特异性兴奋星型胶质细胞的组合物及其在改善精神分裂症异样行为中的应用

摘要

本发明提供了一种特异性兴奋星型胶质细胞的组合物及其在改善精神分裂症异样行为中的应用，所述组合物包括：用于感染大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞的携带光感基因的病毒载体；该载体中包括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为GFAP启动子；能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的星型胶质细胞进行光照调控以使其兴奋。本发明组合物可以精确地特异性兴奋大脑基底外侧杏仁核的星型胶质细胞，可以有效改善精神分裂症异样行为。

说明书

技术领域

本发明是关于一种特异性兴奋星型胶质细胞的组合物及其在改善精神分裂症异样行为中的应用。

背景技术

精神分裂症等众多精神系统疾病一直是威胁人类健康、困扰人类正常生活的主要疾病，根据中国十二个地区精神病流行病学调查显示，目前全国约有重度精神性疾病患者1600万，如果加上中度和轻度患者，总数可高达6700万。精神疾病在我国疾病总负担中排名第一，占到了20％，而预计到2020年，这个数字还将继续上升到25％。因此，多年以来，全球众多的神经科学家一直在尝试许多新的治疗靶点和方法，却仍然对其彻底治愈一筹莫展。因此对该类疾病的病因及新治疗靶点研究和相关药物开发迫在眉睫。

星型胶质细胞(astrocytes)是中枢神经系统的主要细胞类型。越来越多的研究证实，星型胶质细胞在静息和活动状态下对神经网络的调控作用是不同的。最新的研究逐渐证实星型胶质细胞参与调控大脑的认知活动及相关情绪活动。

传统意义上控制精神病的发病主要依靠药物治疗和家庭社会的支持。近年来兴起的深部脑核团刺激(Deep Brain Stimulation，DBS)即针对大脑的某一个脑区进行电刺激，目前临床上也取得一定的疗效，但是迄今为止DBS治疗或改善精神分裂症异常行为的细胞机制并不明确。无论是传统意义上的药物治疗或是DBS干预治疗，都因缺乏细胞特异性，无法实现真正意义上的靶向干预，只是“治标”而已。目前，精神分裂症治疗效果不显著，预后差，无法有针对性地改善精神分裂症异样行为。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种特异性调控靶细胞进而有效改善精神分裂症异常行为的技术。

本发明利用光遗传调控技术，特异性地调控精神分裂症动物基底外侧杏仁核携带 光敏通道蛋白的星型胶质细胞，同时监测行为学的改变，发现星型胶质细胞受特异性地兴奋后，能显著改善其先天恐惧弱化的异常行为，从而认为基底外侧杏仁核的星型胶质细胞很可能是干预精神分裂症异样行为的新靶点。

从而，一方面，本发明提供一种特异性兴奋星型胶质细胞的组合物，该组合物包括：

用于感染大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞的携带光感基因的病毒载体，该载体中包括启动子、光感基因、绿色荧光标记基因，其中，所述启动子为GFAP启动子；

能产生蓝光的光照装置，用于对感染后的星型胶质细胞进行光照调控以使其兴奋。

本发明中将携带光敏基因的慢病毒载体注入到大脑基底外侧杏仁核区，其将会感染星型胶质细胞，在星型胶质细胞内表达相应的光敏受体，通过光照系统对表达了光敏受体的星型胶质细胞进行光刺激，从而使其兴奋，星型胶质细胞受光兴奋后，其释放的神经因子将作为调控介质，发挥改善精神分裂症异样行为的功能。本发明通过旷场实验以及高架迷宫实验证明通过本发明的组合物刺激星型胶质细胞兴奋后，能够明显的改善精神分裂症异样行为，例如先天性恐惧弱化和/或焦虑。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性兴奋星型胶质细胞的组合物也可以称为一种“套组”或“套件”，其中包括了本发明中特异性兴奋星型胶质细胞所采用的各试剂、材料及仪器设备等组件，作为一种产品例如试剂盒的形式，各组件可按照预定的位置在大包装中分别放置或是独立包装后成套销售及使用。

根据本发明的具体实施方案，本发明中所述的特异性兴奋星型胶质细胞的组合物还包括：使所述携带光感基因的病毒载体感染大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞的试剂材料。具体例如可包括：立体定位仪及相关进样系统，能够准确的将携带光敏基因的病毒载体注入到大脑基底外侧杏仁核区，从而使其感染大脑基底外侧杏仁核的星型胶质细胞。

