目前，国际上应用于分离肠干细胞的主要技术为流式细胞分选技术。但目 前国内学者在此领域内的研究较为罕见。不过，因大肠癌起源于肠干细胞的基 因突变，国内学者对大肠癌干细胞分选进行了相应的研究。例如，贾茹等对10 例大肠癌新鲜标本的原发癌组织和转移癌组织中肿瘤干细胞(cancer stem cell， CSC)的含量进行检测并分选。她们应用流式抗体CD133-PE标记大肠癌原发癌 组织和转移癌组织细胞悬液，应用流式细胞仪检测出CD133阳性的CSC细胞含 量。不过，她们认为然用流式细胞分选技术对细胞的损伤比较大，分选周期长， 成本高，操作复杂(参见贾茹等，大肠原发癌和转移癌组织中肿瘤干细胞的检 测与分选，临床与实验病理学杂志，第9期，2014年9月16日)。

在现有的研究中，也有部分研究人员发现采用磁珠分选技术也能实现对大 肠癌干细胞的分选。例如，张鹏等利用单克隆CD抗原一抗与肿瘤细胞悬液孵育 后，再用免疫磁珠标记的第二抗体结合。利用一抗、二抗特异性结合的特点， 当阳性细胞悬液流过分选磁场时，可吸附在磁式分选柱内。再将磁式分选柱移 开磁场从柱内洗脱，收集大肠癌干细胞(参见张鹏等，大肠癌干细胞分选与鉴 定的研究进展，世界华人消化杂志，第16卷第36期，2008年12月28日)。然 而，该磁珠分选技术有赖于对大肠癌干细胞表面标志物的识别，迄今仍未找到 大肠癌干细胞的特异性表面标志物，因而分选目的细胞时仍存在一定的困难。

目前已有研究发现肠干细胞具有“空巢凋亡”的特性，需要在培养体系中 加入Y-27632抑制剂来抑制这种现象的发生。Y-27632抑制剂的化学分子式为 C14H21N3O.2HCl，为ROCK凋亡信号通路的抑制剂，这一抑制剂能够抑制肠 干细胞的“空巢凋亡”。

然而，在分选的过程中，不可能在鞘液中加入足量的Y-27632抑制剂来抑 制肠干细胞的空巢凋亡，这是Lgr5阳性肠干细胞分选的主要技术局限性。另外， 由于C57/B6J^{Lgr5-IRES-CRE-eGEFP}小鼠CRE基因的表达需要他莫昔芬来诱导，而且经 他莫昔芬诱导后10％的Lgr5肠干细胞即立即凋亡，这会造成分选干细胞数量有 所减少；其次，相对于近交系野生型小鼠而言，C57/B6J^{Lgr5-IRES-CRE-eGEFP}转基因 小鼠价格昂贵且饲养条件苛刻；第三，目前市面在售的Lgr5单克隆抗体的结合 位点仅在细胞内，通过抗体标记等方法势必需要对细胞进行破膜，破膜后势必 会影响细胞的活性。因此，应用Lgr5这一靶蛋白来分选肠干细胞受到以上多种 技术条件的限制。

如何寻找一种成本低廉、便于操作、简单、快速的肠干细胞分选方法已成 为目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种分选CD44阳性肠干细胞的方法，特别是Y-27632抑制剂 在CD44阳性肠干细胞分选中的应用，其具有成本低廉、便于操作、简单并且快 速的特点。

为达此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了Y-27632抑制剂在CD44阳性肠干细胞分选中的应 用，所述应用包括采用含有Y-27632抑制剂的培养基。

本发明中的应用中所用到的培养基主要有基础培养基、解离培养基等等， 通常是在解离培养基中含有上述的Y-27632抑制剂。

本发明中所使用的Y-27632抑制剂并没有特别的限定，例如可以是来自美 国Sigma-Aldrich公司的Y-27632抑制剂。

本发明通过采用Y-27632抑制剂添加到CD44阳性肠干细胞分选所用的培养 基时，却可以实现抑制肠干细胞在分选过程中出现“空巢凋亡”，从而大大提高 目的细胞的成活率。

