一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方法，包括：步骤1：将产毒多杀性巴氏杆菌菌液制备；步骤2：灭活菌液备用；步骤3：产毒多杀性巴氏杆菌毒素液制备；步骤4：将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2%胎牛血清MEM培养基将细胞悬液稀释，向多孔实验孔板中每孔加100μl MEM培养基；将菌毒素液，按照等倍稀释的方法加入孔中；每孔再加入100μl Vero细胞悬液，混匀后置36~38℃，CO

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素 甲醛灭活效果的方法。

背景技术

产毒多杀性巴氏杆菌(Toxigenic pasteurellamultocida，T⁺Pm)是猪传染性萎缩性鼻炎 (Atrophicrhinitis，AR)的主要病原菌。猪萎缩性鼻炎能造成猪只鼻甲骨萎缩，破坏了鼻粘膜免 疫屏障，进而继发其他呼吸道疾病，造成养猪业的重大经济损失。研究表明产毒多杀性巴氏 杆菌可引起进行性萎缩性鼻炎，其中以产毒多杀性巴氏杆菌毒素为主要的致病因子。多杀性 巴氏杆菌按荚膜分为A、B、D、E、F等6个血清型，有报道表明，T⁺Pm以D型产毒为主, 也有A型产毒，而T⁺Pm主要分离于AR严重的猪。

目前防治猪萎缩性鼻炎主要是通过疫苗免疫，在猪萎缩性鼻炎灭活疫苗生产过程中， 产毒多杀性巴氏杆菌主要是采用甲醛溶液灭活，菌株灭活效果的好坏直接影响到疫苗的安全 性和免疫效果。目前，检测产毒多杀性巴氏杆菌菌液灭活效果，主要检测菌株是否能灭活， 而忽略产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否灭活。据文献报道产毒多杀性巴氏杆菌毒素检验是通过 豚鼠皮肤坏死试验检测，所以有人采用皮肤坏死试验来测定产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否灭 活。由于菌株培养时间不同、豚鼠个体差异及人员操作误差可引起假阴性，同时豚鼠皮肤坏 死试验是用灭活后的菌液，菌体占的比例较小，无法合理反应出菌体内产毒多杀性巴氏杆菌 毒素是否灭活。目前，可通过超声裂解的方式获得粗提产毒多杀性巴氏杆菌毒素，少量的粗 提产毒多杀性巴氏杆菌毒素就可对Vero单层细胞产生典型的病变。产毒多杀性巴氏杆菌毒素 的毒力强，对小鼠的LD₅₀仅为0.2ug。

发明内容

本发明的目的在于：采用Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素 甲醛灭活效果，该方法能较传统的通过豚鼠皮肤坏死检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活 效果方法更加灵敏，能直接反应出毒素的灭活效果，从而降低产毒多杀性巴氏杆菌制备的疫 苗副反应，提高疫苗的安全性。

本发明的技术方案：一种用Vero细胞检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素甲醛灭活效果的方 法，包括：步骤1：将产毒多杀性巴氏杆菌接种于脑心浸液培养基，置于36～38℃恒温振荡培 养箱，以200r/min培养12～18小时，收获菌液；

步骤2：将甲醛溶液按照0.3％的终浓度(v/v)加入步骤1中制备好的菌液中，置36～38℃恒 温振荡培养箱，以200r/min作用48小时后，灭活菌液备用；

步骤3：取步骤2中制备好的灭活菌液在4℃条件下，以10000r/min离心30分钟，聚集菌体， 用与灭活菌液同体积的无菌PBS漂洗4次后，用灭活菌液1/5体积的无菌PBS悬浮，将灭活 菌悬液转移至离心管，将离心管置冰水混合物中放入超声波仪器内室，40％输出功率，每工 作4秒，间隔15秒，超声破碎30分钟；在4℃条件下，以10000r/min离心30分钟收集上清 菌毒素液，上清菌毒素液经0.22滤膜过滤，无菌检验合格后，备用；

步骤4：将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2％胎牛血清MEM培养基将细胞悬液 稀释至2×10⁵个/ml，向多孔实验孔板中每孔加100μl MEM培养基；将步骤3制备好的上 清菌毒素液，按照等倍稀释的方法依次加入实验孔板的孔中；然后，每孔再加入100μl稀释 好的Vero细胞悬液，混匀后置36～38℃，CO₂培养箱培养七天后观察结果；细胞拉丝病变判 为阳性，细菌聚团判为可疑，无病变判为阴性。产毒多杀性巴氏杆菌包括A型产毒多杀性巴 氏杆菌和D型产毒多杀性巴氏杆菌。

本发明的有益效果：利用本方法能更准确的检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素是否完全 灭活或者最大限度的灭活，从而很好的保证了相关疫苗的安全。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图1为粗提产毒多杀性巴氏杆菌毒素液致Vero细胞病理变化；

附图2为不同甲醛浓度，灭活不同时间灭活菌液制备疫苗免疫试验猪鼻甲骨病理变化。

具体实施方式

菌液的制备：将产毒多杀性巴氏杆菌接种于脑心浸液培养基，置于36～38℃恒温振荡培 养箱，以200r/min培养12～18小时，收获菌液。

菌液的灭活：将甲醛按照0.2％、0.25％和0.3％的终浓度(v/v)分别加入产毒多杀性 巴氏杆菌菌液，置36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min分别作用36、48和60小时。每个 时间点取10ml灭活菌液备用。