在本发明的一具体实施方案中，构建了用于感染大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞的携带光感基因的病毒载体；该载体中的启动子为GFAP启动子；光感基因为ChR2；绿色荧光标记基因为eYFP；所述病毒为慢病毒；具体的构建过程可以参照所属领域中的现有技术进行。

根据本发明的具体实施方式，其中所述的携带光敏基因的病毒载体为含带有 GFAP质粒的慢病毒载体。大脑基底外侧杏仁核的星型胶质细胞感染含带有GFAP质粒的慢病毒载体后，启动子GFAP启动携带光敏基因开始转录，GFAP启动子仅在星型胶质细胞内能够启动携带光敏基因开始转录，在星型胶质细胞内表达相应的光敏受体，在受到光刺激后从而特异性只使星型胶质细胞兴奋，起到改善精神分裂症异样行为的作用。根据本发明的具体实施方式，本发明中所述的改善精神分裂症异样行为的组合物中，其中，所述的携带光敏基因的慢病毒载体为含带有GFAP-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体，其结构如图1A所示。在本发明的一具体实施例中，所述的GFAP-ChR2-eYFP可采用如下方法构建，将含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的质粒和与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74、pMD2.G.一起，利用脂质体一起转染至293FT细胞，培养后破膜得到含带有GFAP-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体。

根据本发明的具体实施方式，本发明所述的特异性兴奋星型胶质细胞的组合物中，其中，所述蓝光为波长460～480nm的蓝光，优选为波长470nm的蓝光。

另一方面，本发明提供特异性兴奋星型胶质细胞的组合物在制备用于改善精神分裂症异样行为系统中的应用。例如特异性兴奋星型胶质细胞的组合物为本发明所述组合物，所述的应用为本发明的组合物在制备用于改善精神分裂症引起的先天恐惧弱化和/或焦虑系统中的应用。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述的改善精神分裂症异样行为系统是利用所述组合物中携带光感基因的病毒载体感染大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞，并通过光照装置对感染后的星型胶质细胞进行蓝光光照刺激，以改善精神分裂症异样行为。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述蓝光光照条件为：蓝光波长470nm～480nm，光强1.1～2mW，光照频率10～20Hz、占空比为1:1的光，持续5min以上。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的应用中，其中，所述系统还包括用于将蓝光传导至感染后的大脑基底外侧杏仁核星型胶质细胞的光纤，在本发明的一具体实施例中，采用200μm的光纤将光照装置产生的光引入大脑基底外侧杏仁核，对感染后的星型胶质细胞进行光调控。

另一方面，本发明还提供一种改善精神分裂症异样行为系统，该系统包括本发明 所述的组合物。例如，所述的精神分裂症异样行为是先天恐惧弱化和/或焦虑。

本发明的有益技术效果：本发明的技术可以精确地特异性兴奋大脑基底外侧杏仁核的星型胶质细胞，可以有效改善精神分裂症异样行为，较传统的DBS或药物治疗，真正实现了特异性，具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中GFAP-ChR2-eYFP质粒示意图以及感染含带有该质粒的慢病毒的小鼠的脑片电生理实验结果图。

图2为本发明实施例1中小鼠大脑基底外侧杏仁核的胶质细胞成功表达GFAP-ChR2-eYFP的示意图。

图3为由他莫西芬诱导DISC1转基因小鼠表型后与对照小鼠旷场实验的结果图。

图4为光刺激DISC1：：Astro型小鼠与野生型小鼠的高架迷宫实验的结果图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所属领域的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，或可按照现有技术的记载制备得到。