本发明所述应用包括使用磁珠进行CD44阳性肠干细胞的分离。

优选地，所述CD44阳性肠干细胞是从肠隐窝中分离获得的。

相较于流式分选来说，磁珠分选方法省时，操作简便；细胞污染几率低， 成本低廉，产物纯度高。

Lgr5的表达受Wnt/β-catenin信号通路的调控，而该通路是引起肠干细胞增 殖的主要动力。近年来研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的另一调控靶点为CD44 基因。由于肠干细胞具有高增殖的活性，那么CD44基因的表达产物CD44蛋白 会存在于肠干细胞的表面。利用这一特点，本发明采用磁珠分选技术对野生近 交系小鼠肠隐窝CD44阳性细胞进行了分选。之后，采用相关的肠干细胞培养体 系进行培养。我们发现，CD44阳性细胞中存在一群肠干细胞。因此，CD44抗 原是肠干细胞的表面标记之一。应用这一标记技术，它避免了分选过程中对细 胞进行破膜，不伤害细胞活性；另外，这种标记技术方便用于野生近交系小鼠 肠干细胞的分选。更重要的是，由于磁珠分选的体系小(细胞悬液容纳量：1～2 ml)，它容许在分选过程中加入足量的Y-27632抑制剂来抑制肠干细胞的“空巢 凋亡”。因此，本发明通过应用磁珠技术及Y-27632抑制剂对CD44阳性肠干细 胞进行分选，克服了现有技术中所存在的诸多问题。

本发明可以单独采用添加Y-27632抑制剂到培养基中或者结合采用磁珠分 选的方式来进行，当采用两种方式组合时，其分离效果要更加突出。例如，在 不添加Y-27632抑制剂到培养基的组别，肠干细胞的集落形成率明显低于添加 Y-27632抑制剂的组别。

本发明是以CD44作为标记从肠道组织中分选肠干细胞。由于肠干细胞中 CD44基因的表达受到Wnt/β-catenin信号通路的调节，同时，CD44基因的表达 强弱在隐窝各个位置的细胞中有所不同，其在靠近隐窝基底部的细胞中表达强 烈，而远离基底的位置表达较弱。由于CD44作为一种膜抗原在肠干细胞中具有 较高的表达水平，因而本发明通过CD44这一分子标记作为分选肠干细胞的靶点， 以进行小鼠肠干细胞的分离。

本发明中，所述方法包括从近交系小鼠的肠道中分选CD44+细胞。本发明 之所以采用近交系小鼠，是由于相对于转基因小鼠，近交系小鼠价格低廉，容 易获得，且遗传背景稳定。优选地，所述近交系小鼠为C57BJ/6小鼠。

本发明中所述应用主要包括以下步骤：

(1)从肠道组织中分离隐窝；

(2)制备隐窝单细胞悬液；

(3)分选隐窝CD44阳性肠干细胞。

具体的，本发明所述应用中的步骤(1)包括以下步骤：

a)无菌条件下，将肠道组织剖开，除去肠内容物，并去除上皮中的绒毛成 分；

b)将步骤a)得到的肠组织置于离心管中，反复冲洗至上清澄清，加入分 离液，孵育20-40min；

c)待肠组织沉降至离心管底，吸出分离液，离心，弃上清；

d)加入预冷的D-hanks液，重悬细胞并剧烈摇动使隐窝从肠组织中释放出 来，显微镜下观察直至上清液中充满丰富的隐窝；

e)将上清液吸出，过滤，滤液收集至BSA包被的离心管中离心，弃掉上清；

f)用基础培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至离心管中，离心，弃掉上清， 重复2-3次，从而去除细胞悬液中的单个细胞以纯化隐窝。

优选地，步骤b)所述分离液为含2mM EDTA的D-hanks溶液，pH值为8.0。

优选地，步骤f)所述基础培养基为含有1×Glutamax(例如美国Invitrogen 公司)、1×HEPES(例如美国Invitrogen公司)和l×青链霉素(例如美国Invitrogen 公司)的Advanced DMEM/F12无血清培养基(例如美国Invitrogen公司)。

