CD44和MSI1对仿刺参肠干细胞的标记及Wnt6和β-catenin在肠再生过程中的作用

摘要

仿刺参（Apostichopus japonicus），属于棘皮动物门，海参纲，刺参科，仿刺参属，是一种重要的海洋经济棘皮动物。仿刺参在遇到敌害或不利的环境条件（高盐度胁迫，不存在氧等）时，发生吐脏现象;当恢复到适宜环境时，即可再生新的器官。
　　本文采用组织学、免疫组织化学、免疫荧光、Western blot等方法对仿刺参肠再生过程中的肠干细胞进行了标记，肠再生过程中一些胚胎发育相关蛋白的表达等。
　　免疫荧光双标实验结果显示在肠再生过程中CD44蛋白在整个肠再生组织中均有表达; MSI1蛋白在整个肠再生组织中也有表达，即可证明这两种蛋白可以作为干细胞标记物用作仿剌参肠干细胞的鉴定。
　　组织学结果显示仿刺参肠再生第3天，肠系膜边缘增厚。再生第6天，肠系膜的进一步增厚，形成原基。再生第9天，新生肠道进一步发育，开始形成肠管并开始形成皱褶。再生第12天，肠系膜增厚成消化道的肠壁，再生的新肠管基本形成。再生第15天，消化道逐渐具备基础功能，结构重新建立，肠上皮层由之前的多层的立型细胞慢慢分化成单层的柱状型，肌肉层开始形成。再生第18天，消化道具备了消化功能，肌肉层形成纵肌层和内肌层。再生第21天，消化道几乎达到正常水平。
　　免疫组化结果证明在肠再生的过程中和成体仿刺参中，β-catenin都有表达。再生的第3-6天，β-catenin主要表达在肠系膜边缘。再生第9天，β-catenin在肠壁和肠管上表达比较多。再生第12天，β-catenin表达最多，主要集中在再生的肠管上。再生第15-18天，β-catenin随着再生表达越来越少，肌肉层中几乎不表达。再生第21天，β-catenin的表达部位几乎与成体仿刺参相同。
　　免疫荧光标记实验结果显示在肠再生过程中Wnt6蛋白在整个肠再生以及成体肠组织中均有表达。首先Wnt6蛋白在正常的肠组织中均有表达。在仿刺参肠再生的过程中，Wnt6蛋白的表达量开始先增高，然后表达量随着再生的进行逐渐下降。在再生的第9-12天，其表达量与正常状态相比最高。第15-21天，Wnt6蛋白表达量逐渐降低，成体仿刺参的Wnt6表达量最低。
　　Western blot检测结果显示，Wnt6蛋白在肠再生过程中表达量先递增后递减，在再生第9天表达量最高。β-catenin蛋白在仿刺参肠再生过程中表达量也是先递增后递减，但与Wnt6蛋白有一定的时间差，在肠再生第12天表达量最高，再生第21天是已经接近一般水平。
　　实验结果显示，CD44蛋白和MSI1蛋白进一步被证明可以作为肠干细胞标记物用于对肠干细胞的鉴定;吐肠后，肠干细胞可能来源于肠系膜边缘;通过包卷的方式形成新的肠道;Wnt信号通路在肠再生过程中起着重要的调控作用，其中通路中的Wnt6蛋白和β-catenin蛋白在肠再生组织中皆有表达，相继调控肠组织再生的发生。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 仿刺参的生物学

1．1．1 仿剌参的分类地位、形态特征

1．1．2 仿刺参的生活习性

1．1．3 仿剌参的经济价值

1．2 仿刺参肠再生

1．2．1 再生

1．2．2 仿刺参肠再生

1．2．3 再生组织的细胞来源

1．3 Wnt／β-catenin信号通路

1．3．1 Wnt／β-catenin信号通路

1．3．2 Wnt6

1．3．3 β-catenin

1．4 肠干细胞标记物

1．4．1 CD44

1．4．2 Musashi-1

1．5 本实验的目的及研究意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 石蜡切片制备所需试剂

2．1．3 HE染色所需试剂

2．1．4 免疫组织学染色所需试剂

2．1．5 免疫荧光所需试剂

2．1．6 免疫印迹相关试剂

2．1．3 仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 实验器材的处理

2．2．2 石蜡切片制备

2．2．3 HE染色

2．2．4 β-eatenin免疫组织学染色

2．2．5 Wnt6免疫荧光标记

2．2．6 CD44、MSI1免疫荧光双标

2．2．7 仿剌参总蛋白提取

2．2．8 CD44、MSI1在仿剌参肠再生各时期的表达

2．2．9 Wnt6、β-catenin在仿刺参肠再生各时期的表达

3 结果

3．1 组织学分析

3．1．1 解剖学

3．1．2 组织学

3．2 β-catenin免疫组织学染色

3．3 免疫荧光分析

3．3．1 Wnt6免疫荧光标记

3．3．2 CD44、MSI1免疫荧光双标

3．4 Wnt6、β-catenin在仿刺参肠再生各时期的表达

4 讨论

4．1 CD44、MSI1在仿刺参肠再生过程中干细胞的标记

4．2 Wnt6、β-catenin蛋白在仿刺参肠再生的作用

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