豚鼠皮肤坏死检测每个浓度、每个时间段取0.1ml菌液，背部皮内注射豚鼠，注射 后观察72小时，并测量注射点皮肤坏死区的大小。坏死区域直径不低于0.5cm判为阳性，小 于0.5cm判为可疑，无反应判为阴性。

Vero细胞病变检测

菌毒素液的制备：每个浓度、每个时间段取5ml灭活菌液在4℃条件下，以10000r/min离心 30分钟聚集菌体，用与灭活菌液同体积的无菌PBS漂洗4次后，用菌液1/5体积的无菌PBS 悬浮，将菌悬液转移至50ml离心管，将离心管置冰水混合物中放入超声波仪器内室，40％输 出功率，每工作4秒，间隔15秒，超声破碎30分钟。在4℃条件下，以10000r/min离心30 分钟收集上清菌毒素液，上清菌毒素液经滤膜过滤，无菌检验合格后，备用。

菌毒素液致Vero细胞病变试验

Vero细胞悬液的制备：将培养好的单层Vero细胞消化计数后，用含2％胎牛血清MEM培养 基将细胞悬液稀释至2×10⁵个/ml；

菌毒素液致Vero细胞病变测定向96孔板中每孔加100μl MEM培养基。第H行为阴 性对照行，第A～G行为样品行。第A～G样品行，第一排加100μl制备的菌毒素液样品，按 照等倍稀释的方法从第一排稀释到第十二排。每个样品，做两个重复。每孔加100μl稀释好 的细胞悬液，混匀后置36～38℃，CO2培养箱培养七天后观察结果。细胞拉丝病变判为阳性， 细菌聚团判为可疑，无病变判为阴性。

小白鼠致死试验将每个浓度、每个时间段取得菌液及菌毒素液、未灭活菌液和脑心 浸液培养基分别取0.2ml腹腔注射小白鼠，观察七日，记录小鼠死亡情况。

疫苗安全性检测试验选0.2％甲醛灭活60小时菌液和0.3％甲醛灭活48小时菌液分别 与铝胶佐剂按比例混合制备成单价疫苗。用3～4周龄健康易感猪9头，3头耳后颈部肌肉注 射0.2％甲醛灭活60小时菌液制备的单价疫苗，3头耳后颈部肌肉注射0.3％甲醛灭活48小时 菌液制备的单价疫苗，另3头不注射作为对照，在同等条件下隔离饲养，14日后以相同途 径与相同剂量进行二免。

临床症状的观察疫苗一免、二免后连续14日定点测定试验猪体温，观察注射部位是 否红肿及有无其他不良反应

试验猪鼻甲骨病理变化二免后14日，将所有试验猪剖检，观察鼻甲骨有无萎缩、鼻中隔有 无变形。

结果：豚鼠皮肤坏死试验和Vero细胞病变试验结果见表1和图1。

表1不同甲醛灭活浓度、不同灭活时间豚鼠皮肤坏死试验和Vero细胞病变试验结果

注：A代表豚鼠皮肤坏死试验。B代表Vero细胞病变试验。+代表试验结果阳性，±代 表试验结果可疑，－代表试验结果阴性。

根据表1可知，通过豚鼠皮肤坏死试验来判断产毒多杀性巴氏杆菌毒素灭活的最佳条 件为，甲醛灭活浓度0.2％，灭活48～60小时；而通过Vero细胞病变试验来判断产毒多杀性 巴氏杆菌毒素灭活的最佳条件为，甲醛灭活浓度0.3％，灭活36～48小时。

小白鼠致死试验结果见表2。

表2不同甲醛灭活浓度、不同灭活时间小鼠致死试验结果

根据表2可知，在甲醛浓度为0.3％时，灭活48小时，菌液和菌毒素液对小鼠的致死均为0％。

疫苗安全性检测试验

临床症状的观察 疫苗免疫仔猪后0.3％甲醛灭活48小时菌液单价疫苗免疫组和对照组试验 猪体温正常，精神状态良好，未见不良反应，注射部位未见红肿、瘙痒及局部按压痛等症状。 0.2％甲醛灭活60小时菌液单价疫苗免疫组，免疫后体温正常，注射部位未见红肿、瘙痒及局 部按压痛等症状，一免后第20日试验猪均出现打喷嚏等临床症状。

试验猪鼻甲骨病理变化 疫苗免疫仔猪后0.3％甲醛灭活48小时菌液单价疫苗免疫组 和对照组试验猪鼻甲骨均正常，0.2％甲醛灭活60小时菌液单价疫苗免疫组鼻甲骨出现萎缩， 见图2。

结论：1、当豚鼠皮肤坏死试验结果为阴性、Vero细胞病变试验为阳性时，仍可引起 60％～80％的小鼠死亡。当豚鼠皮肤坏死试验和Vero细胞病变试验均为阴性时，小鼠均健活。 该结果说明，当豚鼠皮肤坏死试验结果为阴性时，产毒多杀性巴氏杆菌毒素仍未完全灭活， 可引起小鼠死亡，但Vero细胞病变试验为阴性时，证明巴氏杆菌毒素完全灭活。

2、当豚鼠皮肤坏死试验结果为阴性、Vero细胞病变试验为阳性时，制备的疫苗免疫试 验猪，可引起试验猪出现喷嚏等临床症状和鼻甲骨萎缩。当豚鼠皮肤坏死试验和Vero细胞病 变试验均为阴性时，制备的疫苗免疫试验猪，试验猪无临床症状，鼻甲骨正常。

因此，采用Vero细胞病变试验来检测产毒多杀性巴氏杆菌毒素灭活效果，更准确。