作为优选的技术方案，本发明中所述步骤(1)具体包括以下步骤：

a)无菌条件下，从肠道组织中分离整段小肠，将其沿纵轴剖开，采用预冷 的D-hanks液冲去肠内容物；

b)灭菌的盖玻片轻刮肠腔面，以去除上皮中的绒毛成分；

c)将步骤b)得到的肠组织用无菌剪刀剪至3mm大小碎片后置于50mL离 心管中，用预冷D-hanks液反复冲洗至上清澄清；

d)加入分离液，4℃摇床震荡孵育30min；

e)孵育结束后，待组织沉降至离心管底，小心吸出分离液，1000rpm离心 5min，弃掉上清；

f)加入30mL预冷的D-hanks液，重悬细胞并剧烈摇动使隐窝从肠组织中 释放出来，显微镜下观察直至上清液中充满丰富的隐窝；

g)将上清液吸出，用70μm滤网过滤，将滤液收集至BSA包被的离心管中， 1000rpm离心5min，弃掉上清；

h)用l0mL基础培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管中，500rpm 离心2min，弃掉上清，重复2-3次，从而去除细胞悬液中的单个细胞以纯化隐 窝。

具体的，本发明所述应用中的步骤(2)包括以下步骤：

a)将步骤(1)分离的隐窝置于解离培养基中，孵育30-45min，每10min 反复吹打细胞悬液5-10次，以促进单个细胞从隐窝中释放出来；

b)孵育完毕后，过滤悬液，收集滤液并离心，弃掉上清，得到隐窝单细胞 悬液；

优选地，所述解离培养基为含有1×Glutamax(例如美国Invitrogen公司)、 1×HEPES(例如美国Invitrogen公司)、1×青链霉素(例如美国Invitrogen公司)、 1×N2supplement(例如美国Invitrogen公司)、1×B27supplement(例如美国 Invitrogen公司)和10μM Y-27632抑制剂(例如美国Sigma-Aldrich公司)的 Advanced DMEM/F12无血清培养基(例如美国Invitrogen公司)。

作为优选技术方案，本发明中所述步骤(2)具体包括以下步骤：

a)将步骤(1)分离的隐窝置于5mL预冷的解离培养基中，4℃摇床孵育 45分钟，每10分钟反复吹打细胞悬液5-10次，以促进单个细胞从隐窝中释放 出来；

b)孵育完毕后，依次用40μm滤网、20μm滤网过滤悬液，收集滤液并1000rpm 离心5分钟，弃掉上清。

具体的，本发明所述分离方法中的步骤(3)包括以下步骤：

a)向步骤(2)的解离培养基中加入CD44单克隆抗体，孵育25-30min， 离心，洗去残留抗体，重复此步骤一次；

b)再次向解离培养基中加入磁珠偶联抗体，孵育15-20min；

c)将己孵育完毕的细胞悬液上样到磁性分离柱，洗脱收集吸附于柱内的细 胞，即为CD44阳性肠干细胞；

优选地，所述解离培养基为含有1×Glutamax(例如美国Invitrogen公司)、 1×HEPES(例如美国Invitrogen公司)、1×青链霉素(例如美国Invitrogen公司)、 1×N2supplement(例如美国Invitrogen公司)、1×B27supplement(例如美国 Invitrogen公司)和10μM Y-27632抑制剂(例如美国Sigma-Aldrich公司)的 Advanced DMEM/F12无血清培养基(例如美国Invitrogen公司)。

作为优选技术方案，本发明中所述步骤(3)具体包括以下步骤：

a)吸取1-2mL预冷的解离培养基，以1:50(w/v)的比例向其中加入兔抗小鼠 CD44单克隆抗体，冰上孵育30分钟，1000rpm离心2分钟，洗去残留抗体， 重复此步骤一次；