实施例1

(1)、携带GFAP-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体的制备。

制备用于在动物活体感染星型胶质细胞的慢病毒载体，其携带有GFAP-ChR2-eYFP质粒：将含有光敏基因、绿色荧光标记基因及用于特定性标记胶质细胞的启动子GFAP的质粒(0.5μg)(该融合质粒结构如图1中A所示)，和与慢病毒包装相关的混合质粒pCMVΔR8.74、pMD2.G.(1.5μg)一起，利用脂质体(Invitrogen公司产品)一起转染至293FT细胞(ATCC公司产品，该细胞传代至25代后即需要更换新的一批细胞株)中(每200,000个细胞用6μL脂质体)，具体转染操作利用磷酸钙哺乳动物转染试剂盒(Promega，E1200)按照其说明书描述进行。24 小时后，培养293FT细胞的培养液换成无血清含有5mM丙酮酸钠的DMEM后继续孵育。16小时后，利用超速离心机在50,000g速度下破膜，将悬液通过20％的蔗糖滤柱，收集上清。该病毒滴度能达3×10⁸TU/mL以上，产出的病毒颗粒以灭菌的磷酸盐缓冲液以1：1000的体积比进行重悬。将获取的病毒重悬液按1：400的体积比混入无血清DMEM中，用于感染目标细胞星型胶质细胞。

(2)、将携带GFAP-ChR2-eYFP质粒的慢病毒载体注入调控区使其感染星型胶质细胞。

采用神经科学领域常规的立体定位技术以及微量进样系统将上述制备得到的携带光敏基因的慢病毒注入到小鼠的基底外侧杏仁核，注入量一般为0.4μL，注入后，等待3周，取1～3只小鼠脑组织，对其进行脑片电位实验，其结果如图1中B～G所示，证实了在光刺激(470nm的蓝光刺激，光强1.1mW，光照频率10Hz，占空比为1:1，持续5min)下，有对应的光电流产生，证明光敏感通道蛋白在胶质细胞上功能性表达成功，光刺激特异性提高了星型胶质细胞兴奋性；并对小鼠脑组织进行免疫组织荧光染色鉴定，鉴定结果显示有绿色荧光，表明GFAP-ChR2-eYFP在原位表达成功(图2)，即可开展光调控下的患精神分裂症的小鼠行为学检测，其中患精神分裂症的小鼠为采用他莫昔芬(tamoxifen)诱导DISC1突变蛋白表达的转基因小鼠(DISC1+tamo)。

(3)、光调控下的患精神分裂症的小鼠行为学检测。

在上述GFAP-ChR2-eYFP原位表达成功的患精神分裂症的小鼠的大脑基底外侧杏仁核垂直插入市售直径为200μm光纤，进行470nm的蓝光刺激，光强为1.1mW，光照频率为10Hz，占空比为1:1，持续5min后，对患精神分裂症的小鼠(DISC1+tamo)进行旷场实验，并以野生型小鼠、给予与他莫西芬相同量的溶剂(vehicle)的DISC1转基因小鼠(DISC1+veh)以及野生型小鼠(野生型+veh)作为对照，其结果如图3所示；对患精神分裂症的小鼠进行高架十字迷宫实验，并以野生型小鼠作为对照，其结果如图4所示，图4中DISC1：：Astro即表示患精神分裂症的杏仁核的胶质细胞转染了ChR2并表达了光敏感通道蛋白的DISC1转基因小鼠，图中ON表示打开光刺激，所示的光刺激的方式如上所述，OFF表示关闭光刺激。

其中，所述的旷场实验(Open field test)又称敞箱实验。在一个50×50cm的有机玻璃盒中进行，该盒底部被人为地划分为中间区域(25×25cm)和外周区域。是 评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，旷场实验视频分析系统也可观察由此而产生的焦虑心理。

所述的高架十字迷宫(High plus maze)是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。而抗焦虑药物能明显增加进入开臂的次数与时间，十字迷宫距离地面较高，相当于人站在峭壁上，使实验对象产生恐惧和不安心理。本实施例的迷宫离地高60cm，开放臂为25×5cm(长×宽)，闭合臂25×5×14.3cm(长×宽×高)。

从图3可以看出，旷场实验表明DISC1在药物诱导表型后其先天恐惧行为发生异变，表现为对中间空旷区域的回避行为减少，呆在其中的时间增多。

从图4可以看出高架十字迷宫实验表明，在调控前OFF状态下，患精神分裂症DISC1小鼠(DISC1：：Astro)对开放臂的先天恐惧低于野生型小鼠，所以在开放臂的时间大于野生型。但是，在ON状态下，光遗传技术特异性调控患精神分裂症DISC1小鼠(DISC1：：Astro)对比野生型对照组，其进入开放臂的时间就没有显著差异，提示调控起效，光特异性干预基底外侧杏仁核的星型胶质细胞可有效改善精神分裂症动物的先天恐惧弱化异常行为。