b)再次吸取1-2mL预冷的解离培养基，以1:4(v/v)的比例向其中加入山羊 抗兔IgG磁珠偶联抗体，冰上避光孵育15分钟；

c)将己孵育完毕的细胞悬液上样到磁性分离柱，洗脱收集吸附于柱内的细 胞，即为CD44阳性肠干细胞。

本发明中分离得到的肠干细胞高表达Lgr5蛋白，并且能够分化为构成肠上 皮的四种类型细胞：潘氏细胞、吸收细胞、内分泌细胞及杯状细胞。

第二方面，本发明还提供了一种制备微小肠上皮结构的方法，其包括以下 步骤：

(1)通过第一方面所述的应用分离得到CD44阳性肠干细胞；

(2)体外增殖所述CD44阳性肠干细胞并分化为完整的微小肠上皮结构。

作为本发明优选的技术方案，所述制备微小肠上皮结构的方法中，步骤(2) 包括：

a)将预先置于冰上融化的基质胶以每100个肠干细胞加入10μL基质胶的 比例在冰上重悬细胞；

b)细胞预混完毕后，以10μL基质胶/孔的比例将基质胶和细胞悬液加入 37℃预热的96孔培养板；接种时，基质胶位于板底的中央，避免胶触壁；

c)将接种的细胞置于37℃孵育箱中孵育5min，使基质胶定型；

d)孵育完毕后，向每孔中加入100μL完全培养基，37℃、5％CO₂潮湿环 境中孵育2周，收集微小肠上皮结构。

优选地，所述基质胶为添加1mM Jagged-1(例如美国Ana Spec公司)的无 酚红无生长因子(Growth factor reduced)的半固体培养基；所述完全培养基为 含有1×Glutamax(例如美国Invitrogen公司)、1×HEPES(例如美国Invitrogen 公司)、l×青链霉素(例如美国Invitrogen公司)、1×N2supplement(例如美国 Invitrogen公司)、1×B27supplement(例如美国Invitrogen公司)、10μM Y-27632 抑制剂(例如美国Sigma-Aldrich公司)、lμg/mL human R-spondin(例如美国 PeproTech公司)、100ng/mL murine Noggin(例如美国PeproTech公司)、100ng/mL murine EGF(例如美国PeproTech公司)、100ng/ml Murine Wnt-3a(例如美国 PeproTech公司)及1mM N-Acetylcysteine(例如美国Sigma-Aldrich公司)的 Advanced DMEM/F12无血清培养基(例如美国Invitrogen公司)。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明采用向培养基中加入Y-27632抑制剂来抑制肠干细胞在分选过 程中的“空巢凋亡”，提高目的细胞的集落形成率约50％。

(2)本发明采用磁珠的分离方法操作相对传统肠干细胞分选方法更加便 捷。

(3)本发明应用膜抗原对隐窝内的肠干细胞进行分选，不伤害细胞结构； 而且，采用本发明的分离方法一次可获得充足数量的肠干细胞，为后续应用的 开展奠定了物质基础。

附图说明

图1是采用流式细胞术鉴定磁珠分选的CD44阳性细胞表型图；

图2是CD44阳性肠干细胞的体外发育图；其中，A是发育第0至9天的高 等倍数图像(400倍)；B是发育第10至14天的中等倍数图像(200倍)；C是 CD44阴性细胞发育第14天的低等倍数图像(40倍)；D是CD44阳性细胞发育 第14天的高等倍数图像(40倍)；

图3是CD44阳性肠干细胞的分化图；其中，DAPI是标记细胞核；Villin 是标记吸收细胞；Muc2是标记杯状细胞；Chr-A是标记肠内分泌细胞；Lysozyme C是标记潘氏细胞；Merge是融合图像；

图4是流式细胞分选技术与磁珠分别联合Y-27632抑制剂分选技术对CD44 阳性细胞活性的影响；其中，左图是磁珠联合Y-27632抑制剂分选技术；右图 是流式细胞分选技术；

图5是磁珠分选过程中有无添加Y-27632抑制剂时CD44阳性细胞的集落形 成率；其中，左图是不添加Y-27632抑制剂组；右图是添加Y-27632抑制剂组。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为 对本发明的具体限制。

试剂配制

1.分离液：含2mM EDTA的D-hanks溶液(pH 8.0)。

2.基础培养基：Advanced DMEM/F12无血清培养基(美国Invitrogen公司)， 其中含有1×Glutamax(美国Invitrogen公司)、1×HEPES(美国Invitrogen公司)、 1×青链霉素(美国Invitrogen公司)。

3.解离培养基：Advanced DMEM/F12无血清培养基(美国Invitrogen公司)， 其中含有1×Glutamax(美国Invitrogen公司)、1×HEPES(美国Invitrogen公司)、1× 青链霉素(美国Invitrogen公司)、1×N2supplement(美国Invitrogen公司)、1×B27  supplement(美国Invitrogen公司)、10μMY-27632(美国Sigma-Aldrich公司)。

4.基质胶：美国BD公司生产的无生长因子(Growth factor reduced)且无酚 红的半固体培养基，需单独添加1mM Jagged-1(美国Ana Spec公司)。

5.完全培养基：Advanced DMEM/F12无血清培养基(美国Invitrogen公司)， 其中含有1×Glutamax(美国Invitrogen公司)、1×HEPES(美国Invitrogen公司)、1× 青链霉素(美国Invitrogen公司)、1×N2supplement(美国Invitrogen公司)、1×B27  supplement(美国Invitrogen公司)、10μM Y-27632(美国Sigma-Aldrich公司)、 1μg/mL human R-spondin(美国PeproTech公司)、100ng/ml murine Noggin(美国 PeproTech公司)、100ng/mL murine EGF(美国PeproTech公司)、100ng/mL Murine  Wnt-3a(美国PeproTech公司)及1mM N-Acetylcysteine(美国Sigma-Aldrich公司)。

6.一抗：兔抗小鼠CD44单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

7.二抗：山羊抗兔IgG磁珠偶联抗体(德国Miltenyi公司)。

实施例1C57BL/6小鼠CD44阳性细胞的分离及表型鉴定

1.无菌条件下，获取他人试验所用的健康对照组刚处死的C57BL/6小鼠(中 国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)整段小肠，将其沿纵轴剖开，预 冷的D-hanks液冲去肠内容物。

2.灭菌的盖玻片轻刮肠腔面，以去除上皮中的绒毛成分。

3.将肠组织用无菌剪刀剪至3mm大小碎片后置于50mL离心管中，用预冷 D-hanks液反复冲洗至上清澄清。

4.加入分离液，4℃摇床震荡孵育30分钟。

5.孵育结束后，待组织沉降至离心管底，小心吸出分离液；1000转/分钟， 离心5分钟，弃掉上清。

6.加入30mL预冷的D-hanks液，重悬细胞并剧烈摇动使隐窝从肠组织中释 放出来，显微镜下观察直至上清液中充满丰富的隐窝。

7.将上清液吸出，用70μm滤网过滤，将滤液收集至BSA包被的离心管中， 1000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清。

8. 10mL基础培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管中，500转/ 分钟，离心2分钟，弃掉上清；重复此步骤2-3次，目的在于去除细胞悬液中的 单个细胞以纯化隐窝。

9.将分离的隐窝置于5mL预冷的解离培养基中，4℃摇床孵育45分钟，每 10分钟反复吹打细胞悬液5-10次，以促进单个细胞从隐窝中释放出来。

10.孵育完毕后，依次用40μm滤网、20μm滤网先后过滤悬液，收集滤液并 以1000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清。

11.吸取1-2mL预冷的解离培养基，向其中加入兔抗小鼠CD44单克隆抗体， 比例为1:50(w/v)；冰上孵育30分钟后，1000转/分钟，离心2分钟，洗去残留 抗体，重复此步骤一次。

12.再次吸取1-2mL预冷的解离培养基，向其中加入山羊抗兔的磁珠二抗， 比例为:1:4(v/v)；冰上避光孵育15分钟。

13.将步骤12中己孵育完毕的细胞悬液直接过磁性分离柱(美天旎，LD型) 收集分离柱内细胞(阳性分选)，解离培养基洗脱柱内细胞，计数。

14.用流式细胞仪鉴定分选的CD44+细胞的表型，结果如图1所示。将磁珠 分选得到的CD44阳性细胞分别以单克隆抗小鼠CD24-FITC、CD31-PE、 CD34-PE、CD44-APC和CD45-APC抗体标记后进行流式分析；小鼠IgG2c-FITC、 IgG2a-PE和IgG2b-APC为同型对照。结果显示：CD44阳性细胞不表达CD31、 CD34和CD45，表明CD44阳性细胞内皮系及造血系来源；阳性表达CD24和 CD44，表明CD44阳性细胞受COX-2相关通路和Wnt信号通路调控，而该通 路是肠干细胞增殖的主要动力。

实施例2CD44阳性细胞的诱导培养

1.同实施例1中步骤1-13，磁珠分选C57BL/6小鼠CD44阳性细胞(阳性 选择)，以CD44阴性细胞(阴性选择)作为对照。

2.将预先置于冰上融化的基质胶以每100个分选细胞加入10μL基质胶的比 例重悬细胞，此步应在冰上操作，以防止温度升高导致基质胶凝固。

3.细胞预混完毕后，以10μL基质胶/孔的比例将基质胶-细胞悬液加入37℃ 预热的96孔培养板(100个分选细胞/10μl基质胶/孔)；接种时，基质胶应位于 板底的中央，避免胶触壁。

4.将接种的细胞置于37℃孵育箱中孵育5分钟，使基质胶定型；配制完全 培养基。

5.孵育完毕后，向每孔中加入100μL的完全培养基，37℃、5％CO₂潮湿环 境中进行培养。

6.培养后14日内，倒置显微镜下动态观察CD44阳性肠干细胞的发育。结 果发现在诱导培养后14日内，CD44阳性细胞组中部分细胞能够于体外不断扩 增并形成‘囊状’结构。相比之下，CD44阴性细胞则无‘囊状’结构形成。(如 图2所示)

实施例3CD44阳性细胞分化为肠上皮的4种类型细胞

1.体外培养2周后，弃去完全培养基；并向96孔板中加入预冷的中性甲醛 溶液(200μL/孔)固定CD44阳性细胞分化而来的“迷你肠”，4℃，30min。

2.以预冷的DPBS洗去中性甲醛固定液(2-3次)；并向96孔板中加入预先配 置的0.025％的Triton X-100溶液(200μL/孔)，4℃下孵育10min。

3.以预冷的DPBS溶液吹打Matrigel，使其溶解并释放出内部的“迷你肠”； 1000rpm，离心2min。

4.DPBS洗涤“迷你肠”沉淀2-3次后，转移至新的EP管中。

5.以含有5％BSA的PBS溶液1mL，4℃条件下孵育“迷你肠”沉淀30min。

6.加入预先配置好的一抗工作液体，包括：抗小鼠Villin、Muc-2、Chr-A和 Lysozyme C单克隆抗体(抗体量：抗体稀释液量＝1:250)；4℃，过夜孵育。

7.次日，以PBS溶液洗涤“迷你肠”沉淀2-3次。

8.将“迷你肠”转移至载玻片上，50μL含有DAPI的封片胶封片，镜下拍 照。结果如图3所示。其中，本发明的CD44阳性细胞分化为构成肠上皮的四 种类型细胞：吸收细胞(Villin阳性)、杯状细胞(Muc2阳性)、内分泌细胞(Chr-A 阳性)和潘氏细胞(Lysozyme C阳性)。

实施例4Y-27632抑制剂能够抑制CD44阳性细胞的凋亡

1.同实施例1的步骤，抗小鼠CD44单克隆抗体磁珠分选方法获取CD44阳 性细胞。

2.应用抗小鼠CD44-APC单克隆抗体标记C57BL/6小鼠肠上皮中CD44阳 性细胞(条件：抗体比例：1微克/106个细胞，冰上孵育15分钟)，进行CD44 阳性细胞的流式分选。

3.应用Annexin V/PI对磁珠分选的CD44阳性细胞和流式分选的CD44阳性 细胞进行标记，标记步骤参照美国Invitrogen公司Dead Cell Apoptosis Kit with  Annexin V Alexa Fluor 488&PI-for Flow Cytometry(Replaces PHN1008,PHN1010) 试剂盒(货号：V13241)。

4.流式细胞仪对细胞凋亡进行分析。结果如图4。结果发现，应用流式细胞 术分选的CD44阳性细胞细胞晚期凋亡(Annexin V/PI双阳性)的数量较经磁珠 联合Y-27632分选的CD44阳性细胞晚期凋亡数量明显增多(增高幅度约为 20％)。

实施例5Y-27632抑制剂能够提高CD44阳性细胞的克隆形成力

1.同实施例1的步骤，抗小鼠CD44单克隆抗体磁珠分选方法获取CD44阳 性细胞。以不添加Y-27632抑制剂的分选组别作为对照。

2.同实施例2的步骤，对两组CD44阳性细胞进行14天的体外诱导培养。

3.倒置显微镜下动态观察CD44阳性细胞的发育，比较诱导培养后第14日， 各组CD44阳性细胞的集落形成率。结果发现，磁珠分选过程中联合应用10μΜ  Y-27632抑制剂的CD44阳性细胞集落形成率约为12％；这一数值较不添加 Y-27632抑制剂的CD44阳性细胞形成率(约6％)提高50％。

通过实施例1-5可以看出，CD44阳性细胞中存在肠干细胞；并且磁珠分选 方法联合Y-27632抑制剂能够提高目的细胞的成活率和集落形成率，具有重要 的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方 法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须 依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了， 对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体 方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。